生化實驗課件 課件6-酶的性質(zhì)及酶動力學(xué)常數(shù)測定2015

授課老師：李民第8周（11月9日~11月13日）酶學(xué)實驗

III.酶的性質(zhì)及

酶動力學(xué)常數(shù)測定生物化學(xué)實驗五酶是指具有生物催化功能的高分子物質(zhì):

高效性：酶的催化效率比無機催化劑更高，使得反應(yīng)速率更快。

專一性：一種酶只能催化一種或一類底物。

多樣性：酶的種類很多，大約有4000多種。

溫和性：是指酶所催化的化學(xué)反應(yīng)一般是在較溫和的條件下進行的。

活性可調(diào)節(jié)性：包括抑制劑和激活劑調(diào)節(jié)、變構(gòu)調(diào)節(jié)等。

易變性：除少數(shù)核酶外，絕大多數(shù)酶都是蛋白質(zhì)，因而會被高溫、強酸、強堿等破壞。有些酶的催化性與輔因子有關(guān)。

酪氨酸酶是黑色素生物合成過程（melaninbiosynthesispathway）中的關(guān)鍵限速酶。

黑色素是一種生物色素，是酪氨酸或3,4-二羥苯丙氨經(jīng)過一連串化學(xué)反應(yīng)所形成。

熊果苷（arbutin）是酪氨酸酶的抑制劑。

Steadystateassumption[E]<<[S],[ES]維持不變類型VmaxKm無抑制劑VmaxKm競爭性抑制劑不變增大非競爭性抑制劑減小不變反競爭性抑制劑減小減小混合型抑制劑減小減小或增大（1）利用倍半稀釋法將16mM的L-DOPA梯度稀釋至所需濃度。（2）在12聯(lián)酶標(biāo)管中按下表加入緩沖液和多巴溶液，振蕩均勻。注意標(biāo)記樣池號。（3）用排槍加入酶液后，精確計時5min后在酶標(biāo)儀中測490nm處吸光度。（4）計算v，[S]（5）作v-[S]曲線和1/v-1/[S]曲線，分別擬合后求酪氨酸酶的Km和Vmax值試劑管號12345678910L-DOPA(μL)050(0.0625mM)50(0.125mM)50(0.25mM)50(0.5mM)50(1mM)50(2mM)50(4mM)50(8mM)50(16mM)PBS緩沖液(pH7.5)(μL)150100100100100100100100100100純酶液(μL)50505050505050505050（1）利用倍半稀釋法將4mM的熊果苷稀釋至2mM備用。（2）在12聯(lián)酶標(biāo)管中按下表加入緩沖液,L-DOPA和不同濃度的熊果苷溶液，振蕩均勻。每個濃度的熊果苷溶液做一排管，注意標(biāo)記樣池號。（3）用排槍加入酶液后，精確計時5min后在酶標(biāo)儀中測490nm處吸光度。（4）計算v，[S]（5）作v-[S]曲線和1/v-1/[S]曲線，分別擬合后求出酪氨酸酶的Km和Vmax值試劑管號12345678910L-DOPA(μL)050(0.0625mM)50(0.125mM)50(0.25mM)50(0.5mM)50(1mM)50(2mM)50(4mM)50(8mM)50(16mM)PBS緩沖液(pH7.5)(μL)500000000002或(4mM)熊果苷(μL)100100100100100100100100100100純酶液(μL)50505050505050505050無抑制劑低濃度抑制劑高濃度抑制劑重點：如何根據(jù)動力學(xué)曲線判斷抑制劑類型最優(yōu)反應(yīng)條件-溫度,pH

倍半稀釋法稀釋L-DOPA溶液和熊果苷溶液根據(jù)教材的列表分別在3個12聯(lián)管內(nèi)加入L-DOPA、PBS緩沖液和熊果苷溶液加入酶液，計時測490nm處各管吸收值溫度對酶活力的影響實驗pH對酶活力的影響實驗測480nm處各管吸收值利用倍半稀釋法，將8mM和16mM的L-DOPA分別稀釋至需要濃度。16mM的L-DOPA稀釋至：8mM、4mM、2mM、1mM、0.5mM、0.25mM、0.125mM和0.0625mM，起始管溶液體積為500μl，每管終體積為250μl。使用多道移液器（排槍）可有效提高加樣速度，減少因孔間加樣時間差異導(dǎo)致的實驗誤差。其操作關(guān)鍵原則是：減少孔間吸樣差異。1.確保每個槍頭連接緊密；2.緩慢吸液；3.靠壁放液；4.防止污染。使用加樣槽，可減少樣品損耗。先用1000μL移液器吸取2mL酶液至加樣槽內(nèi)，再進行排槍吸液操作。每次連接5個槍頭，中途不用更換槍頭。Vmax,mol/L/min3.366e-0052.462e-0051.918e-005Km,

mol/L0.00021960.00031280.0003044方程Y=6.939*X+28995Y=9.798*X+46347Y=12.94*X+57853R20.96690.96040.9703Vmax3.345e-005

mol/