真菌診治進展

真菌診治進展第1頁/共55頁AIDS插管等侵襲性治療腫瘤和免疫抑制治療骨髓和實體器官移植廣譜抗生素治療

真菌感染不斷增加的原因—

高危人群的增多第2頁/共55頁Candida條件致病菌Aspergillus機會來了！第3頁/共55頁+600%+300%+300%Martinetal,NEJM2003;348:1546膿毒血癥的發(fā)病率第4頁/共55頁Edmondetal.Clin.Infect.Dis.(1999).29:239-244NosocomialbloodstreaminfectionsinhospitalsintheUSA

重要致病菌流行病學(xué)監(jiān)測和控制（SCOPE）計劃1995-1998排名病原數(shù)量分離率死亡率1凝固酶陰性葡萄球菌390831.9%21%2金黃色葡萄球菌192815.7%25%3腸球菌屬135411.1%32%4念珠菌屬9347.6%40%5大腸埃希菌7005.7%24%6克雷伯菌屬6625.4%27%7腸桿菌屬5574.5%28%8銅綠假單胞菌5424.4%33%9鋸桿菌屬1771.4%26%10鏈球菌屬1731.4%23%念珠菌血行感染發(fā)病率和死亡率高第5頁/共55頁195019601970198019902000IAASP侵襲性曲霉病的發(fā)病率也在增加…Kontoyiannisetal.EurJClinMicrobiolInfectDis2002，21:161-172Warnock.JAC,1998,41(supplD):95-105第6頁/共55頁78798081828384858687888990919202468Aspergillusspp.Candidaspp.AllotherPrevalenceatAutopsy[%]Grolletal,JInfect1996;33:23-32.經(jīng)尸檢證實的侵襲性真菌感染第7頁/共55頁54.84%12.9%3.23%9.68%19.35%西南醫(yī)院尸解資料，(1971-2000)，郝飛教授提供AspergillusCryptococcusMucorCandidaAllothers第8頁/共55頁曲霉感染:

日益嚴重的問題曲霉是繼念珠菌之后的第二常見真菌病原體雖然經(jīng)過治療，免疫抑制患者的死亡率仍達90%AndrioleVT.JAntimicrobChemother1999;44:151-162;GrollAHetal.AdvPharmacol1998;44:343-500;DenningDW.ClinInfectDis1998;26:781-805;AndrioleVT.CurrClinTopInfectDis1998;18:19-36;LinS-Jetal.ClinInfectDis2001;32:358-366;PatersonDL,SinghN.Medicine(Baltimore)1999;78:123-138.第9頁/共55頁

非白念珠菌的增多...非白念珠菌(46.8%)白念珠菌

(53.2%)Edmondetal.ClinInfectDis1999;29:239-44.934例念珠菌血癥第10頁/共55頁132C.glabrata42.3%C.parapsilosis21.1%C.tropicalis26.1%非白念念珠菌血癥Edmondetal.ClinInfectDis1999;29:239-44.第11頁/共55頁美國血源性念珠菌感染種類分布

(1998-2000)Hajjehetal.(2004)J.Clin.Microbiol.42(4):1519-1527Other1.12%C.lusitaneae1.02%C.krusei2.04%C.tropicalis12.23%C.parapsilosis13.25%C.glabrata24.46%C.albicans45.87%.第12頁/共55頁我國念珠菌種類的變化菌種85-92%96-2002%白念珠菌80-9043-75熱帶念珠菌10-1310-15光滑念珠菌1-614-21克柔念珠菌15-27葡萄牙念珠菌12-5新型隱球菌11-5第13頁/共55頁

菌名 株數(shù) S％ SDD％ R% 白念珠菌 38833 98.4 0.7 0.8 近平滑念珠菌 2628 93.8 4.4 1.8熱帶念珠菌 2990 92.5 4.9 2.6葡萄芽念珠菌274 93.4 3.3 3.3新型隱球菌688 89.1 4.8 6.1 念珠菌屬 2583 81.2 10.7 8.1 季也蒙念珠菌365 78.6 12.9 8.5 其它念珠菌 1158 75.3 11.3 13.4光滑念珠菌 5611 65.5 20.1 14.4克柔念珠菌 1206 17.7 31.1 50.7 常見酵母菌對氟康唑的敏感性第14頁/共55頁臨床常見的條件性真菌感染念珠菌病:最常見，占血源感染的第4位。曲霉菌病:常見于血液系統(tǒng)惡性腫瘤病人，器官移植常見合并癥。隱球菌病:在艾滋病人發(fā)病率為10-20%。接合菌?。共。?多見于重癥糖尿病和燒傷病人。第15頁/共55頁臨床有增多趨勢的條件性真菌非白念念珠菌感染毛孢子菌感染地霉感染鐮刀菌感染枝頂孢霉感染暗色真菌感染馬爾尼菲青霉第16頁/共55頁PCR

PCR,GM試驗1-3-?-D-glucan,G試驗

PCR種特異性屬特異性真菌通用真菌感染的非培養(yǎng)診斷第17頁/共55頁非培養(yǎng)診斷檢測方法G試驗檢測b-1,3–D-葡聚糖ELISA法檢測曲霉半乳甘露聚糖抗原乳膠凝集試驗檢測新生隱球菌抗原ELISA法檢測念珠菌抗原PCR_真菌通用引物、種屬特異性引物第18頁/共55頁β1,3-D-glucan

（葡聚糖）真菌細胞壁成份，占50%以上其他微生物、動物及人的細胞不含該成份主要用于念珠菌和曲霉菌感染診斷b1,6glucansb1,3PPLbilayerchitinergosterolb1,3glucansynthasemannoproteins第19頁/共55頁

方法：G試驗β-葡聚糖可特異性激活鱟（Limulus）變形細胞裂解物中的G因子，引起裂解物凝固，故稱G試驗。-b-1,3-D-葡聚糖通過激活G因子（FactorG）引起凝集；內(nèi)毒素通過激活C因子（FactorC）引起凝集；試劑盒:祛除FactorC葡聚糖特異第20頁/共55頁β-1,3-D-葡聚糖檢測方法兩種試劑盒Fungitec-G(marketedinJapan)Obayashi,Lancet345:17-20,’95“確診真菌感染的患者”:90%sensitiveGlucatell(approachingUSlicensure)Ostrosky多中心研究189侵襲性真菌感染高危的患者*每名患者取材1次:Sensitivity:70%;Specificity87%.界值：Fungitec:20pg/mLFungitell:60/80pg/mL

金山川公司G試劑:50pg/mL第21頁/共55頁β-1,3-D-葡聚糖

檢測范圍不僅可檢測念珠菌感染曲霉、鐮刀菌和很多霉菌均存在β-1,3葡聚糖(Miyazaki,JClinMicro33:3115,‘95)隱球菌細胞壁為alpha-葡聚糖,故為陰性陽性結(jié)果只能代表存在侵襲性真菌感染,不能確定種類第22頁/共55頁ClinInfectDis2004;39:199-205侵襲性真菌感染中葡聚糖檢測AML,MDSReceivingantifungalprophylaxis第23頁/共55頁Cutoff60pg/mlClinInfectDis2004;39:199-205.3030withcandidemiacontrolsubjects侵襲性真菌感染的葡聚糖檢測Fungitellassay第24頁/共55頁假陽性原因*內(nèi)毒素：NaOH預(yù)處理*抗腫瘤藥：香菇糖、裂殖菌多糖*免疫治療：白蛋白、球蛋白*血液透析中使用硝酸纖維素制品*術(shù)中使用棉制品、海綿等*血紅蛋白細菌及真菌定植狀態(tài)不影響G試驗PickeringJ,etal.JClinMicrobiol2005;43:5957–62第25頁/共55頁假陰性原因體液中存在葡聚糖酶使BDG降解。KawaiRetal.2006，ApplMicrobiolBiotechnol71:898–906第26頁/共55頁成人急性髓內(nèi)白血病，慢性淋巴細胞白血病，急性淋巴細胞白血病，骨髓發(fā)育不良綜合癥，非霍奇金淋巴瘤。疑有內(nèi)源性真菌內(nèi)眼炎的患者術(shù)后病重患者中暑患者農(nóng)民肺ImaiKetal.2004，NihonKokyukiGakkaiZasshi42:1024–1029肺曲霉病患者卡氏肺囊蟲肺炎患者其他確診或疑似侵襲性真菌感染的患者K?dzierskaetal.EurJClinMicrobiolInfectDis(2007)26:755–766應(yīng)用對象：第27頁/共55頁檢測曲霉半乳甘露聚糖抗原（GM）檢測位于曲霉細胞壁上的galactomannan,（GM）3.Detection–avidin-enzyme+substrate2.DetectingAb–anti-galactomannan[biotinconjugated]Ag–blood,urine,BAL1.Captureantibody–monoclonalanti-galactomannan

Specificity=>90%sensitivity=75%第28頁/共55頁A酶聯(lián)免疫吸附法（PlateliaAspergillus-EIA）

(PA-EIAPlateliaAspergillus,Bio-Rad,Marnes-la-Coquette,France)

歐洲已流行近十年，在美國03年剛被批準。B乳膠凝集試驗（Latexagglutination）

(LAPastorexAspergillus,Bio-Rad,Marnes-la-Coquette,France)兩種方法比較，前者比后者更有效：*0.5–1

ng/mLVs15

ng/mL。*早5天檢測到KeutgenXetal,EurJClinMicrobiolInfectDis.2007

GM抗原的檢測方法第29頁/共55頁曲霉的GM

抗原檢測乳膠凝集試驗（Pastorex?）

(15ng/ml)酶連免疫吸附試驗（Platelia?）(1ng/ml)靈敏度（%）特異度（%）LA25-7090-100ELISA50-9080-90Sabettaetal.JID1985;152:946Ansorgetal.EurJClinMicrobiolInfectDis1994;13:582Verweijetal.JCM1995;33:3150Maertensetal.Blood2001;97:1604Herbrechtetal.JClinOncol2002;20:1898第30頁/共55頁預(yù)處理：*EDTA作預(yù)處理，分解免疫復(fù)合物，沉淀蛋白*加熱使免疫復(fù)合物失活。界值確定：*陽性>0.5;陰性<0.5;歐美已普遍接受（06年）。*將界值由1.5改為0.5，敏感性由76.3%提高到97.4%，特異度由97.5%降至90.5%。結(jié)果判讀：*兩次陽性可確診感染。*重復(fù)檢測陰性可排除真菌感染。JohanAetal,ClinicalInfectiousDiseases2007;44:1329–36GM試驗注意事項第31頁/共55頁PlateliaAspergillusEIA–結(jié)果判斷第32頁/共55頁GM不同Cutoffs值的敏感性和特異性MarrKAetal,JInfectDis2004;190:641-9第33頁/共55頁*蘸有曲霉孢子的棉花、棉簽*患者樣本中兒童比例高(>83%)：雙歧桿菌的脂膜酸可與EB-A2抗體結(jié)合*破損的腸粘膜：不潔飲食攜帶的GM*腸外使用β-內(nèi)酰胺類抗生素：派拉西林、阿莫西林

AlbanAubry,etal,JCM2006p.389–394*細胞毒性藥物：e.g.:環(huán)磷酰胺*移植物抗宿主?。捍嬖谂c抗體結(jié)合的其它蛋白Hamakietal,BoneMarrowTransplant.2001Sep;28(6):633-4假陽性:第34頁/共55頁Vale′rioRetal,Mycopathologia(2007)163:191–202其它GM可能出現(xiàn)陽性的真菌第35頁/共55頁*抗體多RaoulHerbrechtetal,JournalofClinicalOncology,Vol20,No7(April1),2002*抗真菌藥：兩性霉素B、泊沙康唑、伊曲康唑通過抑制菌絲生長從而減少GM的分泌。*感染部位：GM檢測的敏感度在局限性感染比侵襲性感染低：慢性肉芽腫。*侵血管性弱：菌絲少時*菌量少假陰性：第36頁/共55頁（1）GM檢測不僅利于疾病的確診，也有助于指導(dǎo)用藥。*用藥后監(jiān)測GM可評估藥效及預(yù)后。*頻率：2次/周。*適用對象:粒細胞減少、移植、長期用激素的患者（2）結(jié)合G試驗可減少假陽性。（3）結(jié)合臨床表現(xiàn)及其它輔助檢查確診。應(yīng)

用第37頁/共55頁GM抗原第38頁/共55頁GM抗原ELISA檢測應(yīng)用

（Platelia試劑盒）48例患者：確診IA4例，3例陽性；高度懷疑IA13例，8例陽性；可疑IA31例，2例陽性。

王，等。臨床皮膚科雜志，2006。靈敏性為64.7%特異性為93.5%假陽性率為6.5%假陰性率為35.3%第39頁/共55頁曲霉GM抗原系列監(jiān)測n=362高危粒細胞缺乏病人SandwichELISA≥2timesweekly,11.7%陽性n=30provenIAn=9probableIAn=264withnoIA敏感性 89.7%特異性 98.1%陽性預(yù)測值PPV 87.5%陰性預(yù)測值NPV 98.4%MaertensJetal,Blood2001;97:1604-10第40頁/共55頁曲霉感染檢測的影響因素半乳甘露聚糖在血中存在時間短，建議：

—高危人群每周至少檢測2次，動態(tài)觀察

—結(jié)合影象學(xué)、培養(yǎng)結(jié)果綜合分析診斷假陰性假陽性哌拉西林/他唑巴坦與其它細菌或真菌成分有交叉反應(yīng)腸道中定植的曲霉釋放GM進入血液循環(huán)含有谷物的食物中存在GM抗原，通過受損腸黏膜進入血循環(huán)導(dǎo)致抗原血癥，化療后出現(xiàn)嚴重黏膜炎的更易發(fā)生第41頁/共55頁檢測真菌DNA的PCR試驗標本：全血血清活檢組織BALCSF不同方法：?DNA提取

?PCR設(shè)計?產(chǎn)物檢測第42頁/共55頁PCRPCR技術(shù)用于診斷種特異-PCR非特異PCR雜交Standart"single""nested"PCR-EIA"Real-time"標本全血血漿血清BAL最低檢測范圍4-10cfu/ml25-100fgDNA原位雜交目的基因多拷貝基因第43頁/共55頁PCR檢測和鑒定多引物多樣本制備高敏感度:1-100cells/mlpan-fungalPCR敏感度：100%(多個標本)與治療一致JClinMicrobiol1997;35:1353-60SPEED第44頁/共55頁PCR過篩試驗診斷IA每周監(jiān)測2次—通用引物;確定采用巢式和實時定量;敏感性100%,特異性65%;早于臨床癥狀2天,早于確診9天;動態(tài)觀察持續(xù)陰性可排除;Dr.MaschmeyerG.in2ndTrendsinMedicalMycology,23-26October2005,Berlin,Germany.第45頁/共55頁DNA擴增種/屬特異性序列

HSP90

羊毛固醇脫甲基酶

幾丁質(zhì)合成酶

天冬氨酸蛋白酶

actin

高度保守序列18SrRNAgene

28SrRNAgene 線粒體

單拷貝gene巢氏PCR多拷貝genes第46頁/共55頁JunZhaoetal.JCM2001