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文檔簡(jiǎn)介
生物競(jìng)賽輔導(dǎo)資料重組DNA技術(shù)第1頁(yè)/共27頁(yè)重組DNA技術(shù)的重大突破帶動(dòng)了現(xiàn)代生物技術(shù)的興起,并很快產(chǎn)生了許多生命科學(xué)的高技術(shù)產(chǎn)業(yè)。重組DNA技術(shù),又稱為基因或分子克隆技術(shù),是基因工程的核心技術(shù)。該技術(shù)包括了一系列的分子生物學(xué)操作步驟。所謂基因工程(geneticengineering)就是有意識(shí)地把一個(gè)生物體中有用的目的基因轉(zhuǎn)入另一個(gè)生物體中,使后者獲得新的遺傳性狀或表達(dá)所需要的產(chǎn)物。11.1重組DNA技術(shù)是基因工程的核心技術(shù)第2頁(yè)/共27頁(yè)重組DNA操作一般步驟:(1)獲得目的基因;(2)與克隆載體連接,形成新的重組DNA分子;(3)用重組DNA分子轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞,并能在受體細(xì)胞中復(fù)制和遺傳;(4)對(duì)轉(zhuǎn)化子篩選和鑒定;(5)對(duì)獲得外源基因的細(xì)胞或生物體通過(guò)培養(yǎng),獲得所需的遺傳性狀或表達(dá)出所需要的產(chǎn)物。第3頁(yè)/共27頁(yè)獲得需要的目的基因常用的方法:(1)直接從生物體中提取總DNA,構(gòu)建基因文庫(kù)(genelibrary),從中調(diào)用目的基因;(2)以mRNA為模板,反轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)的DNA片段;(3)利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)特異性地?cái)U(kuò)增所需要的目的基因片段,等等。11.2獲得需要的目的基因(外源基因)第4頁(yè)/共27頁(yè)
細(xì)胞內(nèi)總DNA的提取分離與基因文庫(kù)的構(gòu)建
細(xì)胞內(nèi)總DNA的提取分離程序第5頁(yè)/共27頁(yè)
紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA溶液的純度和濃度。第6頁(yè)/共27頁(yè)
基因文庫(kù)的構(gòu)建將總DNA包含的基因組各片段分別克隆在質(zhì)?;蚴删w載體上,便構(gòu)成了該生物的基因文庫(kù)。第7頁(yè)/共27頁(yè)
反轉(zhuǎn)錄人工合成互補(bǔ)DNA構(gòu)建基因文庫(kù)獲取目的基因存在的問(wèn)題——
費(fèi)時(shí)費(fèi)事 內(nèi)含子序列反轉(zhuǎn)錄人工合成互補(bǔ)DNA方法的優(yōu)勢(shì)——獲取的DNA片段往往是具有特定功能的目的基因第8頁(yè)/共27頁(yè)
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)PCR技術(shù)就是在體外中通過(guò)酶促反應(yīng)有選擇地大量擴(kuò)增(包括分離)一段目的基因的技術(shù)。加入4種物質(zhì):
(1)作為模板的DNA序列;
(2)與被分離的目的基因兩條鏈各自5’端序列相互補(bǔ)的DNA引物(20個(gè)左右堿基的短DNA單鏈);
(3)TaqDNA聚合酶;
(4)dNTP(dATP,dTTP,dGTP和dCTP)。第9頁(yè)/共27頁(yè)
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)變性、退火、延伸三步曲變性:雙鏈DNA解鏈成為單鏈DNA退火:部分引物與模板的單鏈DNA的特定互補(bǔ)部位相配對(duì)和結(jié)合延伸:以目的基因?yàn)槟0?,合成互補(bǔ)的新DNA鏈第10頁(yè)/共27頁(yè)
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)每一輪聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)可使目的基因片段增加一倍30輪循環(huán)可獲得——230(1.07×109)個(gè)基因片段第11頁(yè)/共27頁(yè)P(yáng)CR技術(shù)的發(fā)明PCR的發(fā)明是DNA操作技術(shù)的革命美國(guó)Mullis教授開(kāi)汽車時(shí)的聯(lián)想
逶迤崎嶇的山路——DNA雙螺旋行駛的汽車——一小段DNA引物
……
1988年發(fā)明了PCR技術(shù)
1993年獲得諾貝爾獎(jiǎng)第12頁(yè)/共27頁(yè)基因重組和克隆操作最重要的工具是限制性內(nèi)切酶、載體和宿主菌。微量的目的基因必須經(jīng)過(guò)基因克隆獲得大量的拷貝后,才能實(shí)現(xiàn)進(jìn)一步的重組、轉(zhuǎn)化和表達(dá)等操作。11.3構(gòu)建重組質(zhì)粒和基因克隆
限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶是從細(xì)菌中分離提純的核酸內(nèi)切酶,可以識(shí)別并切開(kāi)核酸序列特定位點(diǎn)——分子手術(shù)刀Arber、Smith和Nathans因?yàn)樵诎l(fā)現(xiàn)限制性內(nèi)切酶方面開(kāi)創(chuàng)性工作而共同獲得了1978年的諾貝爾獎(jiǎng)。第13頁(yè)/共27頁(yè)
限制性內(nèi)切酶已經(jīng)發(fā)現(xiàn)和鑒定了200多種EcoRI特異識(shí)別GAATTC及其互補(bǔ)堿基組成的雙鏈片段粘性末端T4連接酶第14頁(yè)/共27頁(yè)
載體載體是運(yùn)送目的基因片段進(jìn)入宿主細(xì)胞的工具,目前最常用的載體包括細(xì)菌質(zhì)粒、l噬菌體、cosmid質(zhì)粒等。質(zhì)粒是細(xì)菌細(xì)胞中自然存在于染色體外可以自主復(fù)制的一段環(huán)狀DNA分子。進(jìn)入到宿主細(xì)胞中的一個(gè)質(zhì)??梢源罅吭黾悠淇截悢?shù)。第15頁(yè)/共27頁(yè)1.該質(zhì)粒比較小,可以插入一段較長(zhǎng)的DNA片段。2.進(jìn)入宿主細(xì)菌細(xì)胞后,pUC18在每個(gè)細(xì)胞中可復(fù)制形成大約500個(gè)拷貝。3.在pUC18中有一小段人為設(shè)計(jì)和插入的具有多種限制性酶切位點(diǎn)的序列,即多克隆位點(diǎn)
細(xì)菌質(zhì)粒pUC18第16頁(yè)/共27頁(yè)
pUC118質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)整合在lacZ基因中,該位點(diǎn)如果沒(méi)有插入外源目的基因,lacZ基因便可表達(dá)出半乳糖苷酶,如果平板培養(yǎng)基中含有IPTG和X-gal,X-gal便會(huì)被半乳糖苷酶水解成蘭色,大腸桿菌形成藍(lán)色克隆。在多克隆位點(diǎn)插入外源目的基因,破壞了lacZ基因的結(jié)構(gòu),大腸桿菌形成白色的克隆4.利用lacZ基因的插入失活篩選重組質(zhì)粒5.pUC18還攜帶了氨卞青霉素抗性基因,可篩選重組質(zhì)粒。第17頁(yè)/共27頁(yè)
以大腸桿菌為宿主菌進(jìn)行基因的克隆將目的基因克隆到大腸桿菌細(xì)胞中的操作步驟:1.獲得目的基因和質(zhì)粒載體;2.形成重組質(zhì)粒;3.制備感受態(tài)細(xì)胞,用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞;4.培養(yǎng)大腸桿菌,讓重組質(zhì)粒及外源目的基因形成大量拷貝;5.篩選含重組質(zhì)粒的大腸桿菌細(xì)胞,進(jìn)行檢查或鑒定。第18頁(yè)/共27頁(yè)
一般克隆基因的檢查和鑒定方法瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定大小不等的酶解片段:磷酸基團(tuán)帶負(fù)電荷酶解片段向陽(yáng)極移動(dòng)電場(chǎng)驅(qū)動(dòng)力和凝膠阻力
——不同遷移率分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物
酶切和電泳方法第19頁(yè)/共27頁(yè)32P標(biāo)記的DNA分子探針雜交放射自顯影法DNA雜交直接鑒定第20頁(yè)/共27頁(yè)基因克隆獲得大量目的基因后,就要使其在合適的宿主細(xì)胞中表達(dá),產(chǎn)生需要的基因表達(dá)產(chǎn)物或使宿主生物具備所需的性狀,同時(shí)目的基因還能在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳。這一過(guò)程就是遺傳轉(zhuǎn)化。若需要讓克隆的基因表達(dá)和產(chǎn)生大量編碼蛋白,可對(duì)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌進(jìn)行培養(yǎng)使目的基因大量表達(dá)和積累。對(duì)表達(dá)產(chǎn)物分離純化便可獲得想要的產(chǎn)品。通過(guò)DNA體外重組技術(shù)構(gòu)建的重組質(zhì)粒還可以直接用以轉(zhuǎn)化藍(lán)藻等原核生物或其他一些原生生物11.4轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞和轉(zhuǎn)化子的篩選第21頁(yè)/共27頁(yè)構(gòu)建缺失chlL基因的藍(lán)細(xì)菌突變株第22頁(yè)/共27頁(yè)遺傳轉(zhuǎn)化常用的方法載體法轉(zhuǎn)化——農(nóng)桿菌介導(dǎo)法基因的直接轉(zhuǎn)移(1)高壓電脈沖電激穿孔(2)基因槍法(3)微注射法第23頁(yè)/共27頁(yè)紀(jì)念發(fā)明者EdwardSouthern(1)提取總DNA(2)酶解(3)電泳(4)轉(zhuǎn)移到濾膜(5)變性解鏈(6)DNA探針及雜交(7)洗脫(8)放射自顯影(9)比較分析11.5轉(zhuǎn)化子的分析——Southern雜交第24頁(yè)/共27頁(yè)Southern雜交分析示例
A.DNA體外重組實(shí)驗(yàn)
B.抗生素篩選轉(zhuǎn)化子細(xì)胞
C.培養(yǎng)突變株細(xì)胞
D.Southern雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,外源目的基因已經(jīng)轉(zhuǎn)入突變株細(xì)胞中1973年,由美國(guó)斯坦福大學(xué)教授Cohn和美國(guó)加州大學(xué)教授Boyer帶領(lǐng)各自的研究組幾乎同時(shí)分別完成了DNA體外重組,一舉打開(kāi)了基因工程學(xué)大門(mén)。第25頁(yè)/共27頁(yè)重組DNA技術(shù)的一般操作步驟有:(1)獲得目的基因;(2)構(gòu)建重組質(zhì)粒;(3)轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞;(4)篩選和鑒定轉(zhuǎn)化子;(5)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞獲得所需性狀或所需產(chǎn)物。
獲得目的基因的方法有:提取總DNA構(gòu)建基因文庫(kù)并從中調(diào)用;以mRNA為模板合成互補(bǔ)DNA片段;利用PCR特異性擴(kuò)增所需目的基因片段等。用紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA溶液的純度和濃度。
用限制性內(nèi)切酶識(shí)別并切開(kāi)核酸序列特定位點(diǎn),將外源基因插入到載體中,用重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞,外源基因?qū)㈦S宿主的繁殖而復(fù)制,這種過(guò)程稱為基因的克隆。
凝膠電泳是用于分離、純化和鑒定
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