碩士生物儀器分析之氣相色譜

碩士生物儀器分析之氣相色譜第1頁/共59頁簡介特點基本理論儀器流程及主要部件應(yīng)用發(fā)展趨勢第2頁/共59頁ChromatographyIsatechniqueusedtoseparateandidentifythecomponentsofamixture.Worksbyallowingthemoleculespresentinthemixturetodistributethemselvesbetweenastationaryandamobilemedium.Moleculesthatspendmostoftheirtimeinthemobilephasearecarriedalongfaster.Introduction第3頁/共59頁GasChromatographyHerethemobilephaseisanunreactivegas

(egNitrogen)flowingthroughatube.Andthestationaryphaseisaninvolatileliquidheldonparticlesofasolidsupport.Introduction第4頁/共59頁GasChromatography(GC)isnowamatureanalyticaltoolparticularlyusefulintheanalysisofvolatileandthermallystableanalytes.Characteristic

第5頁/共59頁氣相色譜可用來分析能瞬間氣化且不分解的、沸點<350℃的穩(wěn)定的物質(zhì)。被廣泛應(yīng)用于環(huán)境樣品中污染物的分析、藥品質(zhì)量檢測、天然產(chǎn)物成分分析、食品中農(nóng)藥殘留量測定、工業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量控制等領(lǐng)域，也可用于科研及常規(guī)分析。在藥物分析中，GC主要用于原料藥及制劑的鑒別與含量測定，殘留有機溶劑的檢查。Characteristic

第6頁/共59頁Intheanimationbelowtheredmoleculesaremoresolubleintheliquid(orlessvolatile)thanarethegreenmolecules.ABBasicprinciple第7頁/共59頁Basicprinciple第8頁/共59頁色譜術(shù)語和流出曲線基線漂移基線噪聲保留值（相對保留值）保留時間tR

（調(diào)整保留時間tR’

）保留體積VR（調(diào)整保留體積VR’

）死時間tM死體積VM

Rentiontime(RT)Relativerentiontime(RRT)第9頁/共59頁色譜柱的分離效能指標(biāo)柱效能

–有效塔板數(shù)（neff）

–有效板高（Heff）分配系數(shù)(capacityfactor,k)

–是指在一定溫度和壓力下，組分在兩相間分配達平衡時，分配在固定相和流動相中的質(zhì)量比。分離度

–

相鄰兩組色譜峰保留值之差與兩個色譜峰峰底寬度總和之半的比值。選擇性

–固定相對于兩個相鄰組分的相對保留值。a=t’R2t’R1n=LH第10頁/共59頁（1）高柱效，高分離度（2）高柱效，低分離度（3）低柱效，低分離度（4）低柱效，高分離度第11頁/共59頁因素變化柱效率擔(dān)體粒度變大？填充均勻提高（H下降）載氣密度提高提高（H下降）壓力提高提高（H下降）流速提高在某一流速下H極小溫度升高？固定液液量下降提高（H下降）粘度下降提高（H下降）氣相色譜中影響柱效率的因素第12頁/共59頁色譜分析的基本原理組分要達到完全分離，兩峰間的距離必須足夠遠，兩峰間的距離是由組分在兩相間的分配系數(shù)決定的，即與色譜過程的熱力學(xué)性質(zhì)有關(guān)。但是兩峰間雖有一定距離，如果每個峰都很寬，以致彼此重疊，還是不能分開。這些峰的寬或窄是由組分在色譜柱中傳質(zhì)和擴散行為決定的，即與色譜過程的動力學(xué)性質(zhì)有關(guān)。因此，要從熱力學(xué)和動力學(xué)兩方面來研究色譜行為。色譜分析的目的是將樣品中各組分彼此分離。第13頁/共59頁速率理論式中：m為流動相的線速度；A，B，C為常數(shù)，A為渦流擴散項系數(shù)、B為分子擴散項系數(shù)、C為傳質(zhì)阻力項系數(shù)。VanDeemter方程的數(shù)學(xué)簡化式1956年荷蘭學(xué)者vanDeemter提出吸收了塔板理論中板高的概念考慮了組分在兩相間的擴散和傳質(zhì)過程在動力學(xué)基礎(chǔ)上較好地解釋了影響板高的各種因素該理論模型對氣相、液相色譜都適用第14頁/共59頁渦流擴散項AA與填充物的平均直徑dp的大小和填充不規(guī)則因子λ有關(guān)，與流動相的性質(zhì)、線速變和組分性質(zhì)無關(guān)。A＝2λdp分子擴散項B/u

（縱向擴散項）B＝2γDg柱內(nèi)譜帶構(gòu)型相應(yīng)的響應(yīng)信號傳質(zhì)阻力項Cu氣液色譜C＝Cm(流動相傳質(zhì)阻力系數(shù))＋Cs(固定相傳質(zhì)系數(shù))彎曲因子γ是填充柱內(nèi)流動相擴散路徑彎曲的因素，它反映了固定相顆粒的幾何形狀對自由分子擴散的阻礙情況。Dg為組分在流動相中擴散系數(shù)（cm2·s-1）。C＝Cg(氣相傳質(zhì)阻力系數(shù))＋Cl(液相傳質(zhì)阻力系數(shù))液液分配色譜第15頁/共59頁兩個組分完全分離的條件兩組分的分配系數(shù)必須有差異區(qū)域擴寬的速率應(yīng)小于區(qū)域分離的速度在保證快速分離的前提下，提供足夠長的色譜柱。第16頁/共59頁GCsystem–原理

當(dāng)多組分的混合樣品進入色譜柱后，由于吸附劑對每個組分的吸附力不同，經(jīng)過一定時間后，各組分在色譜柱中的運行速度也就不同。吸附力弱的組分容易被解吸下來，最先離開色譜柱進入檢測器，而吸附力最強的組分最不容易被解吸下來，因此最后離開色譜柱。如此，各組分得以在色譜柱中彼此分離，順序進入檢測器中被檢測、記錄下來。氣相色譜的流動相為惰性氣體，氣固色譜法中以表面積大且具有一定活性的吸附劑作為固定相。第17頁/共59頁分配系數(shù)的差異是所有色譜分離的實質(zhì)性的原因沸點：兩者相差0.6℃

苯80.1℃

環(huán)己烷80.7℃第18頁/共59頁組分能否分開，關(guān)鍵在于色譜柱；分離后組分能否鑒定出來則在于檢測器；分離系統(tǒng)和檢測系統(tǒng)是儀器的核心。

GCsystem五大系統(tǒng)：氣路系統(tǒng)進樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)溫控系統(tǒng)檢測記錄系統(tǒng)第19頁/共59頁ColumnCarriergas(He2/N2)FlowcontrollerSampleinjectorColumnovenDetectorGCsystem第20頁/共59頁組成

第21頁/共59頁GCsystem–Oven第22頁/共59頁GCsystem–CarrierGas氣體純度選擇應(yīng)掌握以下原則:1.微量分析比常量分析要求高，2.毛細管柱分析比填充柱分析要求高3.程序升溫分析比恒溫分析要求高4.濃度型檢測器質(zhì)量型檢測器要求高；5.從儀器壽命和保持儀器的高靈敏度講，中高檔儀器比低檔儀器要求高。氣路系統(tǒng)，是一個載氣連續(xù)運行、管路密閉的系統(tǒng)。常用的載氣有：氫氣、氮氣、氦氣、氬氣和空氣。氣體除空氣可由空壓機供給外，一般都由高壓鋼瓶供給。通常都要經(jīng)過凈化、穩(wěn)壓和控制、測量流量。第23頁/共59頁手動進樣自動進樣(Manualinjection)GCsystem-Injection(Automaticinjection)第24頁/共59頁GCsystem–Columns當(dāng)面對一個未知物時，先試用現(xiàn)有GC柱；如果該柱分離不理想，根據(jù)你對樣品的了解，基本原則是分析物與固定相有相似化學(xué)性質(zhì)時才會相互作用。這說明對樣品越了解，越容易找到合適的固定相。選擇GC柱：非極性分子——通常僅由C和H組成并且無偶極矩，直聯(lián)（正烷）是常見的非極性化合物的例子。比如大多數(shù)石油餾分中的烴，你可以試用SE-30毛細管色譜柱，它按沸點順序分離。極性或可極化組分樣品——能夠在中極性和/或可極化固定相色譜柱上進行分析，如有苯基或類似基團固定相，比如OV-17或OV-225柱；有芳族化合物，試著用有苯基的SE-54或OV-35柱。分離物質(zhì)通常有：炔（主要由C和H組成同時包含不飽和鍵）和芳香族化合物。高極性分子——主要由C和H組成同時也有其他原子，如：N、O、P、S或鹵素。樣品包括有醇類、胺類、硫醇類、酮類、有機鹵化物等?？梢赃x用聚乙二醇（PEG）固定相（聚乙二醇-20M

），即通常所說的WAX固定相。第25頁/共59頁Sincethesehighefficiencycolumnsalsoleadtohigherresolutions,thistechniqueisoftenreferredasHighResolutionGasChromatography(HRGC).GCsystem–ColumnsThedevelopmentofopentubularcolumns,alsocalledcapillarycolumns,inwhichastationaryphaseiscoatedontheinsidewallofafusedsilicatube,allowedthistechniquetoachieveveryhighefficiencies.Themajoradvantageofthesecolumnsformostseparationsisthefactthattheyarenotpacked,thusavoidingthemanyproblemsrelatedtotheuseofsolidpackingmaterials.Thus,opentubularcolumnshaveverylowpressuredrops(differencebetweenthepressureatthecolumnheadandatthecolumnend),allowingustoprepare

longcolumnswithsmallinternaldiameters.Thisallowstheproductionofcolumnshavingalargenumberofplates(closeto1millionplatesforacolumn100mlongwitha100umid).

PackingcolumnCapillarycolumn第26頁/共59頁GCsystem-Detector

熱導(dǎo)池檢測器

FlameIonizationDetector(FID)氫火焰離子化檢測器ThermalConductivityDetector(TCD)氫火焰離子化檢測器（FID）熱導(dǎo)池檢測器（TCD)氮磷檢測器（NPD）火焰光度檢測器（FPD）電子捕獲檢測器（ECD)……第27頁/共59頁

TheGasChromatography/MassSpectrometry(GC/MS)instrumentseparateschemicalmixturesbyGCandidentifiesthecomponentsatamolecularlevelbyMS.Itisoneofthemostaccuratetoolsforanalyzingenvironmentalsamples.Massspectrometryidentifiescompoundsbythemassoftheanalytemolecule.A“l(fā)ibrary”ofknownmassspectra,coveringseveralthousandcompounds,isstoredonacomputer./Instrumentation/GC_MS.html第28頁/共59頁ontheleftanopenmassspectrometerandontherightanopengaschromatographGS-MS第29頁/共59頁GCsystem-操作規(guī)程1.打開穩(wěn)壓電源；2.打開氮氣閥，打開凈化器上的載氣開關(guān)閥，然后檢查是否漏氣，保證氣密性良好；3.調(diào)節(jié)總流量為適當(dāng)值（根據(jù)刻度的流量表測得）；4.調(diào)節(jié)分流閥使分流流量為實驗所需的流量（用皂膜流量計在氣路系統(tǒng)面板上實際測量），柱流量即為總流量減去分流量；5.打開空氣、氫氣開關(guān)閥，調(diào)節(jié)空氣、氫氣流量為適當(dāng)值；6.根據(jù)實驗需要設(shè)置柱溫、進樣口溫度和FID檢測器溫度；7.打開計算機與工作站；8.FID檢測器溫度達到150oC以上，按FIRE鍵點燃FID檢測器火焰；9.設(shè)置FID檢測器靈敏度和輸出信號衰減；10.待所設(shè)參數(shù)達到設(shè)置時，即可進樣分析；11.實驗完畢后，先關(guān)閉氫氣與空氣，用氮氣將色譜柱吹凈后關(guān)機。

第30頁/共59頁色譜分析標(biāo)準中通常規(guī)定進樣規(guī)則：進樣順序：標(biāo)、樣、樣、標(biāo)。在選定的色譜條件下，在反復(fù)多次進入標(biāo)樣且每針間色譜峰面積在允許差范圍內(nèi)后，正式進樣分析。第31頁/共59頁GCsystem-QuantityFig.4:Chromatogramof0.01%(m/m)methanolinbiodiesel.2-propanolwasaddedasinternalstandard.Fig.5:CalibrationcurveofmethanolinbiodieselinaccordancewithDINEN14110usinginternalstandardcalibration.Table1:Biodieselsamplespikedwiththreedifferentmethanolconcentrations(n=6)/coi/cda/detail.cda?id=17440&type=Feature&chId=3&page=1第32頁/共59頁色譜定量分析常用的方法歸一化法內(nèi)標(biāo)法外標(biāo)法第33頁/共59頁色譜峰的個數(shù)樣品中所含組份的最少個數(shù)色譜峰的保留值(或位置)定性分析色譜峰的面積或峰高定量分析色譜峰的保留值及其區(qū)域?qū)挾仍u價色譜柱分離效能色譜峰兩峰間的距離評價固定相(和流動相)選擇是否合適色譜流出曲線得到的重要信息第34頁/共59頁Application第35頁/共59頁Chromatogramofpetrol第36頁/共59頁ChromatogramofpetrolSuggestidentitiesofsomeoftheunlabelledpeaks.第37頁/共59頁ChlorinatedPesticidesinWater第38頁/共59頁GCanalysisofacomplexmixtureofnaturalfattyacids(asthemethylesterderivatives)onpackedcolumnswithEGSS-X?andEGSS-Y?asstationaryphases/gc_lipid/05_gc_fa/index1.htmGCanalysisoffattyacidderivatives(1)第39頁/共59頁Separationofcis-andtrans-isomersof18:1onapackedcolumn(6mx2mmi.d.)containing15%OV-275?onChromosorbPAW-DCMS?(100-120mesh),Heliumwasthecarriergasandtheoperatingtemperaturewas220oC;withaWCOTcolumn(100mx0.25mm)coatedwithSP-2560?,withhydrogenasthecarriergasandatatemperatureof175oC.JournaloftheAssociationofOfficialAnalyticalChemistsGCanalysisoffattyacidderivatives(2)/ms/masspec.html第40頁/共59頁Method1-theenzymatic(usingultravioletlight)–hospitalsorclinicsFortestingethylalcoholordrinkingalcoholinaperson(1)340(nm)260(nm)第41頁/共59頁Method2--infraredlightasusedintheIntoxilyzerbreathtestingmachines–lawenforcementagenciesonbreathspecimens/DWI-Overview/Alcohol-Testing.aspxFortestingethylalcoholordrinkingalcoholinaperson(2)第42頁/共59頁Method3--

gaschromatographytoanalyzethealcoholinhumanblood–forensic(法醫(yī))labs(themostreliableandprecisemethod

)Fortestingethylalcoholordrinkingalcoholinaperson(3)本方法利用乙醇的易揮發(fā)性，以叔丁醇為內(nèi)標(biāo)，用頂空氣相色譜火焰離子化檢測器進行檢測；經(jīng)與平行操作的乙醇標(biāo)準品比較，以保留時間或相對保留時間定性，用內(nèi)標(biāo)法以乙醇對內(nèi)標(biāo)物的峰面積比進行定量分析。

標(biāo)準譜圖第43頁/共59頁Thetotalionchromatogram(GC/MS)oftheurineofa53-year-oldmalewithpastmedicalhistoryforhepatitisC.Drugofabusescreensbyimmunoassayperformedat20:36revealedunconfirmedpositiveresultsforbarbiturates(detectionlimit=200ng/mL)andunconfirmedpositiveresultsforcocaine(detectionlimit=300ng/mL).Drugofabuse

第44頁/共59頁Aromavolatilescollectedfromasampleofkiwifruitjuicecanbeseparatedbycapillarygaschromatography.Amidstthesemultiplepeaks,some'fingerprint'compoundshavebeenidentified.'1'isethylacetate;'4'isethanol;'12'isethylbutanoate;'16'ishexanal;'28'isE-2-hexanal;'37'ishexanol.Inthissample,peak20(E-3-hexenal)wasresponsibleforanunpleasant'off'flavourdespiteameagreprescence.Chromatogramoffruitjuice第45頁/共59頁theGC-LCCONCORDANCEsoftware

willcomparetwofingerprintsof192peaksofthesamplesoffragrances,and

presentareportononlythefounddifferencesbetweenboththesechromatograms(onlypeaks>0.1%)GCanalysisoffragrances第46頁/共59頁第47頁/共59頁格拉斯(Grasse)——世界香水之都第48頁/共59頁提問時間第49頁/共59頁FutureTrendsintheSeparationSciences1.MiniaturizationComparisonamongGCcolumns(inscale)ComparisonamongHPLCcolumns(inscale)packedcolumnscapillarycolumns第50頁/共59頁2.Neithertemperature,norpressure:electricalfield

GCthecolumntemperatureHPLCapressuregradientsolventselectrodrivenelectrophoretictechniques(hybridtechniquesthatuseaspectsofchromatographyaswellasaspectsofelectrophoresis)FutureTrendsintheSeparationSciences第51頁/共59頁3.HyphenatedsystemsLC-LC(suchas:aRP-18column+achiralcolumn)SFE-CESFE-SPE-HRGCLC-GCSPME-GC-MSSFE-SFCFutureTrendsintheSeparationSciences第52頁/共59頁4.Theroleofthesolventinseparati