實驗?zāi)磻?yīng)備課

實驗?zāi)磻?yīng)備課第1頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六21、試管凝集反應(yīng)（示教）2、ABO血型鑒定--玻片凝集反應(yīng)（1份/1人）3、乙型肝炎病毒表面抗體檢測--ELISA法(1份/1人）實驗內(nèi)容第2頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六3實驗二凝集反應(yīng)（Agglutination）第3頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六4

實驗原理

顆粒性抗原（細菌、細胞等）與相應(yīng)的抗體，或可溶性抗原/抗體吸附于與免疫無關(guān)的載體，形成致敏顆粒，與相應(yīng)抗體/抗原在一定的條件下，形成肉眼可見的凝集小塊的反應(yīng)，稱為凝集反應(yīng)。參與反應(yīng)的抗原稱凝集原（agglutinogen），抗體稱為凝集素（agglutinin）。第4頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六5凝集反應(yīng)類型直接凝集反應(yīng)（directagglutination）

顆粒性抗原與相應(yīng)抗體直接結(jié)合，所出現(xiàn)的凝集現(xiàn)象，包括試管凝集反應(yīng)、玻片凝集反應(yīng)。間接凝集反應(yīng)（indirectagglutination）

將可溶性抗原（或抗體）吸附在與免疫無關(guān)的載體顆粒表面，使此形成致敏顆粒，然后再與相應(yīng)抗體（或抗原）混合，在適當(dāng)條件下，發(fā)生凝集現(xiàn)象，稱為間接凝集反應(yīng)或被動凝集反應(yīng)。第5頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六6第6頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六7

操作步驟于試管架上列7支試管。1.每管內(nèi)分別加入生理鹽水0.5ml。2.血清稀釋：第一管加入1:10待檢血清0.5ml，混勻后取0.5ml，加入第二管內(nèi)，依此類推，直到第6管，混勻后從第6管中吸出0.5ml棄去；第7管為對照管。

0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml（一）試管凝集反應(yīng)1:201:401:801:1601:3201:640第7頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六83.每管加傷寒桿菌“H”抗原0.5ml。4.混勻，置52℃水浴4h，取出后，置室溫過夜，次日讀取凝集效價。第8頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六9結(jié)果觀察不同程度的凝集現(xiàn)象：＋＋＋＋：液體澄清，細菌全部凝集（100%），沉于管底形成大片凝集物。＋＋＋：液體基本澄清，細菌大部分凝集（75%左右），管底的凝集物稍小。＋＋：液體半澄清，稍顯渾濁（凝集物50%左右），但仍可見明顯凝集塊。－：液體渾濁，無凝集塊，輕搖試管，有細菌呈線狀浮起。

第9頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六10效價：抗原抗體反應(yīng)時，發(fā)生明顯反應(yīng)的最高血清稀釋度，又稱滴度。凝集效價：凝集反應(yīng)時，能使50%或以上的抗原發(fā)生凝集的最高血清稀釋度。

第10頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六11（二）玻片凝集反應(yīng)

已知抗血清與未知顆粒性抗原置于清潔玻片上，在一定的條件下，若兩者相對應(yīng)，則會發(fā)生凝集。本方法主要用于抗原的定性分析，如菌種鑒定、ABO血型鑒定等。第11頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六ABO血型系統(tǒng)12第12頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六13ABO血型鑒定步驟紅細胞懸液的制備（用于血型鑒定及ELISA實驗）

1.取EP管1支，加入5滴生理鹽水2.消毒耳垂或手指皮膚3.用采血針采1-2滴血，加入盛有生理鹽水的EP管中混勻

4.2000rpm，離心3min

5.取紅細胞懸液用于ABO血型鑒定6.取已加有抗A血清與抗B血清載玻片1張，分別加入待測抗原各1滴，并用牙簽混勻。7.置室溫5分鐘左右觀察結(jié)果。取上清用于ELISA實驗第13頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六ABO血型鑒定的判斷B型抗A型標(biāo)準血清抗B型標(biāo)準血清抗A型標(biāo)準血清抗B型標(biāo)準血清A型抗A型標(biāo)準血清抗B型標(biāo)準血清O型抗A型標(biāo)準血清抗B型標(biāo)準血清AB型示意圖第14頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六15注意事項用牙簽研磨時，注意防止將抗A血清帶到抗B血清中，反之亦然。如果凝集現(xiàn)象不太明顯時，可用顯微鏡觀察。第15頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六16免疫標(biāo)記技術(shù)

將已知抗體或抗原標(biāo)記上易示蹤物質(zhì)（如酶、熒光素、放射性同位素、膠體金等），通過檢測標(biāo)記物來反映有無抗原抗體反應(yīng)，從而測出微量的抗原或抗體。第16頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六17實驗五酶聯(lián)免疫吸附試驗

（EnzymeLinkedImmunosorbsentAssay,ELISA）【原理】利用標(biāo)記技術(shù)將酶標(biāo)記到抗體（抗原）上，使待檢物中相應(yīng)的抗原（抗體）與酶標(biāo)記抗體（抗原）發(fā)生特異性反應(yīng)。在遇到相應(yīng)的酶底物時，酶分解底物，生成有顏色的產(chǎn)物。根據(jù)顏色的深淺,可以判斷待檢物中有無特異的抗原（抗體）以及量的多少。檢測方法有直接法、間接法、雙抗體法和抗原競爭法。第17頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六18直接ELISA包被(未知抗原）加入酶標(biāo)抗體洗板加底物加終止液包被(已知抗原）加入待檢標(biāo)本（未知抗體）加入酶標(biāo)第二抗體﹙抗抗體﹚洗板加底物加終止液間接ELISA雙抗體夾心法包被(已知抗體）加入待檢標(biāo)本（未知抗原）加入酶標(biāo)抗體洗板加底物加終止液第18頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六19乙型肝炎病毒表面抗體的檢測

——間接ELISA法【測定原理】

采用純化HBsAg包被反應(yīng)板，加入待檢標(biāo)本，當(dāng)標(biāo)本中存在抗-HBs時，該抗體與包被HBsAg結(jié)合，再加入酶標(biāo)羊抗人IgG抗體。最后形成HBsAg-抗HBs-酶標(biāo)抗抗體復(fù)合物，加入底物產(chǎn)生顯色反應(yīng)。第19頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六20無菌采血，離心2000rpm,3min，取上清作為待測標(biāo)本(見玻片凝集實驗)每孔加入酶結(jié)合物1滴，37℃孵育30min反應(yīng)板中各加入待測標(biāo)本1滴，同時設(shè)陰性、陽性、空白對照孔(NS)（反應(yīng)板已用純化HBsAg包被

）

手工洗板，棄液拍干，重復(fù)5次

每孔加入顯色劑A液、B液各1滴，置37℃孵育15分鐘

每孔加入終止