重組基因醫(yī)學(xué)知識(shí)講座專家講座

第十八章重組DNA技術(shù)

生物化學(xué)教研室：周賽男1重組基因醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第1頁基因重組(geneticrecombination)

是指在體外用酶學(xué)方法將不一樣起源DNA進(jìn)行切割、連接，組成一個(gè)新DNA分子過程，又稱DNA重組?；蚩寺?genecloning)

將重組DNA分子導(dǎo)入到適當(dāng)受體細(xì)胞中，使其擴(kuò)增和繁殖，以取得大量同一DNA分子，稱此為基因克隆、DNA克隆或分子克隆?；蚬こ?geneticengineering)

是將不一樣起源DNA片段與載體分子連接形成重組DNA分子，再導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表示，也稱重組DNA技術(shù)。2重組基因醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第2頁

本章主要內(nèi)容主要工具酶基因克隆慣用載體重組DNA基本原理重組技術(shù)在醫(yī)學(xué)和制藥工業(yè)中應(yīng)用3重組基因醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第3頁第一節(jié)主要工具酶工具酶

基因工程中工具酶主要包含用于DNA和RNA分子切割、連接、聚合、逆轉(zhuǎn)錄等相關(guān)各種酶類。4重組基因醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第4頁一、限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease,RE)是一類由細(xì)菌產(chǎn)生能專一識(shí)別雙鏈DNA結(jié)構(gòu)中特異堿基序列，并在特定位點(diǎn)進(jìn)行切割內(nèi)切酶，簡稱限制酶。

依據(jù)限制酶作用特征，普通分為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型，其中慣用是Ⅱ型限制酶。命名：HindIII屬種株同一株具不一樣特異性酶5重組基因醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第5頁

限制酶（Ⅱ型）識(shí)別及切割位點(diǎn)特異識(shí)別及切割47個(gè)bp長度且含有回文序列DNA片斷，主要產(chǎn)生3種末端結(jié)構(gòu)：5ˊ－粘性末端

3ˊ－粘性末端平端或鈍端

回文序列(palindrome)是指該部位核苷酸序列呈180O反向重復(fù);

粘性末端(stickyend)是指經(jīng)內(nèi)切酶特異切割后產(chǎn)生5ˊ－末端突出和3ˊ－末端突出堿基序列相互間含有互補(bǔ)性。6重組基因醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第6頁⑴產(chǎn)生5'-粘性末端

⑵產(chǎn)生3'-粘性末端7重組基因醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第7頁⑶產(chǎn)生平(頭末)端/鈍端8重組基因醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第8頁

慣用限制性核酸內(nèi)切酶特征微生物名稱酶名稱識(shí)別次序同裂酶同尾酶BacillusamyloliquefaciensH解淀粉芽孢桿菌BamHⅠGGATCCBstⅠBglⅡMboⅠBacilliusglobigil球芽孢桿菌BglⅡACATCTEscherichiacoliRY13大腸桿菌EcoRⅠGAATTCHaemophilusinfluenzae流感嗜血菌HindⅢAAGCTTHsuⅠProvidenciastuartii164普羅威登細(xì)菌PstⅠCTGCAGSalpⅠStreptomycesalbusSubspeciespathocidicus白色鏈球菌SalⅠGTCGACAvaⅠXhoⅠ9重組基因醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第9頁

限制性內(nèi)切酶應(yīng)用

經(jīng)過切割不一樣起源DNA雙鏈特異堿基序列，產(chǎn)生含有黏性末端或平端、長度不一樣DNA片段。用于DNA重組、制備探針、分子雜交、DNA序列分析等。10重組基因醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第10頁主要工具酶工具酶活性限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別特異堿基序列，切割DNAT4DNA連接酶催化DNA5ˊ-磷酸與3ˊ-羥基形成磷酸二酯鍵DNA聚合酶以DNA為模板合成DNA逆轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成cDNA堿性磷酸酶切除5－末端磷酸T4多聚核苷酸激酶催化核酸5'-羥基磷酸化末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶

催化3'-端合成同聚尾11重組基因醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第11頁第二節(jié)基因克隆慣用載體載體(vector)是指能在連接酶作用下和外源DNA片段連接起來，并運(yùn)輸?shù)剿拗骷?xì)胞運(yùn)載工具。其化學(xué)本質(zhì)為DNA分子。

本節(jié)主要內(nèi)容

載體必須具備基本條件載體分類慣用載體12重組基因醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第12頁一、載體必須具備基本條件⒈含有獨(dú)立復(fù)制能力⒉具備多個(gè)限制酶識(shí)別位點(diǎn)(多克隆位點(diǎn))⒊含有遺傳表型或篩選標(biāo)識(shí)⒋有足夠容量以容納外源DNA片段⒌可導(dǎo)入受體細(xì)胞。13重組基因醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第13頁二、載體分類*（一）克隆載體

用來克隆和擴(kuò)增DNA片段載體。

有質(zhì)粒DNA、噬菌體DNA和病毒DNA三類。（二）表示型載體為了使插入外源DNA能夠表示為多肽鏈而設(shè)計(jì)載體稱為表示型載體。表示型載體除需載體必備條件外，還需對應(yīng)開啟子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、增強(qiáng)子、終止子等表示調(diào)控構(gòu)件。14重組基因醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第14頁三、慣用載體

（一）質(zhì)粒(plasmid)：

是存在于細(xì)菌染色體外、能自主復(fù)制雙鏈環(huán)狀DNA分子。

作為克隆載體質(zhì)粒應(yīng)具備以下特點(diǎn)：1.分子量相對較小，能穩(wěn)定存在于細(xì)菌體內(nèi)，有較高拷貝數(shù)；2.含有1個(gè)以上遺傳標(biāo)志，便于篩選；3.含有多克隆位點(diǎn)。

15重組基因醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第15頁

總而言之，質(zhì)粒載體應(yīng)該是一個(gè)分子量較小、高拷貝“松弛型”質(zhì)粒，且含有一個(gè)以上遺傳標(biāo)志和多克隆位點(diǎn)質(zhì)粒。廣泛應(yīng)用質(zhì)粒：

pBR32質(zhì)粒、pUC系列等16重組基因醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第16頁

pBR322質(zhì)粒①4363bp②含一個(gè)復(fù)制點(diǎn)含一個(gè)抗氨卞青霉素基因(ampR)④一個(gè)抗四環(huán)素基因(tetR)⑤ampR和tetR抗性基因內(nèi)各有一些限制酶酶切位點(diǎn)，供外源基因插入當(dāng)外源基因插入抗藥基因內(nèi)后，抗藥基因失活。AmpR→Amp敏感(AmpS)、TetR→Tet敏感(TetS).17重組基因醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第17頁pUC系列質(zhì)粒

由pBR322和M13噬菌體構(gòu)建而成雙鏈質(zhì)粒載體；（1）2674bp；（2）有ampR和與M13噬菌體相同多克隆位點(diǎn)（MCS）（3）有1個(gè)來自E.coliLacZ基因片斷,編碼半乳糖苷酶，便于藍(lán)白篩選18重組基因醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第18頁(二)λ噬菌體組成特點(diǎn)：雙鏈線狀DNA分子，全長50kb，含66個(gè)基因，在其分子兩端各含有12個(gè)堿基互補(bǔ)單鏈，是天然粘性末端，被稱為COS位點(diǎn)。19重組基因醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第19頁

λ噬菌體兩種生長路徑（示意圖）20重組基因醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第20頁

λ噬菌體感染細(xì)菌后兩種生長路徑

溶菌性生長噬菌體感染細(xì)菌后，借助其2個(gè)COS位點(diǎn)互補(bǔ)成環(huán)，在宿主菌體內(nèi)連續(xù)復(fù)制，合成大量基因產(chǎn)物，進(jìn)而裝配成噬菌體顆粒，裂解宿主菌，釋放出來噬菌體又可感染其它細(xì)菌。

溶源性生長噬菌體感染細(xì)菌后，可將本身DNA整合到細(xì)菌染色體中去，與之一起復(fù)制，并遺傳給子代細(xì)胞，宿主細(xì)胞不被裂解。21重組基因醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第21頁

第三節(jié)重組DNA基本原理（DNA重組基本程序包含以下過程）

分—獲取目標(biāo)基因和載體接—目標(biāo)基因與載體連接轉(zhuǎn)—重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞篩—重組DNA篩選與判定22重組基因醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第22頁一、目標(biāo)基因獲取（分）目標(biāo)基因是指所要研究或應(yīng)用基因，也是需要克隆或表示基因。

目標(biāo)基因起源

1）制備基因組DNA2）制備cDNA3）聚合酶鏈反應(yīng)4）人工合成基因23重組基因醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第23頁（一）制備基因組DNA（基因文庫，genomiclibrary

）分離、純化基因組DNA

在EDTA等存在下，用蛋白

↓RE酶K消化細(xì)胞、酚抽提；大小不一樣酶切片段

慣用蔗糖梯度離心或電泳

↓

分離酶切片斷；分別與一樣RE酶切載體連接慣用噬菌體載體或質(zhì)粒載體

↓DNA連接酶連接；

導(dǎo)入宿主細(xì)胞、擴(kuò)增導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)培養(yǎng)、擴(kuò)增；

↓得到分子克隆混合體用分子雜交等方法進(jìn)行判定、（基因文庫）篩選、再擴(kuò)增，分離、回收。24重組基因醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第24頁（二）制備cDNA（cDNA文庫）

分離目標(biāo)基因mRNA逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA單鏈水解去除mRNA，合成cDNA雙鏈水解回折處單鏈得到平端雙鏈cDNA與載體連接，導(dǎo)入宿主細(xì)胞擴(kuò)增→構(gòu)建cDNA文庫。25重組基因醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第25頁（三）聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)

在體外，以目標(biāo)基因?yàn)槟０澹贒NA引物、dNTP、TaqDNAPol等存在下，組成一個(gè)反應(yīng)體系。經(jīng)94℃變性、54℃退火及72℃延伸3個(gè)步驟重復(fù)屢次循環(huán)（2530次），擴(kuò)增目標(biāo)基因.

（四）人工合成基因

應(yīng)用DNA測序儀測出某一基因堿基序列，或依據(jù)某一蛋白質(zhì)氨基酸組成反推核苷酸序列，再用DNA合成儀經(jīng)過化學(xué)合成原理合成目標(biāo)基因。（普通先合成短片斷DNA，然后再拼接成長片段）26重組基因醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第26頁二、目標(biāo)基因與載體連接（接）

（主要有以下4種連接方式）1)粘性末端連接2）平頭末端連接3）人工接頭法4）同源多聚尾連接法27重組基因醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第27頁

（一）粘性末端連接

將目標(biāo)基因和載體用同一個(gè)限制酶酶切，產(chǎn)生相同粘性末端，再經(jīng)過DNA連接酶作用將二者連接起來，組成重組DNA分子。

（二）平頭末端連接

有些限制酶只能將目標(biāo)基因和載體DNA切割成平端，此時(shí)在T4DNA連接酶作用下一樣能連接起來。28重組基因醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第28頁（三）人工接頭法合成連接子→與DNA平頭末端連接→限制酶切割,產(chǎn)生粘性末端→連接，構(gòu)建重組DNA。29重組基因醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第29頁（四）同源多聚尾連接法30重組基因醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第30頁三、重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞（轉(zhuǎn)）

無性繁殖

體外重組后DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞，然后隨受體細(xì)胞生長、增殖，使重組DNA發(fā)生復(fù)制、擴(kuò)增，這一過程稱為無性繁殖?？寺?/p>

從上述無性繁殖細(xì)胞中深入篩選出含目標(biāo)DNA重組體分子即為無性繁殖系或克隆。宿主細(xì)胞進(jìn)行無性繁殖時(shí)所采取受體細(xì)胞.31重組基因醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第31頁

重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞類型轉(zhuǎn)化

以質(zhì)粒作載體構(gòu)建重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞過程；轉(zhuǎn)染

以病毒作載體構(gòu)建重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞過程；轉(zhuǎn)導(dǎo)

以噬菌體作載體構(gòu)建重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞過程。

感受態(tài)細(xì)胞

用特殊方法處理（CaCL2）后，受體細(xì)胞才具備接收外源DNA能力，這種細(xì)胞稱感受態(tài)細(xì)胞。感受態(tài)細(xì)胞有原核細(xì)胞和真核細(xì)胞兩大類。32重組基因醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第32頁四、重組DNA篩選與判定（篩）（篩選含重組體陽性菌落，普通有以下幾個(gè)方法）

1）平板篩選2）限制酶切圖譜篩選3）PCR篩選重組體4）原位雜交技術(shù)插入失活藍(lán)－白篩選33重組基因醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第33頁（一）平板篩選

是指利用載體遺傳性標(biāo)識(shí)在平板上直接篩選方法。含有抗藥性標(biāo)識(shí)載體，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞后，能在含抗生素（Amp或Tet）培養(yǎng)平板上生長；未轉(zhuǎn)化則不能生長。插入失活

當(dāng)外源DNA序列插入質(zhì)粒中某一抗藥基因內(nèi)，使該基因失活，轉(zhuǎn)化細(xì)胞就不能生長在含對應(yīng)抗生素培養(yǎng)平板上。34重組基因醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第34頁

抗生素平板篩選（插入失活）35重組基因醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第35頁2.藍(lán)-白篩選

利用藍(lán)色化合物形成作為指示劑，篩選帶重組質(zhì)粒細(xì)菌。載體：編碼β-半乳糖宿主：編碼β-半乳糖苷酶N端序列苷酶C端序列α-互補(bǔ)細(xì)菌表示：β-半乳糖苷酶活性↑5-溴-4-氯-3-吲哚（

X-gal）→

形成藍(lán)色菌落

當(dāng)在質(zhì)粒中插入外源DNA→β-半乳糖苷酶N端基因失活→不能與宿主β-半乳糖苷酶C端進(jìn)行α-互補(bǔ)→產(chǎn)生白色菌落。

（IPTG存在下）

36重組基因醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第36頁

藍(lán)－白篩選示意圖37重組基因醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第37頁(二)限制性內(nèi)切酶圖譜判定38重組基因醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第38頁（三）PCR篩選重組體

抽提少許重組DNA→PCR擴(kuò)增→電泳判定→序列分析。（四）原位雜交技術(shù)39重組基因醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第39頁1、獲取

DNA重組基本過程(小結(jié))40重組基因醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第40頁2、重組41重組基因醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第41頁3、轉(zhuǎn)化體42重組基因醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第42頁4、篩選43重組基因醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第43頁5、克隆44重組基因醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第44頁6、表示表示產(chǎn)物分離純化45重組基因醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第45頁五、重組體在宿主細(xì)胞中表示和調(diào)控

基因工程最終目標(biāo)是經(jīng)過載體將外源基因?qū)脒m當(dāng)宿主細(xì)胞中高效表示，產(chǎn)生有主要價(jià)值蛋白質(zhì)產(chǎn)品。

克隆基因表示有三個(gè)條件

⑴基因編碼區(qū)不能被插入序列中止;

⑵基因轉(zhuǎn)錄要有開啟子，而開啟子必須能被宿主

細(xì)胞RNA聚合酶有效地識(shí)別;

⑶mRNA必須相當(dāng)穩(wěn)定，并有效地被翻譯，產(chǎn)生外

源蛋白質(zhì)必須不為宿主細(xì)胞蛋白酶所降解。46重組基因醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第46頁第四節(jié)重組技術(shù)在醫(yī)學(xué)和制藥工業(yè)中應(yīng)用

一、疾病基因發(fā)覺

1990年美國科學(xué)家率先開啟人類基因組計(jì)劃（HGP），計(jì)劃歷時(shí)15年，至年完成；

年2月12日由Since和Nature雜志同時(shí)向世界宣告，人類基因組3X109bp最新圖譜，約含34萬個(gè)基因；整個(gè)人類基因組全部核苷酸序列很快即將完成。但要揭示人類4萬個(gè)基因功效任務(wù)將更為艱巨。47重組基因醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第47頁

人類基因組圖譜初步完成，不但為全部基因定位建立了一個(gè)開放框架，而且為分離、判定人類疾病相關(guān)基因提供了參考模板。如已知人類遺傳性疾病約有3000種，推測可能是因?yàn)橐恍┗蚪Y(jié)構(gòu)異?；蚧蛭灰频韧蛔兯?。假如利用分子生物學(xué)技術(shù)，將患者疾病基因與正?；驁D譜作對照分析，必將有利于說明遺傳病分子機(jī)制，這對遺傳病基因治療將起到不可估量推進(jìn)作用。48重組基因醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第48頁

產(chǎn)品名稱治療功效與醫(yī)藥范圍

1.人胰島素

治療糖尿病2.人生長激素治療侏儒癥，加速創(chuàng)口愈合

3.α干擾素治療癌癥、病毒感染4.β干擾素治療帶狀皰疹，眼結(jié)、角膜炎5.γ干擾素治療癌癥、病毒感染6.人組織纖溶酶原激活因子(tPA)溶解血栓，治療急性心肌梗塞7.紅細(xì)胞生成素(Epo)治療腎病性貧血，增加紅細(xì)胞及血色素水平8.超氧化物歧化酶去除超氧化物，治療關(guān)節(jié)炎，緩解心肌壞死

9.凝血因子Ⅷ治療A型血友病

10.乙型肝炎疫苗防治肝炎11.神經(jīng)生長因子維持神經(jīng)元細(xì)胞存活、生長和分化12.腦啡膚鎮(zhèn)痛13.降鈣素治療骨質(zhì)疏松癥二、生產(chǎn)蛋白質(zhì)和多肽類活性物質(zhì)49重組基因醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第49頁基因工程生產(chǎn)胰島素原理（示意圖）50重組基因醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第50頁三、制備基因工程疫苗

基因工程疫苗能夠幫助處理傳統(tǒng)技術(shù)難以處理一些特殊病原體疫苗。如，（1）乙型肝炎病毒疫苗（HBV）、丙型肝炎病毒疫苗（HCV）等；（2）有誘發(fā)致癌或產(chǎn)生免疫病理作用疫苗，如人T細(xì)胞免疫缺點(diǎn)病毒（HITV-1）等；（3）常規(guī)效果較差疫苗，如霍亂和痢疾疫苗等（4）制備一些多價(jià)疫苗等。51重組基因醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第51頁四、改良物種特征52重組基因醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第52頁

動(dòng)物藥廠經(jīng)過轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)感興趣基因

↓把YFG放在β—乳球蛋白開啟子下

↓注入羊卵細(xì)胞→植入借腹懷孕母羊體內(nèi)

↓YFG在乳腺中表示

↓乳汁中提純YFG蛋白。

53重組基因醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第53頁1.分離體細(xì)胞（先處于“饑餓”“靜止?fàn)顟B(tài)”）→使“關(guān)閉”基因全部“打開”。2.植入去核卵細(xì)胞中→胚胎細(xì)胞3.將胚胎細(xì)胞植入寄養(yǎng)母體內(nèi)。五、動(dòng)物克隆54重組基因醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第54頁

六、其它應(yīng)用（略）55重組基因