SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定蛋白質的相對分子質量

【目的】學習SDS測定蛋白質分子量的原理。掌握垂直板電泳的操作方法。運用SDS測定蛋白質分子量及染色鑒定?，F(xiàn)在是1頁\一共有23頁\編輯于星期一

【原理】

在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中，加入一定量的十二烷基硫酸鈉（SDS），使蛋白樣品與SDS結合形成帶負電荷的復合物，由于復合物分子量的不同，在電泳中反應出不同的遷移率。根據(jù)標準樣品在該系統(tǒng)電泳中所作出的標準曲線，推算出被測蛋白樣品分子量的近似值。現(xiàn)在是2頁\一共有23頁\編輯于星期一

在蛋白質混合樣品中各蛋白質組分的分子大小和形狀以及所帶電荷多少等因素所造成的電泳遷移率有差別。在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中，加入一定量的十二烷基硫酸鈉（SDS），形成蛋白質－SDS復合物，這種復合物由于結合了大量的SDS，使蛋白質喪失了原有的電荷狀態(tài)，形成了僅保持原有分子大小為特征的負離子團塊，從而降低或消除了各種蛋白質分子之間的天然的電荷差異，此時，蛋白質分子的電泳遷移率主要取決于它的分子量大小，而其它因素對電泳遷移率的影響幾乎可以忽略不計。

現(xiàn)在是3頁\一共有23頁\編輯于星期一電泳過程中分子遷移的規(guī)律，小分子走在前頭，大分子滯后。電泳凝膠相當于凝膠過濾中的一個帶孔膠粒?；旌蠘悠穾Э啄z

按分子大小分離電泳方向

電泳

小分子大分子現(xiàn)在是4頁\一共有23頁\編輯于星期一夾在兩塊玻璃板之間的凝膠電泳緩沖液電泳緩沖液加在槽中的經(jīng)SDS處理的樣品分子量小分子量大電源現(xiàn)在是5頁\一共有23頁\編輯于星期一

當?shù)鞍踪|的分子量在15000～200000之間時，電泳遷移率與分子量的自然對數(shù)值呈反比，符合下列方程：

lnMr=－bmR+K式中：Mr為蛋白質分子量，mR為相對遷移率，b為斜率，K為截距。在條件一定時，b和K均為常數(shù)。若將已知分子量的標準蛋白質的遷移率對分子量的對數(shù)作圖，可獲得一條標準曲線。未知蛋白質在相同條件下進行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標準曲線上求得分子量。

現(xiàn)在是6頁\一共有23頁\編輯于星期一標準蛋白分子量未知蛋白在一定的凝膠濃度下，多肽鏈分子量的對數(shù)與多肽鏈的相對遷移率成線性關系，所以可以通過標準曲線求未知多肽鏈分子量。

相對遷移率現(xiàn)在是7頁\一共有23頁\編輯于星期一【實驗器材】直流穩(wěn)壓電泳儀垂直平板電泳槽移液器微量注射器燒杯、試管、滴管、培養(yǎng)皿、直尺等現(xiàn)在是8頁\一共有23頁\編輯于星期一現(xiàn)在是9頁\一共有23頁\編輯于星期一現(xiàn)在是10頁\一共有23頁\編輯于星期一現(xiàn)在是11頁\一共有23頁\編輯于星期一現(xiàn)在是12頁\一共有23頁\編輯于星期一【實驗試劑】凝膠貯備液分離膠緩沖液濃縮膠緩沖液10%SDS2倍還原緩沖液現(xiàn)在是13頁\一共有23頁\編輯于星期一【實驗試劑】電極緩沖液10%過硫酸銨染色液脫色液現(xiàn)在是14頁\一共有23頁\編輯于星期一【實驗試劑】低分子量標準蛋白：兔磷酸化酶BMr=97,400

牛血清白蛋白Mr=66,200

兔肌動蛋白Mr=43,000

牛碳酸酐酶Mr=31,000

胰蛋白酶抑制劑Mr=20,100

雞蛋清溶菌酶Mr=14,400現(xiàn)在是15頁\一共有23頁\編輯于星期一一、裝板將垂直板型電泳裝置內的板狀凝膠模子取出，將玻璃片洗凈、涼干、嵌入凹槽中，形成一個“夾心”凝膠腔，把裝好的凝膠腔置于仰放的電極上槽。將電泳槽、凝膠模子串成一體的垂直板型電泳裝置，垂直放置在水平臺面上，灌注膠液?！静僮鞣椒ā楷F(xiàn)在是16頁\一共有23頁\編輯于星期一二、分離膠的配制（12%）試劑體積H2O3.35（ml）凝膠貯備液2.5（ml）分離膠緩沖液(pH8.8)2.5（ml）10%SDS0.1（ml）TEMED5（ul）10%過硫酸銨50（ul）總體積10（ml）現(xiàn)在是17頁\一共有23頁\編輯于星期一三、分離膠的灌注和聚合

用移液管將所配制的分離膠緩沖液沿著凝膠腔的長玻璃板的內面緩緩注入，留出梳齒的齒高加1cm的空間以便灌注濃縮膠，然后加滿蒸餾水。待分離膠凝固后，倒出蒸餾水，用濾紙吸干。現(xiàn)在是18頁\一共有23頁\編輯于星期一四、濃縮膠的配制（5%）試劑體積H2O2.92（ml）凝膠貯備液0.8（ml）分離膠緩沖液(pH6.8)1.25（ml）10%SDS0.05（ml）TEMED5（ul）10%過硫酸銨25（ul）總體積5.05（ml）現(xiàn)在是19頁\一共有23頁\編輯于星期一五、濃縮膠的灌注和聚合

用移液管將所配制的濃縮膠緩沖液沿著凝膠腔的長玻璃板的內面緩緩注入，將梳子插入膠液頂部，放置室溫下待其聚合?，F(xiàn)在是20頁\一共有23頁\編輯于星期一六、樣品的準備

在低分子量標準蛋白質和待測樣品中分別加入適量還原緩沖液，放入沸水浴中加熱3~5min，取出冷至室溫?，F(xiàn)在是21頁\一共有23頁\編輯于星期一七、加樣

加入電極緩沖液，小心拔出梳齒，用微量注射器向凝膠梳孔內加樣。同時加入Marker。加樣樣品遷移方向現(xiàn)在是22頁\一共有