實(shí)驗(yàn)四血清蛋白的醋酸纖維薄膜電泳

實(shí)驗(yàn)四血清蛋白的醋酸纖維薄膜電泳4/20/20231第1頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期六【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹空莆针娪痉ǚ蛛x血清蛋白質(zhì)的原理掌握血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳的操作方法及臨床意義4/20/20232第2頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期六電泳：帶電粒子在電場(chǎng)的作用下，向著與其電性相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象電泳技術(shù)：利用電泳現(xiàn)象對(duì)混合物進(jìn)行分離分析的技術(shù)【實(shí)驗(yàn)原理】4/20/20233第3頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期六H＋OH－H＋OH－pH>pIpH=pIpH<pI4/20/20234第4頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期六電泳速度:帶電粒子在電場(chǎng)中運(yùn)動(dòng)時(shí)，單位電場(chǎng)強(qiáng)度內(nèi)粒子運(yùn)動(dòng)的速度，以u(píng)表示，即

V—粒子運(yùn)動(dòng)的速度X—電場(chǎng)強(qiáng)度Q—粒子所帶電荷r—粒子的半徑η—介質(zhì)的粘度4/20/20235第5頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期六影響電泳速度的因素1.樣品本身：分子形狀：形狀越小，與支持物介質(zhì)摩擦越小，u越大。球形分子>纖維狀分子Q越多，u越大；分子小，r越小，u越大；4/20/20236第6頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期六2.緩沖溶液：pH值：(pH-pI)越大，Q越多，u越大離子強(qiáng)度(I)：I越大，電動(dòng)電勢(shì)越小，u越??；I越小，電動(dòng)電勢(shì)越大，u越大，但樣品易擴(kuò)散。離子強(qiáng)度如果過(guò)低，緩沖液的緩沖容量小，不易維持pH恒定選擇離子強(qiáng)度時(shí)要兩者兼顧，一般離子強(qiáng)度的選擇范圍在0.02～0.2之間。4/20/20237第7頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期六電場(chǎng)強(qiáng)度：電泳支持物上每厘米的電位降，也稱電勢(shì)梯度。3.電場(chǎng)強(qiáng)度(X)X越大，u越快。支持物越短，X越大，u越快。電場(chǎng)強(qiáng)度越大或支持物越短，電流將隨之增加，產(chǎn)熱也增加，影響分離效果。在進(jìn)行高壓電泳的時(shí)候必須用冷卻裝置，否則可引起蛋白質(zhì)等樣品發(fā)生熱變性而無(wú)法分離4/20/20238第8頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期六4.支持介質(zhì)：①纖維薄膜(玻璃纖維薄膜，醋酸纖維薄膜)②凝膠(瓊脂糖凝膠，聚丙烯酰胺凝膠)4/20/20239第9頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期六負(fù)極正極－－－－－－－－表面帶負(fù)電荷帶正電荷的水層攜帶粒子向負(fù)極移動(dòng)

如果樣品原本是移向負(fù)極的，則泳動(dòng)的速度加快；如果樣品原本是移向正極的，則泳動(dòng)的速度減慢。電滲作用：電滲：在電場(chǎng)作用下液體對(duì)固體支持物相對(duì)移動(dòng)的現(xiàn)象。＋＋＋＋＋＋＋＋以紙電泳為例:4/20/202310第10頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期六區(qū)帶電泳的分類(lèi)（一）支持物物理性狀1．濾紙及其它纖維(如玻璃纖維、醋酸纖維、聚氯乙烯纖維薄膜)電泳2．粉末電泳：如纖維素粉、淀粉電泳；3．凝膠電泳：如瓊脂、瓊脂糖、聚丙烯酰胺凝膠電泳；4．絲線電泳：尼龍絲、人造絲電泳。4/20/202311第11頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期六（二）支持物裝置形式：1．平板式電泳：支持物水平放置；2．垂直板式電泳：聚丙烯酰胺凝膠可做成垂直板式電泳；3．垂直柱式電泳：聚丙烯酰胺盤(pán)狀電泳4/20/202312第12頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期六(三)pH連續(xù)性：1．連續(xù)pH電泳：即整個(gè)電泳過(guò)程pH保持不變，如常用的紙電泳、醋酸纖維薄膜電泳等。2．非連續(xù)pH電泳：緩沖液和電泳支持物間有不同的pH的電泳，如聚丙烯酰胺凝膠盤(pán)狀電脈，等電聚焦電泳等4/20/202313第13頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期六醋酸纖維薄膜為支持物pH=8.6的巴比妥緩沖液血清蛋白的pI均小于8.6負(fù)電荷電泳時(shí)向正極移動(dòng)由于遷移率不同而被分離4/20/202314第14頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期六γβα2α1清蛋白分子越小，泳動(dòng)速度越快帶電量越多，泳動(dòng)速度越快4/20/202315第15頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期六膜條經(jīng)過(guò)氨基黑10B染色后顯出清晰色帶。2.定性,定量各色帶蛋白質(zhì)含量與染料結(jié)合量基本成正比?？蓪⒏魃珟Ъ糸_(kāi)，分別溶于堿性溶液中。用分光光度法計(jì)算各種蛋白質(zhì)的百分?jǐn)?shù)。4/20/202316第16頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期六醋酸纖維薄膜：醋酸纖維加工的細(xì)密且薄的微孔膜廣泛應(yīng)用醫(yī)學(xué)臨床各種生物分子的分離分析血清蛋白、血紅蛋白、球蛋白脂蛋白、糖蛋白甲胎蛋白、類(lèi)固醇及同工酶等4/20/202317第17頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期六優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單快速缺點(diǎn)分辨率較低（聚丙烯酰胺凝膠電泳，PAGE）不適于制備（薄膜厚度約10～100μm，樣品用量很少）4/20/202318第18頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期六【器材及試劑】1、器材：醋酸纖維薄膜（2×8cm）常壓電泳儀竹鑷點(diǎn)樣器人血清或雞血清粗濾紙2、試劑：巴比妥緩沖液氨基黑10B0.25染色液漂洗液透明液4/20/202319第19頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期六[操作]（一）儀器與薄膜的準(zhǔn)備1、醋酸纖維素薄膜的潤(rùn)濕與選擇2.電泳槽的準(zhǔn)備3、電極槽的平衡4/20/202320第20頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期六（二）點(diǎn)樣取出薄膜，無(wú)光澤面向上平放在濾紙上點(diǎn)樣區(qū)距陰極端1.5cm血清均勻涂在點(diǎn)樣器表面將點(diǎn)樣器輕輕印在點(diǎn)樣區(qū)內(nèi)，使血清完全滲透至薄膜內(nèi)形成一定寬度、粗細(xì)均勻的直線

實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵，是獲得具有清晰區(qū)帶的電泳圖譜的重要環(huán)節(jié)4/20/202321第21頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期六（三）電泳點(diǎn)樣端薄膜平貼陰極電泳槽支架濾紙橋(點(diǎn)樣面朝下)

另一端平貼在陽(yáng)極端支架

要求：薄膜緊貼濾紙橋并繃直，薄膜之間相隔幾毫米蓋電泳槽蓋，平衡10min打開(kāi)電源開(kāi)關(guān)，調(diào)節(jié)電流強(qiáng)度為0.3mA/片，通電10min調(diào)節(jié)電流強(qiáng)度為0.5mA/片，電泳60~90min

電泳后調(diào)節(jié)旋鈕電流為O，關(guān)閉電泳儀切斷電源4/20/202322第22頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期六DYY-5型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀DYY-Ⅲ型電泳槽4/20/202323第23頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期六4/20/202324第24頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期六4/20/202325第25頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期六【實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)】不要用手觸摸纖維素膜注意區(qū)分醋酸纖維素薄膜的光面和毛面點(diǎn)樣位置要在1.5厘米以內(nèi)，不要距邊緣太近不要重復(fù)點(diǎn)樣膜放進(jìn)電泳槽時(shí)，將點(diǎn)樣面向下，點(diǎn)樣端靠近陰極4/20/202326第26頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期六用點(diǎn)樣器點(diǎn)樣時(shí)不要點(diǎn)的太多，但也不能太少線條均勻，用力水平。電泳槽放膜條支架上盡量不要有緩沖液4/20/202327第27頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期六（四）染色和漂洗取出薄膜，直接浸入染色液中，染色5min自來(lái)水沖洗，漂洗液漂洗更換3次漂洗液，脫去顏色，得到色帶清晰的電泳圖譜4/20/202328第28頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期六【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】繪出電泳圖譜并標(biāo)明各條帶含義4/20/202329第29頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期六4/20/202330第30頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期六臨床意義血漿蛋白是血漿最主要的固體成分，含量60～80g/L絕大部分由肝臟合成，僅γ球蛋白由漿細(xì)胞合成

正常值： 白蛋白57％~72％，α1球蛋白2％~5％α2球蛋白4％~9％，β球蛋白6.5％~12％γ球蛋白12％—20％4/20/202331第31頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期六可能相關(guān)疾病清蛋白α1球蛋白α2球蛋白β球蛋白γ球蛋白骨髓瘤↑*腎病綜合癥↓↑*↑*腎炎↑*↑肝硬化↓↑*急性肝壞死↓*↑↑↑↑傳染性肝炎↓↑*↑*急性感染初期↑*↑*↑*慢性炎癥/感染后期↑*低球蛋白血癥↓*臨床上還可用A/G比來(lái)表示清球蛋白的量的關(guān)系：正常人A/G＝1.5～2.54/20/202332第32頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期六血漿蛋白的主要功能維持血漿膠體滲透壓調(diào)節(jié)血漿pH值，維持酸堿平衡運(yùn)輸營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、代謝物、激素、藥物及金屬離子等免疫作用4/20/202333第33頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期六白蛋白降低：

合成能力不足：肝功能下降

合成原料不足：饑餓，腹瀉，腫瘤晚期

去路增加：腎病綜合癥，嚴(yán)重?zé)齻?，大出血?/p>

消耗過(guò)多：糖尿病，甲亢等4/20/202334第34頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期六球蛋白增加：感染，多發(fā)性骨髓瘤，自身免疫性疾病等球蛋白降低：皮質(zhì)功能亢進(jìn)，免疫缺陷病4/20/202335第35頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期六肝?。篈,α2-G,β-G,α1-G,γ-G，A/G下降甚至倒置腎?。涸缙冢哼x擇性蛋白尿，Mw較小蛋白質(zhì)丟失，含量下降。如白蛋白后期：非選擇性蛋白尿，Mw較小的蛋白質(zhì)丟失，含量下降分子量較大的蛋白質(zhì)（如γ-球蛋白）丟失，含量下降4/20/202336第36頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期六【實(shí)驗(yàn)思考】1．電泳時(shí)，點(diǎn)樣端置于電場(chǎng)的正極還是負(fù)極？為什么？2．電泳后，泳動(dòng)在最前面的是何種蛋白質(zhì)？各譜帶為何種成分？請(qǐng)分析原因4/20/202337第37頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期六【常見(jiàn)問(wèn)題及原因】1.電泳圖譜不齊：點(diǎn)樣時(shí)血清滴加不均2.電泳圖譜出現(xiàn)條痕：點(diǎn)樣后薄膜過(guò)干，或電泳槽密閉性不