-組織學(xué)緒論課件

第1章組織學(xué)緒論IntroductionofHistology一、組織學(xué)的研究?jī)?nèi)容和意義組織學(xué)（histology）是研究機(jī)體微細(xì)結(jié)構(gòu)及其相關(guān)功能的科學(xué)。只有學(xué)好組織學(xué)，認(rèn)識(shí)人體的微細(xì)結(jié)構(gòu)及其相關(guān)功能，才能全面掌握人體的形態(tài)結(jié)構(gòu)，探索生命現(xiàn)象的物質(zhì)基礎(chǔ)。也只有認(rèn)識(shí)了人體的正常結(jié)構(gòu)，才能更好地分析和理解人體的生理過(guò)程和病理過(guò)程，才能學(xué)好生理學(xué)、病理學(xué)及其他醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)課程和臨床課程。二、組織學(xué)發(fā)展簡(jiǎn)史1．顯微鏡的發(fā)明和細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)；2．顯微鏡的改進(jìn)和細(xì)胞學(xué)說(shuō)的確立；3．組織概念的提出和組織學(xué)的建立諾貝爾獎(jiǎng)；4．現(xiàn)代組織學(xué)的發(fā)展。石蠟切片組織塊必須有一定的硬度方可切成薄片。首先用酒精和二甲苯將固定后的組織塊脫水(dehydration)和透明(clearing)，再用熔化的石蠟浸透、包埋(embedding)，制成有一定硬度的組織蠟塊，然后用切片機(jī)(microtome)將其切成5～10μm厚的組織切片(tissuesection)，貼于載玻片上(圖1-2)。上述方法稱石蠟切片(paraffinsectioning)，是組織學(xué)中的常規(guī)切片方法。HE染色組織學(xué)中最常用的染色方法是蘇木精（hematoxylin）和伊紅（eosin）染色法，簡(jiǎn)稱HE染色法（HEstaining）。蘇木精使細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中的核糖體等酸性物質(zhì)染成紫藍(lán)色，伊紅使細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)中的堿性成分染成淡紅色。與堿性染料親和力強(qiáng)、易被染色的特性稱嗜堿性（basophilia）；與酸性染料親和力強(qiáng)、易被染色的特性稱嗜酸性（acidophilia）；若與兩種染料的親和力都不強(qiáng)，則稱中性（neutrophilia）。（二）激光共聚焦掃描顯微鏡激光共聚焦掃描顯微鏡(confocallaserscanningmicroscope，CLSM)是一種高光敏度與高分辨率的生物學(xué)儀器，主要由激光光源、共聚焦成像掃描系統(tǒng)、光學(xué)系統(tǒng)和計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)4部分組成。CLSM光源產(chǎn)生激光束，并通過(guò)入射針孔的光闌作用入射到樣品各點(diǎn)上。另外，在發(fā)射光檢測(cè)光路上有一個(gè)檢測(cè)針孔，檢測(cè)針孔和入射針孔的位置相對(duì)于物鏡的焦平面是共軛的，即所謂“共聚焦”。經(jīng)樣品反射的光通過(guò)透鏡成像，被探測(cè)器接收，再經(jīng)過(guò)光電信號(hào)轉(zhuǎn)換在顯示屏上；圖像同時(shí)被傳送到計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)，進(jìn)行二維或三維的分析處理（圖1-3）。（三）電子顯微鏡術(shù)電鏡（ElectronMicroscopy）不同于光鏡之處是用電子束代替可見光，用電磁場(chǎng)代替玻璃透鏡。電鏡又分為透射電鏡術(shù)和掃描電鏡術(shù)。各種顯微鏡的分辨率與人眼的比較分辨率人眼0.2mm普通光鏡0.2μm透射電鏡0.1~0.2nm掃描電鏡2.5nm2．掃描電鏡術(shù)掃描電鏡術(shù)（Scanningelectronmicroscopy）用于觀察細(xì)胞、組織和器官表面的立體微細(xì)結(jié)構(gòu)。將小塊組織（直徑約0.3cm）經(jīng)固定和臨界點(diǎn)脫水干燥后，在其表面噴鍍薄層碳膜和金屬膜。掃描電鏡發(fā)射的細(xì)電子束在樣品表面按順序逐點(diǎn)移動(dòng)掃描，使樣品表面金屬膜發(fā)射出電子（稱二次電子），二次電子信號(hào)被探測(cè)器收集，經(jīng)過(guò)放大，在熒光屏上成像。掃描電鏡的景深長(zhǎng)，圖像清晰，富有立體感。（四）組織化學(xué)和細(xì)胞化學(xué)技術(shù)組織化學(xué)（histochemistry）和細(xì)胞化學(xué)（cytochemistry）技術(shù)是應(yīng)用化學(xué)反應(yīng)原理檢測(cè)組織和細(xì)胞的化學(xué)成分并進(jìn)行定位和定量的技術(shù)。組織細(xì)胞中的糖類、脂類、蛋白質(zhì)、核酸、酶等均可與相應(yīng)試劑反應(yīng)，最后形成有色反應(yīng)終產(chǎn)物或電子致密物，應(yīng)用光鏡或電鏡進(jìn)行觀察。糖類物質(zhì)常用過(guò)碘酸-Schiff反應(yīng)(PAS反應(yīng))顯示（圖1-4）。脂類常用蘇丹染料、油紅O、尼羅藍(lán)等脂溶性染料染色。免疫細(xì)胞化學(xué)的方法免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)主要有直接法和間接法（圖1-5）。直接法是標(biāo)記某抗原的特異性抗體（又稱第一抗體），用標(biāo)記的第一抗體孵育標(biāo)本以檢測(cè)其中的抗原成分。在間接法中，第一抗體不標(biāo)記；以第一抗體作為抗原免疫另一動(dòng)物，制備抗第一抗體的抗體，即第二抗體，并標(biāo)記第二抗體。染色時(shí)，先后以第一抗體和標(biāo)記的第二抗體處理標(biāo)本，在抗原存在部位形成抗原-第一抗體-標(biāo)記第二抗體復(fù)合物，以達(dá)到檢測(cè)該抗原的目的（圖1-6）。為了在一張組織切片上同時(shí)顯示兩種抗原物質(zhì)，以發(fā)現(xiàn)其定位、形態(tài)、甚至功能上的相互關(guān)系，可使用免疫細(xì)胞化學(xué)雙重染色（doublestaining）（圖1-7）。電鏡免疫細(xì)胞化學(xué)常用膠體金標(biāo)記技術(shù)（圖1-8）。（六）原位雜交原位雜交是一種在組織細(xì)胞原位進(jìn)行的核酸分子雜交技術(shù)，敏感度高，特異性強(qiáng)，是當(dāng)前分子生物學(xué)研究的重要手段。原位雜交的原理是兩條單核苷酸鏈通過(guò)堿基互補(bǔ)原則緊密結(jié)合，形成穩(wěn)定的雜交體。根據(jù)這一原理，用一條堿基序列已知、經(jīng)特定標(biāo)記的核苷酸鏈為探針，與組織切片、細(xì)胞制備或染色體標(biāo)本中的待檢DNA或mRNA片段進(jìn)行雜交，然后顯示標(biāo)記物，從而獲得待檢核酸的分布和含量等信息(圖1-9)。按照探針?lè)肿拥男再|(zhì)，可將其分為cDNA探針、cRNA探針和寡核苷酸探針。（七）放射自顯影術(shù)放射自顯影術(shù)(Autoradiography)可通過(guò)研究機(jī)體對(duì)放射性核素標(biāo)記物的攝取和代謝過(guò)程來(lái)檢測(cè)機(jī)體、細(xì)胞和組織的生物學(xué)特性及功能狀況。2.組織工程組織工程是用細(xì)胞培養(yǎng)術(shù)在體外模擬構(gòu)建組織或器官的技術(shù)，它是生物醫(yī)學(xué)和材料科學(xué)交叉融合的產(chǎn)物，也是目前生物醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。國(guó)內(nèi)、外學(xué)者應(yīng)用組織工程技術(shù)已開展了許多人造組織和器官的研制，如皮膚、軟骨、骨、肌腱、角膜、神經(jīng)、血管、氣管等，其中組織工程化皮膚和軟骨已獲得成功，并用于臨床（圖1-11）。組織工程的基本方法是：取少量組織，分離、培養(yǎng)細(xì)胞（稱種子細(xì)胞）；應(yīng)用人工合成的有機(jī)高分子聚合物（如聚羥基乙酸和聚乳酸）或天然的細(xì)胞外基質(zhì)成分（如膠原和纖維蛋白）制備有一定形狀和空間結(jié)構(gòu)的三維支架；將種子細(xì)胞種植到支架上，在體外培養(yǎng)或植入體內(nèi)；細(xì)胞生長(zhǎng)增殖，并分泌細(xì)胞外基質(zhì)，而支架材料逐漸降解吸收，從而形成有一定結(jié)構(gòu)和功能的組織或器官，用于組織修復(fù)。3．活體染色與活細(xì)胞染色活體染色與活細(xì)胞染色（VitalStainingandVitalCellStaining）活體染色是將無(wú)毒的染料注入動(dòng)物體內(nèi)，組織或細(xì)胞選擇性攝取染料后，通過(guò)顯微鏡觀察，研究其分布和功能等。如將墨汁注入動(dòng)物體內(nèi)，被巨噬細(xì)胞吞噬，從而觀察巨噬細(xì)胞的分布和吞噬活性。也可對(duì)分離的活細(xì)胞或體外培養(yǎng)的細(xì)胞直接進(jìn)行染色，稱體外活體染色。如取血液，與煌焦油藍(lán)染液混合，染色數(shù)分鐘后涂片鏡檢，可顯示網(wǎng)織紅細(xì)胞并進(jìn)行計(jì)數(shù)，以判斷骨髓的造血功能。4.活細(xì)胞與死細(xì)胞的鑒別有些染料不能進(jìn)入活細(xì)胞，但可進(jìn)入細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變的死細(xì)胞。如活細(xì)胞對(duì)臺(tái)盼藍(lán)拒染，而死細(xì)胞被染成藍(lán)色，常用此方法檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞的存活率。Hoechst33258和碘化丙啶是常用的熒光染料，均可與DNA結(jié)合。Hoechst33258可進(jìn)入活細(xì)胞和凋亡細(xì)胞，使細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光，活細(xì)胞的熒光均勻，凋亡細(xì)胞的熒光不均勻、增強(qiáng)或邊聚。碘化丙啶只能進(jìn)入死細(xì)胞，使其核呈紅色熒光。因此，用這兩種染料進(jìn)行體外活體染色，可區(qū)別活細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞（圖1-12）。2．流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞術(shù)（FlowCytometry）是近年建立的細(xì)胞定量和分類技術(shù)，可對(duì)細(xì)胞進(jìn)行生物化學(xué)和生物物理特性的快速定量測(cè)定。流式細(xì)胞儀由液流系統(tǒng)、激發(fā)光器件、信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)和控制系統(tǒng)、細(xì)胞分選系統(tǒng)等組成。其工作原理是分離被檢細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，并進(jìn)行熒光染色或標(biāo)記，然后使單細(xì)胞液流快速通過(guò)該儀器的激光照射分析區(qū)，被檢細(xì)胞產(chǎn)生不同的熒光信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娒}沖，分別輸入計(jì)算機(jī)內(nèi)貯存，并顯示于示波器屏幕上，即可獲得該細(xì)胞群體中不同類型細(xì)胞的有關(guān)數(shù)據(jù)。流式細(xì)胞術(shù)廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)、血液學(xué)、腫瘤學(xué)等的研究。（十）示蹤術(shù)示蹤術(shù)是用細(xì)胞標(biāo)記技術(shù)追蹤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)軌跡、細(xì)胞分化途徑和細(xì)胞來(lái)源的一種研究方法，是胚胎學(xué)研究中的常用技術(shù)方法，如對(duì)神經(jīng)嵴細(xì)胞的遷移和分化研究。常用尼羅藍(lán)、中性紅、辣根過(guò)氧化物酶、放射性同位素等作為示蹤標(biāo)記物。這些示蹤劑應(yīng)用方便、標(biāo)記明確、易于觀察，但會(huì)隨細(xì)胞的分裂增殖而逐漸衰減和消失，因而不能長(zhǎng)期追蹤。近年來(lái)，人們將含有某一報(bào)告基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒導(dǎo)入某種細(xì)胞，該基因的表達(dá)產(chǎn)物變成了這種細(xì)胞的示蹤標(biāo)記。這種自然標(biāo)記和轉(zhuǎn)基因標(biāo)記不會(huì)隨細(xì)胞增殖而衰減，可長(zhǎng)期示蹤。Thankyou顯微鏡下的藥物膠囊圖1-2石蠟包埋標(biāo)本切片機(jī)圖1-3激光共聚焦掃描顯微鏡成像原理示意圖圖1-6免疫細(xì)胞化學(xué)ABC法染色示大鼠腺垂體黃體生成素陽(yáng)性細(xì)胞高倍圖1-7熒光免疫細(xì)胞化學(xué)雙重染色高倍大鼠中腦含酪氨酸羥化酶（TH）的神經(jīng)元被FITC標(biāo)記，胞質(zhì)呈綠色（粗箭頭）；含鈣結(jié)合蛋白D28K（CB）的神經(jīng)元被得克薩斯紅標(biāo)記，胞質(zhì)和胞核呈紅色（細(xì)箭頭）；TH和CB都含的神經(jīng)元胞質(zhì)呈黃色，胞核呈紅色（雙箭頭）圖1-8電鏡免疫細(xì)胞化學(xué)染色

（膠體金標(biāo)記第二抗體法）箭頭示狒狒下丘腦酪氨酸羥化酶陽(yáng)性軸突內(nèi)的膠體金顆粒圖1-9原位雜交光鏡像高倍A．35S標(biāo)記前列腺特異抗原（PSA）cDNA探針，放射自顯影顯示人前列腺上皮內(nèi)PS