目的基因的制備與分離

目的基因的制備與分離第1頁/共57頁一、目的基因特征：感興趣和需要研究的基因；具有重要應用價值的基因?；蚬こ讨械哪康幕蛑饕侵附Y構基因，即編碼某種蛋白或者多肽的DNA序列。

牛牛文庫文檔分享第2頁/共57頁1）原核生物基因的組成基因區(qū)：操縱子?；蛑g有間隔序列啟動區(qū)：RNA聚合酶識別、結合和開始轉錄的片段SD區(qū)：起譯碼ATG上游約10bp處的富含嘌呤的保守區(qū)，其轉錄物：

5’AGGAGGU3’，核糖體16SrRNA識別、結合mRNA的位置轉錄終止子和終止因子：分別指基因或操縱子3’端提供轉錄終止信號的DNA序列；協(xié)助mRNA聚合酶識別終止信號的輔助蛋白。原核的終止子在終止點之前有一回文結構，轉錄物形成莖環(huán)發(fā)夾。1、結構基因的組成轉錄啟動區(qū)、核糖體識別區(qū)、編碼區(qū)(起譯碼ATG、ORF、休止碼TAG或TAA或TGA)、終止轉錄區(qū)

牛牛文庫文檔分享第3頁/共57頁終止轉錄區(qū)轉錄啟動區(qū)核糖體識別區(qū)編碼區(qū)ATGTAATAGTGAATGTAATAGTGA間隔序列

識別區(qū)Pribnow框轉錄起點

16-19bp5-9bp3’—TTGACATATAATA/G—5’5’—AACTGAATATTAT/C—3’

-35序列-10序列

牛牛文庫文檔分享第4頁/共57頁2）真核生物基因的組成3）其他基因組基因的組成質粒(無內(nèi)含子)、病毒(重疊基因)、線粒體(缺少SD序列)、葉綠體(多順反子)?；騾^(qū)：ATG+extrons+introns+TAA（TGA或TAG）轉錄啟動區(qū)：r、m、tRNA分別由RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ轉錄。編碼蛋白的啟動子(RNA聚合酶Ⅱ識別)可尋找三個保守區(qū)：

-20~-30的TATAA/TA區(qū)(Hogness框)：解鏈，決定起錄點

-75的9bp共有序列GGT/CCAATCT區(qū)(CAAT框)：與RNA聚合酶結合有關

-75區(qū)上游有一共有序列GGGCGC(GC框):結合某些轉錄因子轉錄終止區(qū):

牛牛文庫文檔分享第5頁/共57頁轉錄啟動區(qū)基因區(qū)斷裂基因轉錄終止區(qū)植物和動物基因內(nèi)部和周圍高度保守的核苷酸順序

牛牛文庫文檔分享第6頁/共57頁2、基因的排列直線排列于DNA上，且兩基因之間有非編碼序列。特例：1）重疊基因（病毒）

2）重復基因

約30%真核基因是多拷貝

3）加倍基因

較高等的生物基因組是二倍體或多倍體

質粒在宿主內(nèi)是多拷貝

4）基因重排

基因組中同一基因簇處于不同細胞而發(fā)生基因排列變化

牛牛文庫文檔分享第7頁/共57頁5）轉座子（轉座基因）能改變自身座位的一段核苷酸順序?？珊幸粋€或幾個基因。通過轉座，生物的遺傳信息會改變

……

……

牛牛文庫文檔分享第8頁/共57頁

牛牛文庫文檔分享第9頁/共57頁二、目的基因的制備

待分離的基因序列:

轉錄啟動區(qū)+編碼區(qū)+終止區(qū)、完整操縱子或基因簇、只具編碼序列的基因區(qū)、只含啟動子或終止子的DNA片段2、從基因工程的目的看，轉入目的基因都是為了合成所需的酶、抗體、蛋白質激素、結構蛋白質，則需轉入結構基因；若轉入目的基因是為了調控某個結構基因的活動，則可轉入調節(jié)基因目的基因一定是結構基因嗎?1、按基因所編碼的蛋白質的作用：結構基因：編碼酶蛋白、血紅蛋白、膠原蛋白或晶體蛋白等蛋白質的基因調節(jié)基因：編碼阻遏或激活結構基因轉錄的蛋白質的基因

牛牛文庫文檔分享第10頁/共57頁低等生物基因組DNA比較簡單，且不少基因已知其準確定位，可以從基因組中直接分離得到；高等生物基因的制備與分離相對復雜。1、目的基因的直接分離法2）基因分離的物理化學法用超聲波震蕩等機械法使DNA斷裂優(yōu)點：隨機性大缺點：所得基因片段不能直接連接，需加工修飾。目的基因的制備方法1）限制性核酸內(nèi)切酶酶切分離法用酶降解染色體DNA（esp原核生物）,將降解的DNA克隆到載體上，從而得到目的基因優(yōu)點：原理簡單，操作簡便，具有一定的應用范圍。缺點：隨機性、盲目性大，篩選麻煩，應用范圍有限（只適用于原核生物）已定序（一次或多次酶切、純化）已定位（兩側的識別位點酶切）未定序或無定位（酶切、構建簡單文庫釣出）

牛牛文庫文檔分享第11頁/共57頁2、目的基因分離的基因組文庫法1）基因組文庫的定義用克隆載體將某種生物的基因組全部遺傳信息儲存于一個受體菌的群體，即構成了這種生物的基因組文庫。若只儲存某生物基因組的部分遺傳信息，即構成部分基因組文庫。2）基因組文庫的大小

N=ln(1-P)/ln(1-f)N：文庫必需的克隆數(shù)

P：文庫中目的DNA片段的出現(xiàn)概率f：插入片段大小/全基因組大小的比值3）構建λ噬菌體基因組文庫的步驟獲得含基因的DNA片段與λ噬菌體克隆載體重組轉化受體菌并篩選重組子（見導入受體細胞）

牛牛文庫文檔分享第12頁/共57頁基因組文庫應該具有的克隆子數(shù)目

牛牛文庫文檔分享第13頁/共57頁

牛牛文庫文檔分享第14頁/共57頁1）cDNA文庫的概念和類型3、目的基因分離的cDNA基因文庫法2）cDNA文庫的構建cDNA文庫的類型：表達型(如λgt11)：插入片段可表達融合蛋白，有活性、抗原性。非表達型：適于分離可用核苷酸探針雜交篩選的目的基因

探針(從已知部分蛋白序列推測的人工合成,同種或屬的已知序列)按所用載體分:質?！?含克隆數(shù)少，適于高豐度mRNA)

噬菌體～(含克隆數(shù)多，適于低或極低豐度mRNA)某生物基因組轉錄的全部或部分mRNA經(jīng)反轉錄產(chǎn)生的各種cDNA片段，分別與載體重組而存在于一種受體的群體，即cDNA基因(部分)文庫。

直接從真核生物體分離目的基因很困難，但在某一特定發(fā)育期和特定組織僅表達總基因數(shù)的15%，據(jù)此來分離目的基因，可大大降低難度。關鍵技術：RACE技術

牛牛文庫文檔分享第15頁/共57頁4、利用聚合酶鏈式反應技術擴增目的基因（1）巢式PCR（2）反向PCR（3）不對稱PCR（4）錨定PCR（5）長程PCR（6）反轉錄PCR（7）鍋柄PCR（8）AluPCR

牛牛文庫文檔分享第16頁/共57頁5、基因的化學合成在體外，可以合成一系列長約幾百bp的寡聚核苷酸鏈，然后按照基因的順序將這些短的核苷酸鏈連接起來。DNA合成儀+酶化學法獲得目的基因DNA片段.

1）基因化學合成的概況

1979年Khorana首次成功地合成了tRNA基因（有活性的大腸桿菌酪氨酸轉移核糖核酸基因）.

3）化學合成法的優(yōu)缺點：2）基因的組裝方式

150～200bp以內(nèi)可化學合成.要獲得較大的高等真核基因必須設計一種特殊方法,能把合成的DNA片段構建成完整的基因的過程.稱為基因組裝.20世紀70年代提出,常用的有兩種:全片段酶促連接法：酶促填充法:

牛牛文庫文檔分享第17頁/共57頁三、目的基因分離的其他常用方法（一）篩選目的基因的差別雜交及減法雜交技術1、差別雜交定義：分別制備兩種細胞群體的mRNA提取物，其中一個群體含有目的基因mRNA，另一個群體不含。以這兩種總mRNA（或其cDNA)為探針，分別篩選由表達目的基因的細胞群體構建的cDNA文庫。

原理圖缺點：靈敏度低，不適于分離低豐度mRNA的目的基因；需篩選大量雜交濾膜，鑒定大量噬菌斑，十分費時耗力；差別雜交重復性差。

牛牛文庫文檔分享第18頁/共57頁2、減法雜交技術1）mRNA減法雜交從表達目的基因的組織提取mRNA并反轉錄為cDNA，再與無目的基因表達的組織提取的mRNA做過量雜交，兩者均表達的基因產(chǎn)物將形成cDNA/mRNA雜交分子，而特異mRNA反轉錄的cDNA仍單鏈，將其分離即為差異表達序列。定義：通過DNA復性動力學富集目的基因序列，并構建減數(shù)文庫來克隆目的基因。其本質是盡量消除兩種樣品共同存在的基因序列，從而有效富集目的基因序列。

牛牛文庫文檔分享第19頁/共57頁（二）利用差示分析法分離目的基因克隆1、mRNA差別顯示技術（差別顯示反轉錄PCR）原理：優(yōu)點：可檢測表達的所有基因；同時檢測基因的上、下調表達、展現(xiàn)所有差異、比較多種細胞類型；缺點：檢測全部mRNA的PCR工作量很大；PAGE分離的cDNA大于500bp時會漏檢，凝膠分析最多為50～100條；差別條帶成簇時造成假陽性；Northern印跡繁雜費時；本底較高。2、代表性差別分析技術（RDA）：比較突變型（DriverDNA）與野生型（testerDNA）基因組之間的差異來分離和鑒定突變基因的方法。如cDNA-RAD：

牛牛文庫文檔分享第20頁/共57頁（三）應用基因定位克隆技術分離篩選目的基因又稱圖位克隆(或候選基因克隆),是根據(jù)目的基因的位置特性而非其編碼產(chǎn)物來克隆。成功分離目的基因須具備三個必要條件：RFLP：限制性片段長度多態(tài)性，用特定的限制性核酸內(nèi)切酶切割有關DNA分子，產(chǎn)生的DNA分子長度上的變化RAPD：用10個堿基的隨機引物PCR擴增特定DNA分子，獲得的一系列不同長度的DNA片段。染色體步查法分離目的基因

牛牛文庫文檔分享第21頁/共57頁（四）根據(jù)生物大分子間的相互作用分離目的cDNA克隆酵母雙雜合系統(tǒng)真核生物的位點特異轉錄激活因子：BDAD圖

牛牛文庫文檔分享第22頁/共57頁圖4-4不經(jīng)分級分離的文庫構建

牛牛文庫文檔分享第23頁/共57頁Oligo(dT)引導的cDNA合成mRNA為模板合成方法常用的有兩種：一種是Oligo(dT)引導合成法（左圖）；另一種是隨機引物引導合成法

牛牛文庫文檔分享第24頁/共57頁2、cDNA第二鏈合成的置換合成法：

（獲得的雙鏈cDNA5’端會有幾對堿基缺失）原理：以第一鏈合成產(chǎn)物cDNA：mRNA雜交體作為切口平移的模板，RNA酶H在雜交體的mRNA鏈上造成切口和缺口，產(chǎn)生一系列RNA引物，在大腸桿菌DNA聚合酶I的作用下合成cDNA的第二鏈

牛牛文庫文檔分享第25頁/共57頁3、引導合成法合成雙鏈cDNA（Oligo（dG）寡聚引物）彩圖

牛牛文庫文檔分享第26頁/共57頁6、PCR引物-接頭法合成雙鏈cDNA分子與oligo(dG)法一樣

牛牛文庫文檔分享第27頁/共57頁經(jīng)典RACE技術的操作原理

牛牛文庫文檔分享第28頁/共57頁1、自身引導法合成cDNA第二鏈原理：獲得的單鏈cDNA3’端會形成發(fā)夾結構的能力，以此作為第二鏈合成的引物，在大腸桿菌聚合酶IKlenow或反轉錄酶的作用下，合成cDNA的第二鏈。缺點：在以S1核酸酶切割cDNA的發(fā)夾狀結構時，會導致對應于mRNA5’端的地方的序列出現(xiàn)缺失和重排。

S1核酸酶的純度不夠時，會偶爾破壞合成的雙鏈cDNA分子。

牛牛文庫文檔分享第29頁/共57頁隨機引物引導的cDNA第一鏈合成法：根據(jù)可能序列合成出所有6~10個核苷酸組成的寡片段，這種混合物可與mRNA模板在多位點同時雜交，且可作為合成第一鏈的引物。

這種方法可從mRNA模板的多位點同時合成cDNA，能包含模板的完整信息，

適于較長的mRNA分子克隆。

牛牛文庫文檔分享第30頁/共57頁優(yōu)點：a）合成cDNA的效率高b）直接利用第一鏈的反應產(chǎn)物，不需純化c）避免使用S1核酸酶來切割雙鏈cDNA需要3種酶：RNA酶H、大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ和DNA連接酶置換合成法

牛牛文庫文檔分享第31頁/共57頁3、引導合成法：獲得的雙鏈cDNA能保留完整的5’端序列

牛牛文庫文檔分享第32頁/共57頁基因組DNA文庫與cDNA文庫的比較

牛牛文庫文檔分享第33頁/共57頁

牛牛文庫文檔分享第34頁/共57頁mRNA減法雜交分離T細胞受體基因目的基因不表達的B細胞表達目的基因的T細胞B細胞和T細胞都表達mRNAT細胞

特異表達的mRNAB細胞的mRNA(含有polyA)T細胞反轉錄得到的cDNA雜交仍舊是單鏈的cDNA

牛牛文庫文檔分享第35頁/共57頁mRNA差別顯示技術（差別顯示反轉錄PCR）基本流程

牛牛文庫文檔分享第36頁/共57頁染色體步移法克隆目的基因的基本流程未知基因已知基因基因組文庫克隆片段ABCDEFXY間隔100bp

牛牛文庫文檔分享第37頁/共57頁酵母雙雜交體系原理

牛牛文庫文檔分享第38頁/共57頁3）雙抗體免疫法分離編碼蛋白的基因適于真核蛋白已分離純化。核糖體+mRNA多核糖體+核蛋白抗體孵育，形成復合體+二抗不連續(xù)蔗糖梯度離心分離出含待定mRNA的多核糖體酚、氯仿抽提，柱層析分離出含特定編碼蛋白的mRNA反轉錄目的cDNA改進：SPA替代二抗發(fā)展出SPA-Sepharose4B親和柱介質分離更有效

4）利用酶促反轉錄法直接從特定mRNA分離基因反轉錄酶聚合酶mRNAcDNAdscDNA

牛牛文庫文檔分享第39頁/共57頁2、構建基因組文庫分離法（4）構建柯斯質?；蚪M文庫

優(yōu):比λ噬菌體容納的外源DNA大(30～45kb),構建完整文庫所需克隆數(shù)少;載體僅約5kb,可直接分析插入片段的限制性圖譜,而λ噬菌體則否.

缺點:難篩選;重組效率低(105～6～104～5clongs/μgDNA);不易儲存.

基因組文庫的構建過程:酶解制備外源DNA;酶切載體;連接重組并包裝進噬菌體;重組體轉染宿主菌。（5）構建YAC基因組文庫

以質粒pBR322為骨架,保留復制位點ori和篩選標記Ampr,并加入酵母染色體必需的五個組件而構建YAC載體.常用pYAC4構建文庫.EcoRI+BamHI雙酶切pYAC4;制備生物體完整基因組并片段化;

連接轉化。

牛牛文庫文檔分享第40頁/共57頁用柯斯質粒載體構建基因組文庫克隆進柯斯質粒載體

牛牛文庫文檔分享第41頁/共57頁YAC(酵母人工染色體）用于基因組文庫的構建

牛牛文庫文檔分享第42頁/共57頁2）cDNA文庫的構建分離細胞總RNA以mRNA為模板，合成cDNA第一鏈cDNA第二鏈的合成（自身引導合成法、置換合成法、引導合成法、引物－銜接頭合成法）常用方法:1、2、3、4、5、6、將合成的雙鏈DNA重組入載體，導入宿主(大腸桿菌)增殖3）mRNA的豐度與cDNA基因文庫大小的關系要獲得高豐度的某mRNA,必須選好適當?shù)牟牧?文庫中cDNA的克隆數(shù)=細胞總mRNA數(shù)/細胞中某種mRNA的拷貝數(shù)

實際需構建的最小值遠超過公式理論值,可按下面公式估算

N=ln(1-P)/ln(1-f)N：c

DNA基因文庫必需的克隆數(shù)

P：文庫中含目的基因cDNA片段的出現(xiàn)概率

f：某mRNA

的豐度/總mRNA數(shù)的比值4）cDNA基因文庫法分離目的基因的優(yōu)缺點

牛牛文庫文檔分享第43頁/共57頁4、載體引導法合成全長雙鏈cDNA5、固相支持物法合成全長雙鏈cDNA

牛牛文庫文檔分享第44頁/共57頁使用λgt10噬菌體載體構建cDNA文庫

牛牛文庫文檔分享第45頁/共57頁4）cDNA克隆的優(yōu)越性和局限性根據(jù)前估算公式,提高目的基因mRNA在總數(shù)的比例可減少cDNA文庫的克隆子數(shù),構建前用各種方法富集和提高目的mRNA豐度,可降低文庫的復雜性和分離難度.cDNA和基因組文庫構建方法比較與基因組文庫相比,在構建和基因分離方法上的優(yōu)點:①某些RNA病毒分離的唯一方法;②假陽性率降低;③直接用于基因操作;④研究真核細胞mRNA的結構和功能.局限性:①所含遺傳信息遠小于基因組文庫,受細胞來源或發(fā)育時期的影響;②不能直接獲取基因內(nèi)含子和編碼區(qū)外的調控序列的結構與功能信息;③高豐度mRNA的cDNA比例較高,分離較易,而低豐度的比例較低,較難.

牛牛文庫文檔分享第46頁/共57頁1、人工合成完整基因的所有寡核片段,相鄰的有4～6bp重疊互補,2、適當條件復性形成帶粘末段的雙鏈.3、T4DNA連接酶酶促形成磷酸二酯鍵.基因合成的全片段酶促連接法

牛牛文庫文檔分享第47頁/共57頁1、首先合成完整基因的一些片段,相鄰3’的短序列互補,2、適當條件復性形成模板(引物復合體).3、Kl