微生物的生長與環(huán)境條件

第六章微生物生長和環(huán)境條件

微生物的生長與環(huán)境條件第1頁第一節(jié)、微生物群體生長一、獲純培養(yǎng)方法1、純培養(yǎng)定義：從一個細(xì)胞繁殖所得到后代細(xì)胞群體稱為純培養(yǎng)。2、取得純培養(yǎng)方法：（1）稀釋---液體培養(yǎng)法（2）單細(xì)胞挑取法（3）平板培養(yǎng)分離法微生物的生長與環(huán)境條件第2頁微生物的生長與環(huán)境條件第3頁（3）平板培養(yǎng)分離法：A、平板劃線分離法B、涂布平板法C、傾注（混合）平板法劃線分離法步驟：劃線挑菌灼燒劃線灼燒劃線微生物的生長與環(huán)境條件第4頁微生物的生長與環(huán)境條件第5頁二、細(xì)菌群體數(shù)量測量1、顯微直接計數(shù)法微生物的生長與環(huán)境條件第6頁優(yōu)點(diǎn)：快速、方便缺點(diǎn)：不能區(qū)分死菌與活菌；不適于對運(yùn)動細(xì)菌計數(shù)；（甲醛或適度加熱（不能把計數(shù)板加熱））需要相對高細(xì)菌濃度；（107cell/ml）個體小細(xì)菌在顯微鏡下難以觀察；微生物的生長與環(huán)境條件第7頁2、比濁法在一定波長下，測定菌懸液光密度，以光密度(opticaldensity,即O.D.)表示菌量。波長普通選定在450~650nm微生物的生長與環(huán)境條件第8頁培養(yǎng)基顏色顆粒雜質(zhì)試驗測量時應(yīng)控制在菌濃度與光密度成正比線性范圍內(nèi)，不然不準(zhǔn)確。普通OD在1.0以下時和微生物數(shù)量呈正比微生物的生長與環(huán)境條件第9頁3、稀釋平板法（1）傾注平板法(混合平板法)（2）涂布平板法菌落計數(shù)稀釋到適量濃度傾注或涂布平板培養(yǎng)微生物的生長與環(huán)境條件第10頁微生物的生長與環(huán)境條件第11頁混合平板和涂布平板區(qū)分微生物的生長與環(huán)境條件第12頁普通用菌落形成單位（colonyformingunits，CFU）來表示原樣品中細(xì)胞數(shù)。微生物的生長與環(huán)境條件第13頁4、膜過濾培養(yǎng)法當(dāng)樣品中菌數(shù)很低時，能夠?qū)⒁欢w積湖水、海水或飲用水等樣品經(jīng)過膜過濾器，然后將將膜轉(zhuǎn)到對應(yīng)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，對形成菌落進(jìn)行統(tǒng)計。微生物的生長與環(huán)境條件第14頁微生物的生長與環(huán)境條件第15頁主要適合用于只能進(jìn)行液體培養(yǎng)微生物，或采取液體判別培養(yǎng)基進(jìn)行直接判定并計數(shù)微生物。5、MPN法：mostprobablenumber對未知樣品進(jìn)行十倍稀釋，然后依據(jù)估算取三個連續(xù)稀釋度平行接種多支試管，對這些平行試管微生物生長情況進(jìn)行統(tǒng)計，長菌為陽性，未長菌為陰性，然后依據(jù)數(shù)學(xué)統(tǒng)計計算出樣品中微生物數(shù)目。微生物的生長與環(huán)境條件第16頁微生物的生長與環(huán)境條件第17頁三、分批生長中細(xì)菌群體生長微生物的生長與環(huán)境條件第18頁(一)生長曲線生長曲線(GrowthCurve)：細(xì)菌接種到定量液體培養(yǎng)基中，定時取樣測定細(xì)胞數(shù)量，以培養(yǎng)時間為橫座標(biāo)，以菌數(shù)為縱座標(biāo)作圖，得到一條反應(yīng)細(xì)菌在整個培養(yǎng)期間菌數(shù)改變規(guī)律曲線。微生物的生長與環(huán)境條件第19頁細(xì)菌生長曲線普通用菌數(shù)對數(shù)為縱坐標(biāo)作圖微生物的生長與環(huán)境條件第20頁一條經(jīng)典生長曲線最少能夠分為

延滯期，對數(shù)期，穩(wěn)定時和衰亡期四個生長時期微生物的生長與環(huán)境條件第21頁延滯期(Lagphase)：將少許菌種接入新鮮培養(yǎng)基后，在開始一段時間內(nèi)菌數(shù)不馬上增加，或增加極少，生長速度靠近于零。延滯期特點(diǎn)：分裂遲緩、代謝活躍細(xì)胞形態(tài)變大或增加，比如巨大芽孢桿菌，在遲緩期末，細(xì)胞平均長度比剛接種時長6倍。普通來說處于遲緩期細(xì)菌細(xì)胞體積最大細(xì)胞內(nèi)RNA尤其是rRNA含量增高，合成代謝活躍，核糖體、酶類和ATP合成加緊，易產(chǎn)生誘導(dǎo)酶。對外界不良條件反應(yīng)敏感。微生物的生長與環(huán)境條件第22頁微生物的生長與環(huán)境條件第23頁遲緩期出現(xiàn)原因：微生物接種到一個新環(huán)境，暫時缺乏分解和催化相關(guān)底物酶，或是缺乏充分中間代謝產(chǎn)物等。為產(chǎn)生誘導(dǎo)酶或合成中間代謝產(chǎn)物，就需要一段適應(yīng)期。在生產(chǎn)實踐中縮短遲緩期慣用伎倆：(1)利用對數(shù)生長久細(xì)胞作為種子；(2)盡可能使接種前后所使用培養(yǎng)基組成不要相差太大；(3)適當(dāng)擴(kuò)大接種量微生物的生長與環(huán)境條件第24頁對數(shù)生長久(Logphase)：又稱指數(shù)生長久(Exponentialphase)以最大速率生長和分裂，細(xì)菌數(shù)量呈對數(shù)增加，細(xì)菌內(nèi)各成份按百分比有規(guī)律地增加，表現(xiàn)為平衡生長。對數(shù)生長久細(xì)菌個體形態(tài)、化學(xué)組成和生理特征等均較一致，代謝旺盛、生長快速、代時穩(wěn)定。微生物的生長與環(huán)境條件第25頁在細(xì)菌個體生長里，每個細(xì)菌分裂繁殖一代所需時間為代時(Generationtime)，在群體生長里細(xì)菌數(shù)量增加一倍所需時間稱為倍增時間（Doublingtime)。代時通常以G表示。微生物的生長與環(huán)境條件第26頁穩(wěn)定生長久(Stationaryphase)：因為營養(yǎng)物質(zhì)消耗，代謝產(chǎn)物積累和pH等環(huán)境改變，逐步不宜于細(xì)菌生長，造成生長速率降低直至零(即細(xì)菌分裂增加數(shù)量等于細(xì)菌死亡數(shù))。穩(wěn)定生長久又稱恒定時或最高生長久，此時培養(yǎng)液中活細(xì)菌數(shù)最高并維持穩(wěn)定。生長得率:每摩爾底物產(chǎn)生菌體干重微生物的生長與環(huán)境條件第27頁衰亡期(Decline或Deathphase)：營養(yǎng)物質(zhì)耗盡和有毒代謝產(chǎn)物大量積累，細(xì)菌死亡速率超出新生速率，整個群體展現(xiàn)出負(fù)增加。微生物的生長與環(huán)境條件第28頁同時培養(yǎng)(Synchronousculture)：使群體中細(xì)胞處于比較一致，生長發(fā)育均處于同一階段上，即大多數(shù)細(xì)胞能同時進(jìn)行生長或分裂培養(yǎng)方法。(二)同時培養(yǎng)同時培養(yǎng)物常被用來研究在單個細(xì)胞上難以研究生理與遺傳特征，它是一個理想材料。微生物的生長與環(huán)境條件第29頁機(jī)械方法離心方法過濾分離法硝酸纖維素濾膜洗脫法環(huán)境條件誘導(dǎo)溫度培養(yǎng)基成份控制其它（如光照和黑暗交替培養(yǎng)）微生物的生長與環(huán)境條件第30頁密度梯度離心法取得同時細(xì)胞基本步驟分部搜集各層細(xì)胞細(xì)胞分層離心后不一樣時群體細(xì)菌10%蔗糖↓30%梯度利用各部細(xì)胞接種微生物的生長與環(huán)境條件第31頁硝酸纖維素濾膜法是最經(jīng)典取得同時生長方法因為細(xì)胞個體差異，同時生長往往只能維持2-3個世代，隨即又逐步轉(zhuǎn)變?yōu)殡S機(jī)生長。微生物的生長與環(huán)境條件第32頁連續(xù)培養(yǎng)(Continousculture）在微生物整個培養(yǎng)期間，經(jīng)過一定方式使微生物能以恒定比生長速率生長并能連續(xù)生長下去一個培養(yǎng)方法。四、細(xì)菌群體生長連續(xù)培養(yǎng)微生物的生長與環(huán)境條件第33頁控制連續(xù)培養(yǎng)方法恒濁連續(xù)培養(yǎng)不停調(diào)整流速而使細(xì)菌培養(yǎng)液濁度保持恒定恒化連續(xù)培養(yǎng)保持恒定流速微生物的生長與環(huán)境條件第34頁（一）恒濁連續(xù)培養(yǎng)測定所培養(yǎng)微生物光密度值自動調(diào)整新鮮培養(yǎng)基流入和培養(yǎng)物流出培養(yǎng)室流速使培養(yǎng)物維持在某一恒定濁度當(dāng)培養(yǎng)室中濁度超出預(yù)期數(shù)值時，流速加緊，使?jié)岫冉档?；?dāng)培養(yǎng)室中濁度低于預(yù)期數(shù)值時，流速減慢，使?jié)岫壬?；恒濁培養(yǎng)器工作精度是由光電控制系統(tǒng)靈敏度來決定微生物的生長與環(huán)境條件第35頁（二）恒化連續(xù)培養(yǎng)使培養(yǎng)液流速保持不變，并使微生物在恒定生長速率下進(jìn)行生長繁殖。微生物的生長與環(huán)境條件第36頁連續(xù)培養(yǎng)簡化流程圖微生物的生長與環(huán)境條件第37頁稀釋率：每小時流加新鮮培養(yǎng)液占總培養(yǎng)液體積百分比微生物的生長與環(huán)境條件第38頁第二節(jié)、微生物個體生長和分化第三節(jié)、環(huán)境條件對微生物生長和代謝影響微生物的生長與環(huán)境條件第39頁1、溫度低溫型微生物：專性低溫微生物和兼性低溫微生物中溫型微生物：分布最廣高溫型微生物：嗜熱微生物和極端嗜熱微生物一、控制微生物物理原因最低溫度最適溫度最高溫度微生物的生長與環(huán)境條件第40頁低溫型微生物中溫型微生物高溫型微生物微生物的生長與環(huán)境條件第41頁(1)干熱滅菌烘箱內(nèi)熱空氣滅菌火焰灼燒干熱滅菌160-170℃，2小時高溫使蛋白質(zhì)、核酸等主要生物大分子發(fā)生變性、破壞，以及破壞細(xì)胞膜上類脂成份，造成微生物死亡。高溫殺菌微生物的生長與環(huán)境條件第42頁(2)濕熱滅菌濕熱比干熱滅菌更加好：水蒸汽氣化熱高，更易于傳遞熱量；濕熱對普通營養(yǎng)體和孢子殺滅條件：多數(shù)細(xì)菌和真菌營養(yǎng)細(xì)胞：在60℃左右處理5-10分鐘；酵母菌和真菌孢子：用80℃以上溫度處理；細(xì)菌芽孢：121℃處理10分鐘以上；微生物的生長與環(huán)境條件第43頁各種細(xì)菌芽孢在濕熱中

致死溫度和致死時間菌種100oC105oC110oC115oC121oC炭疽芽孢桿菌5~10____枯草芽孢桿菌6~17____嗜熱脂肪芽孢桿菌____12肉毒梭狀芽孢桿菌33010032104破傷風(fēng)梭菌5~155~10___微生物的生長與環(huán)境條件第44頁蒸氣壓力溫度（℃）磅/平方厘米千克/平方厘米kPa50.3533.78108.880.5754.04113.0100.7067.55115.6151.0101.33121.3201.46135.10126.2251.77168.88130.4302.10202.66134.6微生物的生長與環(huán)境條件第45頁微生物的生長與環(huán)境條件第46頁空氣排除程度與溫度關(guān)系壓力表讀數(shù)滅菌器內(nèi)溫度/℃/Pa未排除空氣排除1/3空氣排除1/2空氣排除2/3空氣完全排除氣35701051401752107290941001099010010510911510010911211512110911511812112611512112412613012l126128130135微生物的生長與環(huán)境條件第47頁（3）其它濕熱滅菌方式1）巴斯德消毒（pasteurization）60-85℃處理15秒至30分鐘2）煮沸消毒3）間歇滅菌（fractionalsterilizationORtyndallization）4）瞬間加壓滅菌（continuousautoclaving）135-150℃，5-15秒，工業(yè)上發(fā)酵培養(yǎng)基135-150℃，2-6秒，牛奶或其它液態(tài)食品（超高溫滅菌）微生物的生長與環(huán)境條件第48頁UTH超高溫滅菌乳是在本世紀(jì)60年代出現(xiàn)一個產(chǎn)品，首先是由英國巴頓等研究者提出。其原理是依據(jù)牛奶在加熱中細(xì)菌滅菌效果（SE），也就是殺孢子效率伴隨溫度上升，大大快于牛乳中化學(xué)改變（褐變、維生素破壞、蛋白質(zhì)變性等）。

在溫度有效范圍內(nèi)，熱處理溫度每升高10℃，牛乳中所含細(xì)菌孢子破壞速度性提升11-30倍，而牛乳中化學(xué)改變褐變速度僅提升2.5-3倍，Q10=2.5-3。這意味著溫度越高，其滅菌效果越大，而引發(fā)化學(xué)改變很小。微生物的生長與環(huán)境條件第49頁低溫保藏菌種，實踐中，采取低溫保藏食品，預(yù)防雜菌生長

斜面:4℃

石蠟油:4℃

沙土管:4℃

甘油管:-70℃,液氮

凍干管:4℃

水:常溫

微生物的生長與環(huán)境條件第50頁2、輻射作用輻射滅菌(RadiationSterilization)是利用電磁輻射產(chǎn)生電磁波殺死大多數(shù)物質(zhì)上微生物一個有效方法。用于滅菌電磁波有紫外線(UV)、X-射線和γ-射線等微生物的生長與環(huán)境條件第51頁電磁波滅菌機(jī)理：微生物的生長與環(huán)境條件第52頁UV引發(fā)DNA斷裂、DNA分子雙鏈交聯(lián)以及嘧啶二聚體形成等，其中形成胸腺嘧啶二聚體是最主要作用。胸腺嘧啶二聚體會妨礙雙鏈解鏈與復(fù)制、堿基正常配對，引發(fā)突變。生成臭氧胸腺嘧啶二聚體

微生物的生長與環(huán)境條件第53頁電離輻射誘變劑:x射線、γ射線、快中子、α射線、β射線和超聲波等，在微生物誘變育種中以前面四種用得比較多。直接作用:輻射量子擊中染色體，造成發(fā)生直接原始損傷。間接作用:輻射作用使得細(xì)胞中分子尤其是大量水分子產(chǎn)生電離，進(jìn)而形成各種自由基，這些自由基團(tuán)再深入與細(xì)胞內(nèi)活性大分子產(chǎn)生一系列生物化學(xué)反應(yīng)，造成染色體損傷，造成突變。微生物的生長與環(huán)境條件第54頁可見光（400-760nm）：紫外線（200-400nm）：電離輻射：殺菌效果不顯著殺菌效果顯著，但穿透能力不強(qiáng)，只能用于表面滅菌。波長短，能量高，穿透能力強(qiáng)，殺菌效果很顯著微生物的生長與環(huán)境條件第55頁3、氧氣氧氣對微生物毒害機(jī)制：產(chǎn)生活性氧（超氧負(fù)離子、過氧化氫、羥基自由基）據(jù)微生物對氧氣敏感性：好氧微生物、厭氧微生物O2+e-→O2-2O2-+2H+→H2O2+O2O2-+H2O2→O2+OH-+OH·微生物的生長與環(huán)境條件第56頁好氧菌消除活性氧傷害機(jī)制：產(chǎn)生SOD、過氧化氫酶和過氧化物酶消除活性氧2O2-+2H+→H2O22H2O2→O2+2H2O2H2O2+NADH+H+→NAD++2H2O超氧化物歧化酶接觸酶過氧化物酶微生物的生長與環(huán)境條件第57頁二、控制微生物化學(xué)原因：各種有機(jī)或無機(jī)殺菌劑或抑菌劑微生物的生長與環(huán)境條件第58頁機(jī)理：蛋白質(zhì)變性代表：苯酚（石炭酸）（1）酚：1、有機(jī)化合物應(yīng)用范圍：地面，家俱，皮膚等石炭酸系數(shù)：指在一定時間內(nèi)被試藥劑能殺死全部供試菌最高稀釋度和到達(dá)同效石炭酸最高稀釋度比率。普通要求處理時間為10分鐘，而供試菌定為Salmonellatyphi（傷寒沙門氏菌）。微生物的生長與環(huán)境條件第59頁（2）醇機(jī)理：蛋白質(zhì)變性、細(xì)胞脫水代表：乙醇（75%）應(yīng)用范圍：器械、皮膚微生物的生長與環(huán)境條件第60頁（3）醛機(jī)理：蛋白質(zhì)變性代表：福爾馬林液（40%甲醛）應(yīng)用范圍：熏蒸、標(biāo)本保藏微生物的生長與環(huán)境條件第61頁（4）酸機(jī)理：蛋白質(zhì)變性代表：醋酸、苯甲酸、山梨酸應(yīng)用范圍：房間消毒、防腐劑微生物的生長與環(huán)境條件第62頁（5）表面活性劑機(jī)理：破壞細(xì)胞膜代表：新潔爾滅、洗衣粉、洗滌劑等應(yīng)用范圍：器械、皮膚微生物的生長與環(huán)境條件第63頁2、無機(jī)化合物:鹵化物、重金屬、氧化劑等（1）鹵化物：碘、和氯機(jī)理：破壞細(xì)胞膜代表：碘酒、漂白粉、氯氣應(yīng)用范圍：碘酒-皮膚氯氣-自來水、游泳池、澡堂漂白粉-地面微生物的生長與環(huán)境條件第64頁機(jī)理：與蛋白質(zhì)中巰基結(jié)合代表：升汞、硫酸銅應(yīng)用范圍：非金屬器皿表面消