發(fā)酵工程課程論文

發(fā)酵工程結(jié)課論文題目：維生素C的發(fā)酵姓名：XXX專業(yè)：食品科學(xué)與工程班級(jí)：學(xué)號(hào)：任課教師：XXX2012年10月18日維生素c的發(fā)酵摘要：維生素C的發(fā)酵是指通過(guò)發(fā)酵作用將原料轉(zhuǎn)化為維生素C,再通過(guò)生物分離技術(shù)將其從發(fā)酵液中分離提純，獲取滿足要求的維生素C產(chǎn)品。維生素C的發(fā)酵過(guò)程中包含菌種的培育、菌種的保藏、種子的制備、發(fā)酵動(dòng)力學(xué)、發(fā)酵環(huán)節(jié)的控制和染菌及防治六個(gè)方面。概括地說(shuō)，在發(fā)酵的整個(gè)過(guò)程中要選育出優(yōu)秀的發(fā)酵菌種并采取合理有效的方法予以保藏，保持其優(yōu)良性狀；在實(shí)際生產(chǎn)時(shí)要對(duì)菌種進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，滿足生產(chǎn)上對(duì)發(fā)酵菌的數(shù)量要求；對(duì)于發(fā)酵還應(yīng)全面的考慮發(fā)酵的消耗、產(chǎn)率問(wèn)題，并通過(guò)適當(dāng)?shù)目刂品椒ㄌ岣咝?；染菌和污染是發(fā)酵過(guò)程中的一個(gè)非常嚴(yán)重的問(wèn)題，需要嚴(yán)格控制，頻繁檢測(cè)確保發(fā)酵罐安全，避免或較小損失。關(guān)鍵字：維生素C發(fā)酵、發(fā)酵菌種、發(fā)酵控制中圖分類號(hào)： 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：AThefermentationofvitaminCAbstract:ThefermentationofvitaminCisdefinedtoturnrawmaterialintovitaminCthroughmicrobezymoses.ThenseparatevitaminCfromfermentationbrothandgetpurevitaminC.Courseoffermentationcontainscultureraising,culturepreservation,seminalpreparation,fermentationkinetics,controloffermentationsegmentandpollution&prevention.Ingeneral,breedinggoodzymogenandpreserveitinreasonableway;raisingit'snumbertomeetthedemand;controllingtheprocesstoincreaseefficiency.Checkingallsegmenttoavoidpollutionorremedyingtoreduceloss.Keywords:thefermentationofvitaminC,zymogen,fermentationcontrol.0前言維生素C作為人體營(yíng)養(yǎng)素之一的維生素的一個(gè)分支，對(duì)人體有著非常重要的作用。維生素C(VitaminC,VC)是一種水溶性維生素，又名L—抗壞血酸(L—ascorbicacid),能參與體內(nèi)多種羥化反應(yīng)和氧化還原反應(yīng)，是一類重要的細(xì)胞代謝氧化還原化合物，在人體中起著必不可少的生理作用，在醫(yī)藥、食品、飼料、化妝品等諸多領(lǐng)域具有重要而廣泛的用途。隨著生活水平的提高，人們對(duì)維生素的作用認(rèn)識(shí)的深入，人們已不滿足于自身合成和從食物中獲取維生素的量，維生素的消費(fèi)量越來(lái)越多，這勢(shì)必促成了維生素發(fā)酵生產(chǎn)工業(yè)的形成與發(fā)展，維生素C的發(fā)酵便是其中之一。發(fā)酵機(jī)制目前，維生素C發(fā)酵主要有葡萄糖發(fā)酵和山梨醇發(fā)酵，工業(yè)中使用的發(fā)酵方法分別為萊氏法和二步發(fā)酵法。1.1葡萄糖發(fā)酵葡萄糖發(fā)酵是以葡萄糖為原料生產(chǎn)維生素C的發(fā)酵方法。該方法包括萊氏法、新二步發(fā)酵法和一步發(fā)酵法，但后兩種由于技術(shù)等原因尚未應(yīng)用到生產(chǎn)中，這里將簡(jiǎn)要介紹介紹一下。氏法是一種化學(xué)合成與一步發(fā)酵相結(jié)合的生產(chǎn)方法，生產(chǎn)工藝路線成熟，生產(chǎn)原料便宜易得，產(chǎn)品質(zhì)量好，收率高。因此至今瑞士的Roche、日本的Takeda、德國(guó)的E.Merk和BASF等國(guó)外生產(chǎn)維生素的主要公司均采用該方法。該方法生產(chǎn)工序多、過(guò)程長(zhǎng)，難以連續(xù)化操作；使用大量有毒、易燃化學(xué)藥品，造成環(huán)境污染等。為此，自上世紀(jì)60年代開(kāi)始，世界各地的科學(xué)家都致力于簡(jiǎn)化該生產(chǎn)路線的研究。[1,20,其21合]成路線如圖1。D-葡的糖二LD-山梨醇 *L-山梨fe — *雙內(nèi)酮壬-山梨 ~*冊(cè)壓 [()| 1115()4-SO^ NiS()4Ut0 仃學(xué)轉(zhuǎn)仃雙丙酮4廂4-占洛糖酸亠T2廂亠-占洛糖酸一亠T維工素C圖1.萊氏合成路線

新二步發(fā)酵法（相對(duì)于二步發(fā)酵法而言，將在后面對(duì)二步發(fā)酵法進(jìn)行介紹）也稱葡萄糖串聯(lián)發(fā)酵法,是由D-葡萄糖依次經(jīng)歐文氏菌、棒桿菌發(fā)酵生成維生素C。該法工序簡(jiǎn)單，但在原料和菌體處理等方面均有待改進(jìn)提高，尚未能應(yīng)用到工業(yè)生產(chǎn)中去。一步發(fā)酵法是在新二步發(fā)酵法的基礎(chǔ)上，利用生物技術(shù)，采用重組DNA技術(shù)，構(gòu)成工程菌，實(shí)現(xiàn)從D-葡萄糖到2-KGL的一步發(fā)酵。⑴目前，該方法尚處于研究之中。山梨醇發(fā)酵山梨醇發(fā)酵上世紀(jì)70年代初，我國(guó)的尹光琳等發(fā)明了二步發(fā)酵法的新工藝，它是目前唯一成功應(yīng)用于VC工業(yè)生產(chǎn)的微生物轉(zhuǎn)化法［1］，是通過(guò)生物發(fā)酵得到2-酮-L-古洛糖酸，這有別于萊氏合成法中的化學(xué)合成，其發(fā)酵成分較萊氏合成法更多。［20-22］其發(fā)酵路線如圖2（僅為發(fā)酵過(guò)程的一部分，其余過(guò)程與萊氏法相同）。CH^OH——HHOho+hHO-ch2oh=0J_OH生黑醋桿菌；CH^OH——HHOho+hHO-ch2oh=0J_OH生黑醋桿菌；_H 'ch2ohH0——HH-pOHHO假單胞菌[0]D-山梨醇—HCH^OHCOONa二oaHO一H732氫型樹(shù)脂H——OHHO斗HCH2OH2-ER-L-古洛糖酸鈉COOH=0HO——HH——OH

HO Hch2oh2-酮-L-古洛糖酸說(shuō)明：目前生產(chǎn)中假單抱桿圖2.二步發(fā)酵法發(fā)酵路線本文將以D-葡萄糖為開(kāi)端，重點(diǎn)介紹二步發(fā)酵生產(chǎn)維生素C的過(guò)程，其中包括菌種的培育、菌種的保藏、種子的制備、發(fā)酵動(dòng)力學(xué)、發(fā)酵環(huán)節(jié)的控制和染菌及防治等方面的內(nèi)容。菌種的培育二步發(fā)酵生產(chǎn)維生素C過(guò)程中用到的菌系為混合菌系［23］，包含的發(fā)酵菌種類很多，這里將主要介紹巨大芽抱桿菌菌種的培育。（由于生黑醋桿菌的相關(guān)資料查不到，這里就不進(jìn)行論述了，可以考慮從相關(guān)機(jī)構(gòu)或科研院所直接獲取現(xiàn)成的生黑醋酸桿菌，這也是獲取菌種的一種方法）。菌種特性巨大芽抱桿菌：桿狀，末端圓；單個(gè)或呈短鏈排列，1.2?1.5X2.0?4.0微米；能運(yùn)動(dòng)；芽抱1.0?1.2X1.5?2.0微米，橢圓形，中生或次端生；能夠液化明膠慢、胨化牛奶、水解淀粉、不還原硝酸；巨大芽抱桿菌為產(chǎn)抱桿菌，且為革蘭氏陽(yáng)性菌及好氧菌，也為常見(jiàn)的油中腐生菌。菌種的分離從巨大芽抱桿菌的特性分析，可以從腐敗的食用油中分離巨大芽抱桿菌。具體方法是取適量腐敗食用油，將其放入適合巨大芽抱桿菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)液中劇烈震蕩，使其中的細(xì)菌大量進(jìn)入到培養(yǎng)液中稀釋溶液到適當(dāng)?shù)谋稊?shù)，在合適的培養(yǎng)基上涂布、培養(yǎng)，長(zhǎng)出純的的單菌落，對(duì)單菌落中細(xì)菌進(jìn)行分析，確定巨大芽抱桿菌。分離培養(yǎng)基成分（%）：酵母膏0.3、牛肉膏0.3、玉米漿0.3、蛋白胨1.0、KH2PO40.1、MgSO40.04、尿素0.1、CaCO30.1、山梨糖2.0、瓊脂2.3、10ppmFeSO40.1mL/L、pH=607~7.0［2］。菌種的檢驗(yàn)接下來(lái)進(jìn)行的步驟就是對(duì)純菌落中的細(xì)菌進(jìn)行檢驗(yàn)，確定巨大芽抱桿菌。進(jìn)行該步驟在目前比較先進(jìn)的方法是多重PCR技術(shù)檢測(cè)。其基本方法是挑取培養(yǎng)基上單個(gè)菌落，接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯液體，30r快速振搖培養(yǎng)16h，,離心取沉淀，采用硅藻土吸附法快速提取各菌株的基因組DNA,作為PCR的模板⑶。然后對(duì)所獲取的DNA利用PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）進(jìn)行擴(kuò)增，獲取足夠量的DNA,以便進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序工作可送到專門服務(wù)公司進(jìn)行，如海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。若要對(duì)菌種的形狀加以改良，提高效率或增強(qiáng)環(huán)境適應(yīng)能力等，可通過(guò)誘變育種、雜交育種、基因工程育種或人工選擇等方法進(jìn)行，如通過(guò)基因工程育種獲得了能夠生產(chǎn)胰島素的菌種，利用射線照射、太空失重育種等。由于本文未涉及菌種改良就不詳細(xì)敘述菌種改良這一方面的內(nèi)容。菌種的保藏菌種的保藏是指將有用的微生物以特定培養(yǎng)形態(tài)在特定的環(huán)境條件下存放，以保持種的存活、純粹和遺傳性狀的穩(wěn)定。原理：根據(jù)微生物的生理生化特性，人為地創(chuàng)造條件，使微生物處于代謝不活潑，生長(zhǎng)繁殖受到抑制的休眠狀態(tài)，以減少菌種的變異。意義：可以避免在傳代過(guò)程中容易發(fā)生變異、污染甚至死亡，生產(chǎn)菌種的退化，防止優(yōu)良菌種丟失。生黑醋桿菌和巨大芽孢桿菌的保藏屬于常規(guī)方法，人為地創(chuàng)造條件（低溫、干燥、缺氧、低營(yíng)養(yǎng)等），使性狀優(yōu)良的微生物處于代謝不活潑，生長(zhǎng)繁殖受到抑制的休眠狀態(tài)，以減少菌種變異的幾率。同時(shí)在保藏過(guò)程中要避免對(duì)生黑醋桿菌和巨大芽孢桿菌的生命活性造成損傷。常用的保藏方法有懸液包藏法（寡營(yíng)養(yǎng)條件下的保藏）、傳代保藏法（易發(fā)生培養(yǎng)基干枯、菌體自溶、基因突變，比較適合試驗(yàn)室中短時(shí)間保藏）、礦物油中浸沒(méi)保藏、干燥載體保藏（如沙土管干燥保藏法）、固體曲（麩曲）保藏法、冷凍保藏法（又分為普通冷凍保藏技術(shù)（-20°C）超低溫冷凍保藏技術(shù)（-60?-80°C）液氮冷凍保藏技術(shù)（-130?-196°C））。當(dāng)然，要想做到很好的將菌種保藏起來(lái)時(shí)很不容易的，有專門的菌種保藏機(jī)構(gòu)可以提供保藏服務(wù)，應(yīng)綜合考慮各方面的因素決定選用何種保藏方式。種子的制備種子擴(kuò)大培養(yǎng)又稱種子制備，由保藏的生產(chǎn)菌種（砂土管、冷凍干燥管中處休眠狀態(tài)）開(kāi)始，經(jīng)過(guò)逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)（試管斜面活化，扁瓶或搖瓶及種子罐），最后獲得供生產(chǎn)車間發(fā)酵罐接種的數(shù)量足和質(zhì)量?jī)?yōu)的種子（純種培養(yǎng)物）的過(guò)程。在維生素二步發(fā)酵菌種子的擴(kuò)大培養(yǎng)過(guò)程中不僅要獲得足夠多的發(fā)酵菌數(shù)量，還要逐步改變發(fā)酵條件，使得發(fā)酵菌能夠適應(yīng)發(fā)酵罐環(huán)境，確保生產(chǎn)能順利進(jìn)行。以巨大芽抱桿菌為例來(lái)說(shuō)明二步發(fā)酵法生產(chǎn)維生素C過(guò)程中種子的制備方法?，F(xiàn)將已有的少量菌種在條件非常適宜的種子培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，增加其數(shù)量，該階段通常被稱為實(shí)驗(yàn)室種子制備階段；得到一定數(shù)量的種子后，就可以將其接種到種子罐中，進(jìn)一步擴(kuò)大種子數(shù)量，同時(shí)馴化種子能夠在生產(chǎn)發(fā)酵罐中很好地進(jìn)行發(fā)酵工作。種子制備過(guò)程中各階段培養(yǎng)基成如下：種子培養(yǎng)基（g/L）,山梨糖20、玉米漿3、牛肉浸膏3、酵母浸膏3、蛋白胨10、尿素1、KH2P04?2屯01、MgSO?7HO0.2、CaCO1、pH=6.8；優(yōu)化前發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）,山梨糖80、玉米漿15、尿素12、TOC\o"1-5"\h\z4 2 3KHPO?2HO1、MgSO?7HO0.2、CaCO1、pH=6.8；優(yōu)化后發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）,山梨糖100、玉米漿2 4 2 4 2 310、尿素6、KHPO?2HO1、MgSO?7HO0.2、CaCO1、pH=6.8[4]。2 4 2 4 2 3從上面的三種培養(yǎng)基成分中可以發(fā)現(xiàn)，成分逐漸接近生產(chǎn)發(fā)酵罐中的成分，這就是馴化。從種子的制備開(kāi)始就要涉及發(fā)酵工程只能給一個(gè)非常重要的問(wèn)題----污染。一旦種子培養(yǎng)基或種子發(fā)酵罐被污染將前功盡棄。因此，就必須采取有效的措施徹底殺滅發(fā)酵罐中的微生物。至于具體殺菌工作的進(jìn)行將在最后一部分污染與防治中詳細(xì)介紹。（生黑醋桿菌種子的制備過(guò)程與此類似,由于篇幅有限就不做詳細(xì)介紹。分離培養(yǎng)基（%）:葡萄糖10,酵母膏0.7,碳酸鈣1,瓊脂2.5。［5］發(fā)酵培養(yǎng)基（％）:D—山梨醇，玉米漿0.2,酵母膏0,04,碳酸鈣0,07。［5］）發(fā)酵動(dòng)力學(xué)發(fā)酵動(dòng)力學(xué)是以化學(xué)熱力學(xué)（研究反應(yīng)的方向）和化學(xué)動(dòng)力學(xué)（研究反應(yīng)的速度）為基礎(chǔ),對(duì)發(fā)酵過(guò)程各種物質(zhì)的變化進(jìn)行描述。其主要研究?jī)?nèi)容是解發(fā)酵過(guò)程中菌體生長(zhǎng)速率、基質(zhì)消耗速率和產(chǎn)物生產(chǎn)速率的相互關(guān)系,環(huán)境因素對(duì)三者的影響,以及影響其反應(yīng)速率的條件。研究方法是建立數(shù)學(xué)模型定量地描述。從發(fā)酵動(dòng)力學(xué)角度研究二步發(fā)酵法生產(chǎn)維生素C就是有針對(duì)性的對(duì)一些因素進(jìn)行研究，測(cè)出其量的變化，利用數(shù)學(xué)方法建立數(shù)學(xué)模型，由此可較容易地了解到二步發(fā)酵法維生素C發(fā)酵的情況。從數(shù)學(xué)模型角度的研究可從三個(gè)方面入手,一是消耗角度,二是產(chǎn)物生成角度,三是從消耗和生成關(guān)系角度。消耗角度發(fā)酵過(guò)程中反應(yīng)速率可采用基質(zhì)的消耗速率（比速）描述?；|(zhì)的消耗速度=?二（g?L-1?s-1）基質(zhì)的消耗比速:口二--■■- ■■■（h-i?s-i）這里要想求得基質(zhì)的消耗速率（比速）需要得到極致的消耗量,可通過(guò)實(shí)驗(yàn)方法獲得,就提取方法是用過(guò)量甘油銅與L-山梨搪進(jìn)行氧化-還原反應(yīng)，然后用標(biāo)準(zhǔn)濃度的L-山梨糖滴定過(guò)剩的甘油銅。由于2-KLG具有與L-山梨糖相似的還原性游離基，在甘油酮存在時(shí)也發(fā)生反應(yīng)，因此，在維生素C二步發(fā)酵中應(yīng)用該方法時(shí),需要進(jìn)行校正［6,15］。發(fā)酵菌比生長(zhǎng)速率是以菌體干重的增加為基準(zhǔn)的生長(zhǎng)速率,即單位體積培養(yǎng)液中單位時(shí)間內(nèi)生成菌體的干重與菌體濃度成正比。其數(shù)學(xué)模型為下嚴(yán)卩貿(mào)或卩二下：：二（卩為比生長(zhǎng)速率）。這里關(guān)鍵是要能準(zhǔn)確測(cè)得發(fā)酵菌干重的增加。倍增時(shí)間（td）：微生物的細(xì)胞質(zhì)量（或數(shù)量）增大到2倍所需的時(shí)間。這也是用來(lái)獲得比生長(zhǎng)速率的一個(gè)方法，其關(guān)系式為卩=ln2/td心0.693/td，卩為常數(shù)。最著名的表達(dá)式是提出的直角雙曲線經(jīng)驗(yàn)式：_…、、工.：乞被稱為Monod公式。|J：菌體的生長(zhǎng)比速,—S：限制性基質(zhì)濃度，Ks：半飽和常數(shù)，pmax:最大比生長(zhǎng)速度。維持消耗（m）:指維持細(xì)胞最低活性所需消耗的能量，一般來(lái)講，單位重量的細(xì)胞在單位時(shí)間內(nèi)用于維持消耗所需的基質(zhì)的量是一個(gè)常數(shù)。底物消耗速率可通過(guò)菌體得率（生長(zhǎng)得率）與菌體生長(zhǎng)速率關(guān)聯(lián)起來(lái),得rXTrXTX/sYX/s底物消耗速率：?jiǎn)挝惑w積培養(yǎng)液在單位時(shí)間內(nèi)消耗的底物的量）。由于巨大芽孢桿菌是好氧菌，還可利用氧消耗速率來(lái)描述菌體生長(zhǎng)和發(fā)酵情況。5．2產(chǎn)物生成角度與菌體生長(zhǎng)速率和底物消耗速率相同，代謝產(chǎn)物的生成速率也有兩種不同的表示方式：代謝產(chǎn)物生成速率（二）和比代謝產(chǎn)物GR生成速率。兩者之間的關(guān)系為：J=二二與菌體濃度x有關(guān)，是反應(yīng)器設(shè)計(jì)時(shí)的一個(gè)重要參數(shù)；二一：與菌體濃度無(wú)關(guān)，表示細(xì)胞合成代謝產(chǎn)物的活性大小；可利用其定量比較不同微生物的生物合成活性，從而有效篩選優(yōu)良菌株。二步發(fā)酵法生產(chǎn)維生素的過(guò)程中必然要產(chǎn)生二氧化碳，通過(guò)二氧化碳的釋放速率二氧化碳釋放速率（CER，用r（g/L?h）表示）和比二氧化碳生成率（用Q（g/g?h）表示）。CO2 CO2對(duì)于需氧型微生物反應(yīng)，CO2的生成量與O2的消耗量之比稱為呼吸商，用RQ表示：罔=_二二一_［二=三.y：?.o消耗和生成關(guān)系角度類型I：生長(zhǎng)關(guān)聯(lián)型，菌體生長(zhǎng)、基質(zhì)消耗和產(chǎn)物合成大體上呈正比關(guān)系，汙二二o■卩二（為生長(zhǎng)關(guān)聯(lián)型產(chǎn)物的形成比率（g產(chǎn)物/g菌體））。由于實(shí)際發(fā)酵生產(chǎn)中會(huì)由于一些其他的因素影響，如菌體生長(zhǎng)與產(chǎn)物合成異步、溫度變化、pH變化、發(fā)酵液中L-山梨糖濃度變化、反饋抑制等，生長(zhǎng)關(guān)聯(lián)型的實(shí)用性不大。類型II：部分生長(zhǎng)關(guān)聯(lián)型，菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成是分開(kāi)的，糖分既供應(yīng)生長(zhǎng)的能量，又充作產(chǎn)物合成的碳源。發(fā)酵過(guò)程中有兩個(gè) 時(shí)期對(duì)糖的利用最為迅速，一個(gè)是最高生長(zhǎng)時(shí)期，另一個(gè)是最大產(chǎn)物合成時(shí)期。動(dòng)力學(xué)方程為汙二二口卩工-卩蔦兩邊同時(shí)除以X得比代謝速率匸：=QP-—0類型III:非生長(zhǎng)關(guān)聯(lián)型，產(chǎn)物為次級(jí)代謝產(chǎn)物，產(chǎn)物合成與碳源利用無(wú)準(zhǔn)量關(guān)系，發(fā)酵過(guò)程分生長(zhǎng)占主導(dǎo)地位和合成產(chǎn)物占主導(dǎo)地位的兩個(gè)階段，產(chǎn)物形成速度只同已有的菌體量有關(guān)，而比生長(zhǎng)速率對(duì)產(chǎn)物合成速率沒(méi)有直接影響。動(dòng)力學(xué)方程分別為訂二二B二方程兩邊同時(shí)除以X得比代謝速率通過(guò)所建立的數(shù)學(xué)模型可以很好地掌握二步發(fā)酵法生產(chǎn)維生素C所能達(dá)到的產(chǎn)量，指導(dǎo)發(fā)酵控制，提高效益0發(fā)酵環(huán)節(jié)的控制發(fā)酵控制貫穿了整個(gè)發(fā)酵過(guò)程，由于發(fā)酵過(guò)程受到諸多因素（如:發(fā)酵菌體本身的遺傳特性、物質(zhì)運(yùn)輸、能量平衡、工程因素、環(huán)境因素等）交叉影響，發(fā)酵過(guò)程的控制具有不確定性和復(fù)雜性。要想很好的對(duì)其進(jìn)行控制以達(dá)到充分發(fā)揮菌種生產(chǎn)潛力的目的，就需要全面了解菌種本身的代謝特點(diǎn)（如生長(zhǎng)速率、呼吸強(qiáng)度、營(yíng)養(yǎng)要求（酶系統(tǒng)）代謝速率）菌代謝與環(huán)境的相關(guān)性（如溫度、pH、滲透壓、離子強(qiáng)度、溶氧濃度、剪切力等），對(duì)各參數(shù)進(jìn)行調(diào)節(jié)。[24]發(fā)酵控制的參數(shù)分為物理參數(shù)、化學(xué)參數(shù)和生物參數(shù)三種。其中物理參數(shù)包括溫度、攪拌轉(zhuǎn)速、空氣壓力、空氣流量、溶解氧、表觀粘度、排氣氧（二氧化碳）濃度等；化學(xué)參數(shù)包括基質(zhì)濃度（包括糖、氮磷）、pH、產(chǎn)物濃度、核酸量等；生物參數(shù)包括菌絲形態(tài)、菌濃度、菌體比生長(zhǎng)速率、基質(zhì)消耗速率、關(guān)鍵酶活力等。在二步發(fā)酵法生產(chǎn)維生素C過(guò)程中需要控制的參數(shù)有溫度、溶解氧、菌濃度、發(fā)酵液濃度、產(chǎn)物濃度、pH、呼吸強(qiáng)度、基質(zhì)消耗速率、關(guān)鍵酶活力等。對(duì)這些參數(shù)進(jìn)行控制的前提是測(cè)出這些量，針對(duì)其實(shí)際大小和理論大小的差異采取有效措施進(jìn)行控制。針對(duì)工業(yè)中發(fā)酵生產(chǎn)維生素C主要是采用傳感器實(shí)時(shí)測(cè)定并將信號(hào)傳輸?shù)接?jì)算機(jī)中予以分析顯示，制導(dǎo)控制。下面就詳細(xì)敘述二步發(fā)酵法生產(chǎn)維生素C過(guò)程中的一些控制。伴生菌的控制研究發(fā)現(xiàn)蠟狀芽抱桿菌等伴生菌對(duì)氧化葡糖桿菌發(fā)酵將2-酮-L-古洛糖酸轉(zhuǎn)變成維生素C具有很好的促進(jìn)作用（如在協(xié)助氧化葡糖桿菌克服酸性條件，提高氧化葡糖桿菌發(fā)酵能力等方面效果明顯），故而在發(fā)酵過(guò)程中可采取添加優(yōu)秀的伴生菌并創(chuàng)造是一起生長(zhǎng)繁殖的條件可有效提高發(fā)酵效率。[7-8，10,12]添加成分對(duì)發(fā)酵的影響在維生素C的發(fā)酵過(guò)程中的、添加成分分為兩類，即用于發(fā)酵的原料成分和對(duì)發(fā)酵進(jìn)行調(diào)節(jié)的非原料成分。前者主要是供發(fā)酵利用或供給發(fā)酵菌生長(zhǎng)繁殖所利用，后者則主要是其調(diào)節(jié)作用，提高發(fā)酵效率。針對(duì)葡萄糖對(duì)二步法發(fā)酵生產(chǎn)維生素C的研究發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵24h添加葡萄糖能有效地延遲大菌裂解，使大菌處于穩(wěn)定期的時(shí)間延長(zhǎng),從而產(chǎn)生更多的促進(jìn)小菌生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)2-KGA積累。添加葡萄糖時(shí)間過(guò)早或過(guò)晚都可能會(huì)破壞混菌的發(fā)酵體系，使小菌生長(zhǎng)速度不穩(wěn)定，從而抑制了2-KGA量持續(xù)積累。研究還發(fā)現(xiàn)加糖量的不同也會(huì)影響古洛酸的產(chǎn)量，在工業(yè)生產(chǎn)中就必須對(duì)其加以控制，從而獲得較高的產(chǎn)率。[9]外加離子會(huì)通過(guò)對(duì)代謝的調(diào)整來(lái)影響發(fā)酵，通過(guò)對(duì)離子影響的研究，，合理添加離子可很好地控制代謝進(jìn)行以達(dá)到預(yù)期目的。巨大芽抱桿菌主要通過(guò)其生長(zhǎng)過(guò)程中的堿性分泌物和細(xì)胞外液中的活性蛋白對(duì)產(chǎn)酸菌起到伴生作用，前者促進(jìn)產(chǎn)酸菌細(xì)胞增殖，后者激活并提高產(chǎn)酸菌關(guān)鍵代謝酶的活力，從而最終提高混菌發(fā)酵體系的2KGA轉(zhuǎn)化率。離子注入對(duì)巨大芽抱桿菌自身的生長(zhǎng)及細(xì)胞繁殖并未產(chǎn)生顯著影響。離子注入誘導(dǎo)巨大芽抱桿菌的堿性分泌物加速了產(chǎn)酸菌的細(xì)胞增殖，同時(shí)提供了更有利于產(chǎn)酸菌代謝的pH環(huán)境。巨大芽抱桿菌總胞外液提高了產(chǎn)酸菌的糖酸轉(zhuǎn)化能力;從總胞外液中純化出的山梨糖脫氫酶激活蛋白促進(jìn)了產(chǎn)酸菌山梨糖脫氫酶的活力，而這種促進(jìn)能力因離子注入的誘導(dǎo)而得到增強(qiáng)。呂樹(shù)娟等[13]對(duì)N+離子注入前后的巨大芽抱桿菌基因組DNA進(jìn)行了RAPD分析，發(fā)現(xiàn)了出發(fā)菌和突變株基因水平上的變異。對(duì)于本研究而言,低能離子注入BM80后可能引起其DNA堿基的變異、插入、缺失等基因突變，發(fā)生在堿性分泌物和胞外激活蛋白上的基因突變必然影響其生理生化水平上的表達(dá)，從而使其對(duì)產(chǎn)酸菌的伴生能力得到了提高。[11]酶的調(diào)控酶作為生化反應(yīng)的重要參與者，對(duì)代謝的調(diào)控作用是無(wú)可替代的，掌握并將其應(yīng)用在維生素c的發(fā)酵中可獲得非常好的效果。如山梨糖脫氫酶通過(guò)增加該酶的量可加速反應(yīng)，同時(shí)這也帶來(lái)了溫度調(diào)控、pH調(diào)控及離子調(diào)控等方面的內(nèi)容。[13-14]6.4溫度、pH調(diào)控調(diào)節(jié)適宜的溫度和pH是確保發(fā)酵生產(chǎn)的必要條件，這其中就需要了解發(fā)酵在不同情況下的問(wèn)題和酸堿度需求情況，在發(fā)酵罐中安裝相關(guān)的傳感器，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)它們的變化并進(jìn)行相關(guān)的調(diào)節(jié)。溫度的調(diào)控主要是由于發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)熱會(huì)導(dǎo)致溫度過(guò)高影響酶的活性，從而影響了發(fā)酵的正常進(jìn)行，調(diào)控方法就是同冷卻水冷卻降溫。pH調(diào)控主要體現(xiàn)在發(fā)酵液的C、N比上，通過(guò)合體調(diào)發(fā)酵液，并實(shí)時(shí)添加相應(yīng)成分可維持pH的相對(duì)穩(wěn)定。由于一些例子會(huì)對(duì)酶的活性、發(fā)酵菌的活性造成影響，通過(guò)相應(yīng)的離子來(lái)進(jìn)行影響以達(dá)到相關(guān)的目的。6.5發(fā)酵液的影響發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵液中的營(yíng)養(yǎng)成分隨時(shí)都在變化，各成分濃度的高低直接影響了發(fā)酵的進(jìn)行速率，這就帶來(lái)了恒化、恒濁兩個(gè)概念。通常情況下有兩種方式，一是發(fā)酵是通過(guò)補(bǔ)料在恒濁的條件下持續(xù)進(jìn)行，同時(shí)連續(xù)不斷的分理處發(fā)酵產(chǎn)品，避免反饋抑制作用；二是分批次進(jìn)行發(fā)酵，待一批原料發(fā)酵結(jié)束后進(jìn)行分離提取維生素C后再進(jìn)行下一批次的發(fā)酵工作。[16]發(fā)酵的控制還有很多，而且不同的發(fā)酵其可控制因子也是有差異的，這里就不做過(guò)多的介紹。染菌與防治染菌是發(fā)酵工業(yè)中的一件反常讓人頭疼的事，非常小的疏忽就會(huì)在成巨大的損失，怎樣預(yù)防、必究就想的格外重要?？偟膩?lái)說(shuō)，染菌與防治是一個(gè)具體的發(fā)酵控制的一個(gè)方面。下面就具體介紹一下維生素C發(fā)酵過(guò)程中染菌的控制與防治。消除雜菌污染的關(guān)鍵是在發(fā)酵前進(jìn)行徹底的殺菌，但其難度是非常大的，這就導(dǎo)致發(fā)酵過(guò)程中比較容易出現(xiàn)雜菌，若出現(xiàn)劣勢(shì)種群或無(wú)害種群則不會(huì)造成太大的損失，一旦被有害種群或優(yōu)勢(shì)種群污染，損失往往是很大的，幾十噸甚至上百噸的發(fā)酵液就全部損失掉了。針對(duì)這種情況就需要隨時(shí)的監(jiān)控，當(dāng)發(fā)酵罐中出現(xiàn)異常情況是立即進(jìn)行相應(yīng)的補(bǔ)救，如添加發(fā)酵菌，改變發(fā)酵觀眾的理化條件抑制雜菌的生長(zhǎng)，提前放灌收獲一些已經(jīng)產(chǎn)生的維生素C,將發(fā)酵液進(jìn)行滅菌處理再?gòu)男陆臃N發(fā)酵菌進(jìn)行發(fā)酵或用這些發(fā)酵液來(lái)生產(chǎn)其他產(chǎn)品，這都可選用的減少損失的方法。另外，在二步法發(fā)酵生產(chǎn)維生素C工業(yè)中簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、靈敏檢測(cè)維生素C含量，這在發(fā)酵的控制和補(bǔ)救中是必不可少的，高效液相色譜法和反高效液相色譜法就是兩種比較好的檢測(cè)方法。[17-19]總結(jié)二步發(fā)酵法生產(chǎn)維生素C過(guò)程較為簡(jiǎn)單，但發(fā)酵過(guò)程中細(xì)節(jié)問(wèn)題較多，嚴(yán)格按照科學(xué)規(guī)律操作來(lái)選育菌種，保藏菌種，制備發(fā)酵用種子，利用發(fā)酵動(dòng)力學(xué)合理建立數(shù)學(xué)模型制導(dǎo)發(fā)酵控制，做好染菌與防治工作。在工業(yè)生產(chǎn)中還應(yīng)注意根據(jù)實(shí)際情況靈活變動(dòng)，提高理論的實(shí)用性，從而獲得最大的效益。參考文獻(xiàn)：田亞紅，王麗麗，儀宏.維生素C發(fā)酵工藝研究進(jìn)展[J].河北化工.2005年第5期14-16.趙軍.維生素C二步發(fā)酵伴生菌的篩選及其條件優(yōu)化[D].13-14曹鳳明李俊沈德龍關(guān)大偉李力.多重PCR技術(shù)檢測(cè)微生物肥料中巨大芽孢桿菌和蠟樣群芽抱桿菌的研究與應(yīng)用[J].微生物學(xué)通報(bào).2009年9月20日.王靜，馮文亮，王麗麗，,儀宏.一株芽孢桿菌在維生素C二步發(fā)酵中對(duì)小菌的促進(jìn)作用.生物加工過(guò)程[J].2009年1月.9(1)24-28.荊士華安海英李春杰李野張朝印楊偉超姜銘妍徐慧.生黑醋酸桿菌的太空誘變選育[J].生物技術(shù).2011年.21(1).魏東芝，袁渭康，尹光琳，袁中一，陳敏恒，維生素C二步發(fā)酵過(guò)程動(dòng)力學(xué)模型的研究[J].生物工程學(xué)報(bào).1992年.8(3).焦迎暉,張惟材,謝莉,袁紅杰,陳夢(mèng)霞.維生素C發(fā)酵中伴生菌對(duì)氧化葡糖桿菌的影響.微生物學(xué)通報(bào).2002年.29(5)35-38.張舟，馮樹(shù)，江晶，王勇，張忠澤.VC二步發(fā)酵伴生菌巨大芽抱桿菌的選育[J].微生物學(xué)雜志.1999年6月.19(2)8-10.趙軍，康艷紅，楊偉超，王純利，徐慧葡萄糖對(duì)維生素C二步發(fā)酵法生產(chǎn)2-酮基-L-古龍酸影響的研究[J].新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào).2008年.31(4)50-53.陳建華,張君麗.維生素C混菌發(fā)酵中地衣芽胞桿菌對(duì)氧化葡萄糖酸桿菌伴生活性的研究[J].中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào).2011年42(2)160-163趙世光，王陶，余增亮.維生素C二步發(fā)酵中離子注入誘變巨大芽抱桿菌的生物學(xué)效應(yīng)[J].激光生物學(xué)報(bào).2007年8月.16(4)455-459..張靜.基于生化策略和組學(xué)技術(shù)的維生素C生產(chǎn)菌株間生理冠希辨析[D].王虹.維生素C兩步發(fā)酵中關(guān)鍵步驟的分子生物學(xué)研究[D].董方維生素C兩步發(fā)酵中關(guān)鍵酶山梨糖脫氫酶及其輔酶的研究[D].花強(qiáng)，王樹(shù)青.神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建模方法在維生素C發(fā)酵過(guò)程中的應(yīng)用[J].化工