細(xì)胞實(shí)驗(yàn)二細(xì)胞損傷與保護(hù)

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)二細(xì)胞損傷與保護(hù)第1頁(yè)/共28頁(yè)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)（二）

細(xì)胞損傷與保護(hù)2設(shè)3組不同的細(xì)胞組正常、損傷、損傷恢復(fù)用不同的實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)、驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

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實(shí)驗(yàn)內(nèi)容細(xì)胞電子顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞活率測(cè)定亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的分離與鑒定第3頁(yè)/共28頁(yè)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)1.（電鏡）每班傳細(xì)胞入含小蓋片培養(yǎng)瓶6瓶（2組）

2瓶正常、4瓶損傷、第二天2瓶損傷后恢復(fù)2.（活率）每組傳細(xì)胞入96孔培養(yǎng)板9孔

3孔正常、6孔損傷、第二天3孔損傷后恢復(fù)3.（分離）每班傳代細(xì)胞8瓶

4瓶細(xì)胞1傳2至25ml培養(yǎng)瓶成8瓶細(xì)胞第4頁(yè)/共28頁(yè)細(xì)胞電子顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞電鏡標(biāo)本制備第5頁(yè)/共28頁(yè)原理

光學(xué)顯微鏡無(wú)法看清小于0.2um的細(xì)微結(jié)構(gòu)，我們把這些細(xì)微結(jié)構(gòu)稱為亞顯微結(jié)構(gòu)（submicroscopicstructures）或超微結(jié)構(gòu)（ultramicroscopicstructures；ultrastructures）。要看清這些結(jié)構(gòu)，就必須選擇波長(zhǎng)更短的光源，以提高顯微鏡的分辨率。第6頁(yè)/共28頁(yè)

電子顯微鏡與光學(xué)顯微鏡的結(jié)構(gòu)，從原理上來(lái)說(shuō)是相似的，但也有不同之處。第7頁(yè)/共28頁(yè)首先不同的是用電子束（電子流）代替照明光源。其次，電鏡使用的是電子透鏡，而不是光學(xué)透鏡，電子透鏡不是肉眼可見(jiàn)的物質(zhì)透鏡，它是由磁或電所形成的磁場(chǎng)或電場(chǎng)的局部空間來(lái)起到透鏡的作用。第三個(gè)區(qū)別是成像原理不同。其成像是由于標(biāo)本中不同結(jié)構(gòu)中原子與電子發(fā)生碰撞后，造成電子散射角度不同，使熒光屏上的電子強(qiáng)度也相應(yīng)不同。第8頁(yè)/共28頁(yè)電鏡制樣技術(shù)

由于電子束的穿透能力有限，為了獲得較高分辨率，需要使用超薄切片機(jī)制成厚度一般僅為40～50nm的超薄切片。這就需要樣品有一定的剛性和韌性，為此，樣品需要包埋在特殊的介質(zhì)中。但包埋的過(guò)程會(huì)破壞樣品的結(jié)構(gòu)，因此超薄切片樣品制備的第一步就是固定，其后依次是包埋、切片和染色。第9頁(yè)/共28頁(yè)

超薄切片的制備1、固定：戊二醛和（OsO4）等，鋨酸后固定。2、包埋：環(huán)氧樹(shù)脂和丙烯酸樹(shù)脂等。3、切片：玻璃刀用超薄切片機(jī)切片，厚度40～50nm，切片收集在銅網(wǎng)或鎳網(wǎng)上，在電鏡下觀察。4、染色：常用的染色液是醋酸雙氧鈾（易染核酸）和鉛鹽（易染蛋白質(zhì)）。第10頁(yè)/共28頁(yè)結(jié)果在電子顯微鏡下觀察比對(duì)正常、損傷及損傷后恢復(fù)標(biāo)本照相分析總結(jié)第11頁(yè)/共28頁(yè)要求送標(biāo)本照片結(jié)果分析第12頁(yè)/共28頁(yè)細(xì)胞活率測(cè)定MTT比色法第13頁(yè)/共28頁(yè)原理四甲基偶氮唑鹽(噻唑藍(lán)MTT)是一種能接受Ｈ原子的染料。可透過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。活細(xì)胞線立體中琥珀酸脫氫酶，能使外源性淡黃色的(MTT)還原成難溶于水的結(jié)晶，并沉淀在細(xì)胞中。其形成量與活性呈正相關(guān)。該結(jié)晶物能被二甲基亞砜（DMSO）溶解，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，在波長(zhǎng)492nm測(cè)定其光吸收值。可間接反映活細(xì)胞的數(shù)量變化。第14頁(yè)/共28頁(yè)器材與試劑器材：培養(yǎng)細(xì)胞(96孔細(xì)胞培養(yǎng)板)酶標(biāo)儀、移液搶、搶頭等試劑：5mg/mlMTT溶液二甲亞砜（DMSO）溶液

DMEM培養(yǎng)液（高糖、無(wú)糖）第15頁(yè)/共28頁(yè)

實(shí)驗(yàn)步驟1、接種1.5×104/ml細(xì)胞于96孔板：每組9孔2、每孔加200ul培養(yǎng)液：3孔正常（高糖）、

3孔損傷（無(wú)糖）、3孔損傷恢復(fù)（無(wú)糖有糖），37oC、5%CO2、飽和濕度下培養(yǎng)；3、測(cè)定前2h，每孔吸棄原培養(yǎng)液，加高糖培養(yǎng)液180ul、再加MTT溶液20ul，繼續(xù)培養(yǎng)；4、到2h測(cè)定時(shí)，每孔吸棄培養(yǎng)液，加DMSO

溶液150ul，振蕩5分鐘；5、酶標(biāo)儀492nm波長(zhǎng)處比色。5h第16頁(yè)/共28頁(yè)結(jié)果記錄酶標(biāo)儀上光吸收值分析每組細(xì)胞生長(zhǎng)情況第17頁(yè)/共28頁(yè)注意事項(xiàng)每孔的細(xì)胞密度不能超出1x105/ml

，避免影響實(shí)驗(yàn)的區(qū)分度；高濃度血清會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)本底增高，比色前盡量使血清濃度不超過(guò)10%。第18頁(yè)/共28頁(yè)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的分離與鑒定細(xì)胞核的提取第19頁(yè)/共28頁(yè)原理

細(xì)胞內(nèi)各種細(xì)胞器質(zhì)量不同，在同一離心場(chǎng)內(nèi)的沉降速度也不相同。根據(jù)這一原理，常用差速離心法、密度梯度離心法來(lái)分離各種細(xì)胞器。分離的各種細(xì)胞器可以用組化等方法加以鑒定。第20頁(yè)/共28頁(yè)本實(shí)驗(yàn)利用此原理僅對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行分離、鑒定，其上清液可作進(jìn)一步分離。第21頁(yè)/共28頁(yè)器材與試劑細(xì)胞株CHL離心機(jī)、天平、離心管、顯微鏡、染色缸、滴管等消化液、0.075MKCl、0.25%蔗糖溶液、甲醇固定液、Giemsa染液第22頁(yè)/共28頁(yè)

操作

收集細(xì)胞（消化法）——

離心(1000/min×5’)——沉淀加0.075MKCl4ml，沖打，靜置20min——離心(1500/min×10’)——

取沉淀加蔗糖溶液4ml，打勻——離心（2500/min×10’）

——取沉淀加少量固定液涂片——酒精燈烤干——甲醇固定5’——Giemsa染色5’——自來(lái)水沖洗——吸水紙吸干玻片（反面）——顯微鏡10倍或40倍下觀察（鑒定）第23頁(yè)/共28頁(yè)結(jié)果細(xì)胞核染成深蘭色第24頁(yè)/共28頁(yè)注意事項(xiàng)注意正確使用離心機(jī)（平衡、對(duì)稱）正確使用顯微鏡染液臨用前稀釋（PBS：Gimsa原液9：1）ba