實(shí)驗(yàn)五植物基因組DNA提取課件

實(shí)驗(yàn)五

植物總DNA的提取

植物基因組DNA的提取瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)

與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起以核蛋白（DNP）的形式存在。在制備核酸時(shí)通常破壞細(xì)胞壁及細(xì)胞膜來(lái)使核蛋白釋放出來(lái)。植物總DNA包括細(xì)胞核DNA和細(xì)胞核外DNA,前者存在于細(xì)胞核內(nèi)，后者存在于細(xì)胞質(zhì)中有半自主性復(fù)制活性的細(xì)胞器內(nèi)，例如線粒體DNA(mtDNA)和葉綠體DNA(ctDNA)。核酸的存在形式細(xì)胞破碎抽提去蛋白質(zhì)沉淀核酸操作步驟①機(jī)械方法：超聲波處理法、研磨法、勻漿法；②化學(xué)試劑法：用SDS處理細(xì)胞；③酶解法：加入溶菌酶或蝸牛酶，破壞細(xì)胞壁。

細(xì)胞破碎

SDS法SDS是有效的陰離子去垢劑,

細(xì)胞中DNA與蛋白質(zhì)之間常借靜電引力或配位鍵結(jié)合,SDS能夠破壞這種價(jià)鍵。CTAB法CTAB是一種陽(yáng)離子去垢劑，它可以溶解膜與脂膜，使細(xì)胞中的DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物釋放出來(lái)，并使蛋白質(zhì)變性，使DNA與蛋白質(zhì)分離。DNA提取實(shí)驗(yàn)材料

新鮮蔬菜葉片(去葉脈)試劑

2×CTAB抽提液TE緩沖液(pH=8.0)

氯仿：異戊醇(24:1)

材料與試劑①離心機(jī)②水浴鍋③研缽④微量移液器儀器用具1．取2g清洗涼干的新鮮葉片于研缽中，加1/3藥匙石英砂和4mL2倍的CTAB提取液，迅速研磨。2．將1mL研磨液轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中，置于65℃水浴中保溫20min，其間顛倒混勻2－3次。破碎細(xì)胞3.12000r/min離心5min，取上清液700μL轉(zhuǎn)到另一離心管中。加入等體積氯仿：異戊醇（24:1）混合液，充分顛倒混勻。12000r/min，離心5min。抽提去蛋白4．將上清液移入新的1.5mL離心管內(nèi)，加600μL異丙醇。顛倒混勻，可見(jiàn)DNA絮狀沉淀。沉淀核酸5．12000r/min，離心1min，倒掉上清液，將離心管倒置干燥。

將沉淀回溶于20μLTE緩沖液待測(cè)。操作步驟DNA分子在高于等電點(diǎn)的PH溶液中帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。在一定電場(chǎng)強(qiáng)度下，DNA分子的遷移速度與相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)成反比。電泳原理瓊脂糖是一種線性多糖聚合物。濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強(qiáng)。瓊脂糖濃度(%)線型DNA分子的分離范圍(Kb)0.35～600.61～200.70.8～100.90.5～71.20.9～61.50.2～312.00.1～2儀器和試劑儀器電泳儀電泳槽灌膠模具等電泳指示劑溴酚蘭在堿性液體中呈紫蘭色，一般與蔗糖、甘油或聚蔗糖400組成上樣緩沖液。作用：①增加樣品比重，以確保DNA均勻沉入加樣孔內(nèi)。②形成肉眼可見(jiàn)的指示帶，預(yù)測(cè)核酸電泳的速度和位置。③使樣品呈色，使加樣操作更方便。上樣緩沖液溴化乙錠（EB）是一種熒光染料，EB分子可嵌入核酸雙鏈的堿基對(duì)之間，在紫外線激發(fā)下，發(fā)出紅色熒光。其熒光強(qiáng)度與DNA的含量成正比。據(jù)此可粗略估計(jì)樣品DNA濃度。瓊脂糖凝膠EB染色，肉眼可見(jiàn)核酸電泳帶，其DNA量一般>5ng。核酸染色劑注意事項(xiàng)：EB是致癌物質(zhì)，切勿用手接觸，更不要污染環(huán)境。DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)紫外儀上觀察電泳帶及其位置。繪制核酸電