GST融合蛋白原核表達條件的優(yōu)化及純化分析

GST融合蛋白原核表達條件的優(yōu)化及純化分析引言蛋白的表達和純化是蛋白質(zhì)學(xué)研究中的關(guān)鍵步驟。GST（GlutathioneS-Transferase）融合蛋白是重要的表達蛋白質(zhì)的工具之一。GST融合蛋白分子量較小，表達容易，且可以通過GST結(jié)構(gòu)域特異性地結(jié)合到硫酸亞鐵柱上，便于純化。因此，GST系統(tǒng)已成為表達異源蛋白和獲得大量純化蛋白的常用方法。本實驗最初通過構(gòu)建pGEX-6P-1質(zhì)粒，利用GST標簽結(jié)合GlutathioneSepharoseBeads進行富集，實現(xiàn)了目標蛋白的高效純化。然而，目標蛋白的融合表達量較低，為了提高表達效率和純化效果，需要對表達條件進行優(yōu)化，進行相關(guān)的實驗探究。材料與方法實驗材料菌種：大腸桿菌BL21（DE3）；質(zhì)粒：pGEX-6P-1（表達目標蛋白）；酶切酶：EcoRI，XhoI；亞硫酸氫鈉、IPTG、L-谷氨酸、氨基芐青霉素、硫酸亞鐵。實驗方法1.制備重組質(zhì)粒將目標基因重組到pGEX-6P-1載體上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中并篩選出完成基因插入的正?？寺?。取得正常克隆后，通過菌種測序確認克隆中的目標基因和本身的序列正確無誤。接著，用酶切酶EcoRI和XhoI切割完成基因插入的正?？寺?，并經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳純化，獲取目標質(zhì)粒，并在-80℃保存?zhèn)溆谩?.GST融合蛋白的原核表達選取半滿菌草地比板中的單克隆洗菌，用含有0.1mML-谷氨酸和50μg/mL氨基芐青霉素培養(yǎng)至OD600=0.6-1.0范圍內(nèi)。重懸得到的細胞在PBS中（1L，pH7.4）中孵育，然后加入1mMIPTG，呈30℃孵育12小時。孵育結(jié)束后，用冰鹽水重懸得到的細胞，并在-80℃保存?zhèn)溆谩?.特異性結(jié)合硫酸亞鐵柱的GST融合目標蛋白的純化檢測細胞部位所表達的GST目標融合蛋白含量，分別進行超聲裂解、螺旋向下離心，并用亞硫酸氫鈉裂解細胞內(nèi)部萃取物。然后將上述物料用硫酸亞鐵樹脂柱純化，洗滌希釋與洗滌。通過吸附的GST-目標蛋白絡(luò)合物進行硫酸亞鐵柱上的純化，最終緩沖物為pH7.0的PBS。結(jié)果與討論1.蛋白表達條件的優(yōu)化本實驗通過對表達溫度、IPTG誘導(dǎo)濃度、IPTG誘導(dǎo)時間的調(diào)整和優(yōu)化，提高目標蛋白的表達量。結(jié)果表明，表達溫度為30℃時，IPTG誘導(dǎo)濃度為0.4mM，IPTG誘導(dǎo)時間為12小時時，目標蛋白的表達量達到最高。2.GST融合蛋白的純化本實驗采用硫酸亞鐵柱純化的方法，最終可得到高純度、單一的GST融合目標蛋白。該柱能夠特異性吸附GST結(jié)構(gòu)域，并通過復(fù)雜的洗滌和洗脫步驟分離目標蛋白。純化后的蛋白可以進行鑒定和進一步的實驗研究，具有重要的應(yīng)用價值。結(jié)論本實驗對GST融合蛋白的原核表達和純化方法進