目的基因獲取

目的基因獲取第1頁(yè)/共30頁(yè)第四章

目的基因的獲得第2頁(yè)/共30頁(yè)目的基因準(zhǔn)備要分離、改造、擴(kuò)增或表達(dá)的基因。編碼某種蛋白質(zhì)研究某基因結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系研究某基因與疾病的關(guān)系第3頁(yè)/共30頁(yè)一、基因的基本結(jié)構(gòu)特征

一個(gè)能轉(zhuǎn)錄、翻譯的結(jié)構(gòu)基因依次包括以下幾部分：轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)區(qū)、核糖體識(shí)別區(qū)、編碼區(qū)(包括起始密碼子ATG、開(kāi)放閱讀框、終止密碼子TAG、TAA或TGA)和轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。第4頁(yè)/共30頁(yè)（一）原核生物基因的組成——操縱子啟動(dòng)子：RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合和開(kāi)始轉(zhuǎn)錄的片段；SD區(qū)：糖體16SrRNA識(shí)別、結(jié)合mRNA的位置；轉(zhuǎn)錄終止子和終止因子：分別指基因或操縱子3’端提供轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)的DNA序列；協(xié)助mRNA聚合酶識(shí)別終止信號(hào)的輔助蛋白。原核的終止子在終止點(diǎn)之前有一回文結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)錄物形成莖環(huán)發(fā)夾。第5頁(yè)/共30頁(yè)基因區(qū)：ATG+extrons+introns+TAA（TGA或TAG）轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)區(qū)：編碼蛋白的啟動(dòng)子(RNA聚合酶Ⅱ識(shí)別)可尋找三個(gè)保守區(qū)：TATAA/TA區(qū)（Hogness框）、CAAT框、GC框。轉(zhuǎn)錄終止區(qū):真核生物轉(zhuǎn)錄的終止信號(hào)并不清楚。（二）真核生物基因的組成第6頁(yè)/共30頁(yè)二、目的基因的獲得方法目前克隆目的基因常用的方法有四種方法：化學(xué)合成法、cDNA文庫(kù)法、PCR法和RT-PCR法。第7頁(yè)/共30頁(yè)將已知序列的目的基因利用化學(xué)合成的方法直接合成。特點(diǎn)：①只能合成小于100個(gè)堿基特定序列；②自動(dòng)化程度較高；③合成速度較快。方法：磷酸二酯法、磷酸三酯法、固相亞磷酸三酯法（一）化學(xué)合成法第8頁(yè)/共30頁(yè)化學(xué)合成法的用途合成天然基因：如生長(zhǎng)激素釋放抑制素基因、腦啡肽基因、胰島素基因、干擾素基因等修飾改造基因：如組織型纖溶酶原激活劑基因、尿激酶原基因等設(shè)計(jì)新型基因制備探針、引物、接頭第9頁(yè)/共30頁(yè)（二）cDNA文庫(kù)法cDNA(complementaryDNA，互補(bǔ)DNA)：由生物的某一特定器官或特定發(fā)育時(shí)期細(xì)胞內(nèi)的mRNA經(jīng)體外反轉(zhuǎn)錄后形成的互補(bǔ)DNA。cDNA文庫(kù)：利用某種生物的總mRNA合成cDNA，再將這些cDNA與載體連接，轉(zhuǎn)入細(xì)菌細(xì)胞中進(jìn)行保存和擴(kuò)增，稱cDNA文庫(kù)。第10頁(yè)/共30頁(yè)基因組DNA文庫(kù)cDNA文庫(kù)基因組DNA文庫(kù)與cDNA文庫(kù)的比較第11頁(yè)/共30頁(yè)構(gòu)建cDNA文庫(kù)的一般步驟總RNA（totalRNA）提取提取總RNA有商業(yè)化的試劑盒（kit）。mRNA約占總RNA的1－5％，所以應(yīng)選用目的基因mRNA表達(dá)最豐富的組織細(xì)胞為材料來(lái)源，如獲胰島素基因，由應(yīng)以胰島β細(xì)胞為原始生物材料，細(xì)胞因子基因應(yīng)選用經(jīng)抗原或絲裂原刺激培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞為材料第12頁(yè)/共30頁(yè)2.mRNA的分離純化原理：利用mRNA都含有一段polyA尾巴，將mRNA從總RNA（rRNA、tRNA等）中分離純化。方法：親和層析。分離mRNA用商業(yè)化的OligodT纖維柱。第13頁(yè)/共30頁(yè)第14頁(yè)/共30頁(yè)3.cDNA第一鏈的合成OligodT法：用OligodT作引物，合成cDNA的第一鏈。反轉(zhuǎn)錄酶mRNAcDNA3’

5’

5’

AAAAAAATTTTTTTOligodT引物不適用于大分子量的mRNA第15頁(yè)/共30頁(yè)隨機(jī)引物法：隨機(jī)合成6-10bp的多種引物，從mRNA的多個(gè)位點(diǎn)開(kāi)始合成cDNA?；蛱禺愋砸锓ǎ簃RNA序列已知，設(shè)計(jì)基因特異性引物，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA第一鏈。第16頁(yè)/共30頁(yè)4.降解mRNA模板用堿處理或用RNaseH降解mRNA-DNA雜交分子中的mRNA。3’

引物mRNAmRNAcDNA3’

3’

5’

5’

反轉(zhuǎn)錄酶引物cDNA第一鏈3’

5’

5’

cDNA第一鏈3’

5’

引物或RNaseH堿第17頁(yè)/共30頁(yè)5.cDNA第二鏈的合成自身引導(dǎo)法

用RnaseH消化后，cDNA單鏈的3’末端一般形成一個(gè)彎回來(lái)的雙鏈發(fā)卡結(jié)構(gòu)（機(jī)理不明），可成為合成第二條cDNA鏈的引物。用DNA聚合酶合成第二鏈DNA。第18頁(yè)/共30頁(yè)S1核酸酶消化會(huì)使獲得的雙鏈cDNA5’端有幾對(duì)堿基缺失第19頁(yè)/共30頁(yè)置換合成法以第一鏈合成產(chǎn)物cDNA-mRNA雜交體作為切口平移的模板，RNA酶H在雜交體的mRNA鏈上造成切口和缺口,產(chǎn)生一系列RNA引物，在DNA聚合酶I的作用下合成cDNA的第二鏈.第20頁(yè)/共30頁(yè)置換合成法第21頁(yè)/共30頁(yè)6.cDNA與載體連接在雙鏈cDNA末端接上人工接頭，即可與載體連接，轉(zhuǎn)入受體菌?；蚪柚┒宿D(zhuǎn)移酶給載體和雙鏈cDNA的3’端分別加上幾個(gè)C或G，成為粘性末端。接上人工接頭粘性末端CCCCCC末端轉(zhuǎn)移酶第22頁(yè)/共30頁(yè)第23頁(yè)/共30頁(yè)cDNA文庫(kù)的查詢用目的基因探針與文庫(kù)中的重組載體進(jìn)行Southernblot雜交。文庫(kù)載體探針電泳后雜交放射自顯影測(cè)序分析第24頁(yè)/共30頁(yè)（三）PCR法目前實(shí)驗(yàn)室最常用。擴(kuò)增時(shí)容易突變：高保真的PCR引物，DNA序列測(cè)定。第25頁(yè)/共30頁(yè)1.直接從基因組中擴(kuò)增提取基因組DNA作模板；根據(jù)目的基因序列設(shè)計(jì)引物；PCR擴(kuò)增。適合擴(kuò)增原核生物基因。第26頁(yè)/共30頁(yè)原核基因組部分原核細(xì)胞提取基因組DNAPCR擴(kuò)增第27頁(yè)/共30頁(yè)2.從mRNA中擴(kuò)增:RT-PCR提取基因組總RNA；反轉(zhuǎn)錄合成總cDNA作模板；根據(jù)目的基因序列設(shè)計(jì)引物；PCR擴(kuò)