離心技術(shù)與細(xì)胞器分離

離心技術(shù)與細(xì)胞器分離第1頁/共23頁離心技術(shù)與細(xì)胞器的分離第2頁/共23頁一

實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、以分離葉綠體、細(xì)胞核為例,掌握離心機(jī)的操作技術(shù)及兩種不同的離心方法：差速離心法、密度梯度離心法;

2、光鏡鑒定各種細(xì)胞器的提取情況及了解葉綠體、細(xì)胞核的形態(tài)。第3頁/共23頁二實(shí)驗(yàn)原理離心技術(shù)（centrifugaltechnique）是根據(jù)顆粒在作勻速圓周運(yùn)動(dòng)時(shí)都會(huì)受到一個(gè)向外的力這一原理而發(fā)展起來的一種分離技術(shù)。離心力（centrifugalforce，F(xiàn)c）相對離心力（relativecentrifugalforce，RCF）第4頁/共23頁離心力（centrifugalforce，F(xiàn)c）離心力是顆粒在一定角度速度下作圓周運(yùn)動(dòng)時(shí)受到的一個(gè)向外的力。離心力（Fc）的大小取決于角速度與旋轉(zhuǎn)半徑，即：

Fc=mω2r其中ω是旋轉(zhuǎn)角速度，以弧度/秒為單位；r是顆粒離開旋轉(zhuǎn)中心的距離，以cm為單位；m是質(zhì)量，以g為單位。第5頁/共23頁相對離心力（relativecentrifugalforce，RCF）

又稱相對離心加速度，是指離心力相當(dāng)于重力加速度的倍數(shù)。在文獻(xiàn)中常用“相對離心力”或“數(shù)字×g”表示。RCF=(mω2r)/(mg)=1.119×10-5n2r式中r為離心轉(zhuǎn)子的半徑距離，指離心管的重心至轉(zhuǎn)軸中心間的距離，以cm為單位；g為地球重力加速度（980cm/sec2）；n為轉(zhuǎn)子每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)（rpm）。第6頁/共23頁離心力的轉(zhuǎn)換列線圖

第7頁/共23頁離心機(jī)制備性分析性分析性超速離心機(jī)普通離心機(jī)冰凍離心機(jī)臺(tái)式（或地面式）普通離心機(jī)大容量冰凍離心機(jī)小于0.6萬轉(zhuǎn)/分高速冰凍離心機(jī)0.6-2.5萬超速冰凍離心機(jī)2.5-8萬或更高

概述臺(tái)式高、超速離心機(jī)0.6-10萬轉(zhuǎn)/分以上

離心機(jī)的基本分類第8頁/共23頁離心機(jī)的結(jié)構(gòu)

離心機(jī)的主要部件為轉(zhuǎn)頭、主軸、電動(dòng)機(jī)和傳動(dòng)裝置、制動(dòng)器、外殼和機(jī)座。第9頁/共23頁離心機(jī)的轉(zhuǎn)頭主要有：角度轉(zhuǎn)頭（angle-headedrotors）、甩平式水平轉(zhuǎn)頭（swing-outrotors）/吊桶式轉(zhuǎn)頭（swingingbucketrotors）

水平轉(zhuǎn)頭

角度轉(zhuǎn)頭第10頁/共23頁離心技術(shù)類型

常用離心技術(shù)一般包括：差速離心法（differentialvelocitycentrifugation）密度梯度離心法(densitygradientcentrifugation)。第11頁/共23頁差速離心法（differentialvelocitycentrifugation）采用逐漸增加離心速度或低速和高速交替進(jìn)行離心，使沉降系數(shù)不同的顆粒在不同的分離速度及不同的離心時(shí)間下分批分離的方法，稱為差速離心法。常用于從組織勻漿中分離各種細(xì)胞器。第12頁/共23頁Figure8-9MolecularBiologyoftheCell(?GarlandScience2008)Thepreparativeultracentrifuge第13頁/共23頁差速離心法（differentialvelocitycentrifugation）第14頁/共23頁密度梯度離心原理：當(dāng)不同顆粒存在浮力密度差時(shí)，在離心力場下，在密度梯度介質(zhì)中，顆粒或向下沉降，或向上浮起，一直移動(dòng)到與它們各自的密度恰好相等的位置，在這里顆粒沒有重量，不管離心多長時(shí)間，它們再也不移動(dòng)了，形成一系列密度區(qū)。從而使不同浮力密度的物質(zhì)得到分離。等密度梯度離心一般常用CsCl、RuCl、蔗糖、甘油等做介質(zhì)。此法一般應(yīng)用于物質(zhì)的大小相近，而密度差異較大時(shí)。常用來分離提取核酸、亞細(xì)胞器和質(zhì)粒。第15頁/共23頁Densitygradientcentrifugation

第16頁/共23頁Densitygradientcentrifugation

第17頁/共23頁第18頁/共23頁實(shí)驗(yàn)步驟1．將材料用蒸餾水洗凈。用濾紙吸干水后,去葉脈,稱取2克葉片,用剪刀剪碎后放入研缽。2．量取10ml勻漿buffer，先向研缽中倒入5ml后開始研磨。3．四層紗布過濾，收集過濾液到10ml離心管中，再將剩下的5ml勻漿buffer沖洗研缽后也過濾到管中，5000rpm離心5分鐘,去上清。4．加入0.5%TritonX-1002.5ml,混勻，振蕩后靜置3分鐘.5000rpm離心5分鐘，去上清。5．加入1mlCSKbuffer振蕩混勻,可以用槍頭輕輕吹打沉淀使其溶解.第19頁/共23頁6．濾膜過濾（300目）,去掉未裂解的原生質(zhì)體及裂解的細(xì)胞膜內(nèi)溶物等大塊雜質(zhì)，收集過濾液。

以上步驟所提到的細(xì)胞核不純,其中混雜有原生質(zhì)體、線粒體、葉綠體,下面采用蔗糖密度梯度離心分離細(xì)胞核和葉綠體。7.把含有2.3M蔗糖的CSKbuffer3ml加至于離心管底部.8.再把3ml60%percollCSKbuffer輕輕的平鋪于7的溶液上方,用移液槍加時(shí)一定要小心順著管壁把一溶液平鋪于另一溶液之上.這時(shí)應(yīng)該能觀察到溶液明顯的分層現(xiàn)象.9.然后把6中過濾溶液輕輕的平鋪于8的溶液上方。觀察分層現(xiàn)象。10.3200g離心32分鐘，溶液梯度層重新分布。11.分別吸取一些各層的溶液進(jìn)行改良品紅苯酚染色、鏡檢。觀察不同大小不同密度的細(xì)胞器的分布情況以及他們的形態(tài)特征。

第20頁/共23頁試劑

勻漿buffer：5mMMES,6.8mMCaCl2,11mMKH2PO4,0.3M山梨醇,0.3M甘露醇,0.4％PVP-30．

CSKbuffer:100mMKCl,3mMMgCl2,1mMEGTA(PH8.0),10mMPIPES(PH6.8),300mMsucrose.

60%percollCSKbuffer

：60%percoll,100mMKCl,3mMMgCl2,1mMEGTA(PH8.0),10mMPIPES(PH6.8),300mMsucrose.

2.3M