生物選修血紅蛋白的提取和分離

生物選修血紅蛋白的提取和分離第1頁(yè)/共29頁(yè)

本課題學(xué)習(xí)目標(biāo)

簡(jiǎn)述蛋白質(zhì)提取和分離的基本原理，并了解凝膠色譜法、電泳法等分離生物大分子的基本原理。1、主要概念：①凝膠色譜法②電泳法③緩沖溶液④它們?cè)谘t蛋白的提取中分別起到什么作用。2.主要原理：①凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的原理②電泳法分離樣品的原理③緩沖溶液的組成和作用機(jī)理3、課題重點(diǎn)：凝膠色譜法的原理和方法

4、課題難點(diǎn)：①樣品的預(yù)處理②色譜柱填料的處理和色譜柱的裝填。第2頁(yè)/共29頁(yè)基礎(chǔ)知識(shí)（一）凝膠色譜法（分配色譜法）2.凝膠：

大多數(shù)凝膠是由多糖類化合物（如葡聚糖或瓊脂糖）構(gòu)成的多孔小球體，內(nèi)部有許多貫穿的通道。

根據(jù)被分離的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的大小，利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠的分子篩作用，來(lái)進(jìn)行分離。1.概念：3.凝膠色譜法的原理①當(dāng)相對(duì)分子量不同的蛋白質(zhì)通過(guò)凝膠時(shí)，相對(duì)分子量較小的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程較長(zhǎng)，移動(dòng)速度較慢;②而相對(duì)分子量較大的蛋白質(zhì)無(wú)法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在凝膠外部移動(dòng)，路程較短，移動(dòng)速度較快。相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子因此得以分離。③依據(jù)的特性是：蛋白質(zhì)分子量的大小。第3頁(yè)/共29頁(yè)4.凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的原理和具體過(guò)程第4頁(yè)/共29頁(yè)凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)過(guò)程的動(dòng)畫(huà)演示

第5頁(yè)/共29頁(yè)

（二）緩沖溶液

1.概念:

在一定的范圍內(nèi)，凡是能夠抵制外加少量強(qiáng)酸或強(qiáng)堿的影響使原來(lái)溶液PH值基本保持不變的混合溶液。

能夠抵制外界的酸和堿對(duì)溶液PH值的影響，維持PH基本不變。2.作用:3.緩沖溶液的配制:

通常由1－2種緩沖劑溶解于水中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑的使用比例就可以制得在不同PH范圍內(nèi)使用的緩沖液。

4.提問(wèn)：在本課題中使用的緩沖液是:__________,其目的是:

利用緩沖液模擬細(xì)胞內(nèi)的PH環(huán)境，保證血紅蛋白的正常結(jié)構(gòu)和功能，便于觀察(紅色)和科學(xué)研究(活性)磷酸緩沖液第6頁(yè)/共29頁(yè)

（三）電泳：1.概念：帶電粒子在電場(chǎng)作用下發(fā)生遷移的過(guò)程。2.原理：

①許多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解離的基團(tuán)，在一定的PH下，這些基團(tuán)會(huì)帶上正電或負(fù)電。②在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極移動(dòng)。③電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小，形狀的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。3.類型:瓊脂糖凝膠電泳、聚丙稀酰胺凝膠電泳。第7頁(yè)/共29頁(yè)血液血漿水分其他物質(zhì)：血漿蛋白、無(wú)機(jī)鹽、磷脂、葡萄糖等血細(xì)胞白細(xì)胞血小板紅細(xì)胞（最多）血紅蛋白（90％）兩個(gè)α－肽鏈兩個(gè)β一肽鏈四個(gè)亞鐵紅素基團(tuán)2.血液有哪些成分？1.用雞的紅細(xì)胞提取DNA，用哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞提取血紅蛋白的原因是什么？

雞的紅細(xì)胞具有細(xì)胞核，含有DNA，便于進(jìn)行DNA的提?。蝗说募t細(xì)胞無(wú)細(xì)胞核，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，血紅蛋白含量豐富，便于提取血紅蛋白。血紅蛋白第8頁(yè)/共29頁(yè)血紅蛋白兩個(gè)α－肽鏈兩個(gè)β一肽鏈四個(gè)亞鐵紅素基團(tuán)每個(gè)肽鏈環(huán)繞一個(gè)亞鐵血紅素基團(tuán)，此基團(tuán)可攜帶一分子氧或一分子二氧化碳，血紅蛋白因含有血紅素而呈紅色。血紅蛋白的特點(diǎn)：第9頁(yè)/共29頁(yè)

二、實(shí)驗(yàn)操作樣品處理→粗分離→純化→純度鑒定1.樣品處理：（一）蛋白質(zhì)提取和分離步驟（二）操作過(guò)程

本課題可選用豬、牛、羊或其他脊椎動(dòng)物的血液來(lái)分離血紅蛋白。(1)紅細(xì)胞的洗滌:①洗滌目的:

去除雜蛋白，以利于后續(xù)血紅蛋白的分離純化，洗滌次數(shù)不可過(guò)少。②洗滌操作：

1、采集血樣。2、低速短時(shí)間離心（速度越高和時(shí)間越長(zhǎng)，會(huì)使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等一同沉淀，達(dá)不到分離的效果）3、吸取血漿：上層透明的黃色血漿。4、鹽水洗滌：用五倍體積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9％的氯化鈉溶液洗滌。5、低速離心（低速短時(shí)間）6、重復(fù)4、5步驟三次，直至上清液中已沒(méi)有黃色，表明洗滌干凈。第10頁(yè)/共29頁(yè)初次離心后的結(jié)果第11頁(yè)/共29頁(yè)3次洗滌后的結(jié)果第12頁(yè)/共29頁(yè)(2)血紅蛋白的釋放：

加蒸餾水到原血液體積，再加40％體積的甲苯，置于磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢?0分鐘（加速細(xì)胞破裂）,細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。

二、實(shí)驗(yàn)操作第13頁(yè)/共29頁(yè)(3)分離血紅蛋白溶液：①過(guò)程：將攪拌好混合液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，以2000r/min的速度離心10min。②試管中溶液層次：第1層（最上層）：甲苯層（無(wú)色透明）；第2層（中上層）：脂溶性物質(zhì)沉淀層（白色薄層固體）；第3層（中下層）：血紅蛋白的水溶液層（紅色透明液體）；第4層（最下層）：雜質(zhì)沉淀層（暗紅色）。③分離：用濾紙過(guò)濾，除去脂溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。第14頁(yè)/共29頁(yè)(4)透析：

①過(guò)程：取1ml的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300ml的物質(zhì)的量濃度為20mmol/l的磷酸緩沖液中（pH為7.0），透析12小時(shí)。②透析目的：除去樣品中分子量較小的雜質(zhì)。

二、實(shí)驗(yàn)操作原理：透析袋能使小分子自由進(jìn)出，而大分子保留在袋內(nèi)。第15頁(yè)/共29頁(yè)透析過(guò)程動(dòng)畫(huà)演示第16頁(yè)/共29頁(yè)利用透析袋透析第17頁(yè)/共29頁(yè)凝膠色譜操作:（1）凝膠色譜柱的制作：

①取長(zhǎng)40厘米，內(nèi)徑1.6厘米的玻璃管，兩端需用砂紙磨平。②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安裝移液管頭部→覆蓋尼龍網(wǎng)，再用100目尼龍紗包好，插到玻璃管的一端。注意事項(xiàng)：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否則難以鋪實(shí)尼龍網(wǎng)，還會(huì)導(dǎo)致液體殘留，蛋白質(zhì)分離不徹底。③頂塞的制作：打孔→安裝玻璃管。④組裝：將上述三者按相應(yīng)位置組裝成一個(gè)整體。⑤安裝其他附屬結(jié)構(gòu)。第18頁(yè)/共29頁(yè)（2）凝膠色譜柱的裝填①凝膠的選擇：A、材料：交聯(lián)葡聚糖凝膠（G-75）。B、代表意義：“G”表示凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分離范圍。75表示凝膠的得水值，即每克凝膠膨脹時(shí)吸水7.5克。②凝膠的前處理：配置凝膠懸浮液：計(jì)算并稱取一定量的凝膠浸泡于蒸餾水或洗脫液中充分溶脹后，配成凝膠懸浮液。③凝膠色譜柱的裝填方法：A、固定：將色譜柱裝置固定在支架上。B、裝填：將凝膠懸浮液一次性的裝填入色譜柱內(nèi)，裝填時(shí)輕輕敲動(dòng)色譜柱，使凝膠填裝均勻。注意：1、凝膠裝填時(shí)盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙。2、裝填凝膠柱時(shí)不得有氣泡存在：因?yàn)闅馀輹?huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。第19頁(yè)/共29頁(yè)裝配好的凝膠柱第20頁(yè)/共29頁(yè)

④洗滌平衡：裝填完畢后，立即用緩沖液洗脫瓶，在50cm高的操作壓下，用300ml的20mmol/l的磷酸緩沖液（pH為7.0）充分洗滌平衡12小時(shí)。注意：1、液面不要低于凝膠表面，否則可能有氣泡混入，影響液體在柱內(nèi)的流動(dòng)與最終生物大分子物質(zhì)的分離效果。2、不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。（2）凝膠色譜柱的裝填50cm高第21頁(yè)/共29頁(yè)（3）樣品加入與洗脫

①調(diào)節(jié)緩沖液面：打開(kāi)下端出口，使柱內(nèi)緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊，關(guān)閉出口。

②滴加透析樣品：吸管吸1ml樣品加到色譜柱的頂端，滴加樣品時(shí)，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動(dòng)加樣，同時(shí)注意不要破壞凝膠面。

③樣品滲入凝膠床：加樣后打開(kāi)下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)，等樣品完全進(jìn)入凝膠層后，關(guān)閉下端出口。

④洗脫：小心加入pH=7.0的20mmol/l的磷酸緩沖液到適當(dāng)高度，連接緩沖液洗脫瓶，打開(kāi)下端出口進(jìn)行洗脫。⑤收集：待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時(shí)，用試管收集流出液，每5ml收集一試管，連續(xù)收集。（在分離過(guò)程中，如果紅色區(qū)帶均勻一致的移動(dòng)，說(shuō)明色譜柱制作成功）⑥注意：正確的加樣操作：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動(dòng)。第22頁(yè)/共29頁(yè)（3）樣品加入與洗脫注意：正確的加樣操作是：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動(dòng)。第23頁(yè)/共29頁(yè)收集得到的純化后的蛋白第24頁(yè)/共29頁(yè)思考下面的問(wèn)題：讓血紅蛋白處在穩(wěn)定的pH范圍內(nèi)，維持結(jié)構(gòu)和功能。

1、在血紅蛋白的整個(gè)過(guò)程中不斷用磷酸緩沖液處理的目的是什么？

2、與其他真核細(xì)胞相比，紅細(xì)胞有什么特點(diǎn)？這一特點(diǎn)對(duì)你進(jìn)行蛋白質(zhì)得分離有什么意義？

血紅蛋白是有色蛋白，因此在凝膠色譜分離時(shí)可以通過(guò)觀察顏色來(lái)判斷什么時(shí)候應(yīng)該收集洗脫液。這使血紅蛋白的分離過(guò)程非常直觀，大大簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作。3、你能描述血紅蛋白分離的完整過(guò)程嗎？

血紅蛋白提取和分離的程序可分為四大步，包括：樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。首先通過(guò)洗滌紅細(xì)胞、血紅蛋白的釋放、離心等操作收集到血紅蛋白溶液，即:樣品的處理；再經(jīng)過(guò)透析去除分子量較小的雜質(zhì)，即樣品的粗分離；然后通過(guò)凝膠色譜法將相對(duì)分子質(zhì)量較大的雜質(zhì)蛋白除去，即:樣品的純化；最后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行純度鑒定。第25頁(yè)/共29頁(yè)（三）SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定血紅蛋白純度。目的：第26頁(yè)/共29頁(yè)

觀察你處理的血液樣品離心后是否分層（見(jiàn)教科書(shū)圖5-18），如果分層不明顯，可能是洗滌次數(shù)少、未能除去血漿蛋白的原因。此外，離心速度過(guò)高和時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞一同沉淀，也得不到純凈的紅細(xì)胞，影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析與評(píng)價(jià)

1、你是否完成了對(duì)血液樣品的處理？你能描述處理后的樣品發(fā)生了哪些變化嗎？2、你裝填的凝膠色譜柱是否有氣泡產(chǎn)生？你的色譜柱裝填得成功嗎？你是如何判斷的？

由于凝膠是一種半透明的介質(zhì)，因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠是否裝填得均勻。此外，還可以加入大分子的有色物質(zhì)，例如藍(lán)色葡聚糖—2000或紅色葡聚糖，觀察色帶移動(dòng)的情況。如果色帶均勻、狹窄、平整，說(shuō)明凝膠色譜柱的性能良好。如果色譜柱出現(xiàn)紋路或是氣泡，輕輕敲打柱體以消除氣泡，消除不了時(shí)要重新裝柱。

第27頁(yè)/共29頁(yè)

如果凝膠色譜柱裝填得很成功、分離操作也正確的話，能清楚地看到血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整，隨著洗脫液緩慢流出；如果紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬，說(shuō)明分離的效果不