生物技術(shù)制藥 課件 2.基因工程制藥-2

二、基因重組蛋白的分離純化與分析鑒定

(自學(xué)）基因重組蛋白的特點

(1)目的產(chǎn)物在初始原料中的含量較低;(2)含目的產(chǎn)物的初始物料組成復(fù)雜,除了目的產(chǎn)物外,還有大量的細(xì)胞、代謝、殘留培養(yǎng)基、無機鹽等，特別是產(chǎn)物類似物對目的產(chǎn)物的分離純化影響很大；

(3)目的產(chǎn)物的穩(wěn)定性差，具有生物活性的物質(zhì)對pH、溫度、金屬離子、有機溶劑、剪切力、表面張力等十分敏感，容易是其失活、變性；（4）種類繁多，包括大、中、小分子、結(jié)構(gòu)簡單或復(fù)雜的有機化合物，以及結(jié)構(gòu)復(fù)雜又性質(zhì)各異的生物活性物質(zhì)；（5）應(yīng)用面廣，對其質(zhì)量、純度要求高，甚至要求無菌、無熱源。分離純化的基本過程由于基因工程藥物是從轉(zhuǎn)化細(xì)胞、而不是從正常細(xì)胞生產(chǎn)的，所以對產(chǎn)品的純度要求也要高于傳統(tǒng)產(chǎn)品。基因工程藥物的分離純化一般不應(yīng)超過4-5個步驟，包括細(xì)胞破碎、固液分離、濃縮與初步純化、高度純化直至得到純品以及成品加工。發(fā)酵液細(xì)胞分離胞內(nèi)產(chǎn)物胞外產(chǎn)物細(xì)胞破碎固液分離包含體細(xì)胞碎片分離變性復(fù)性濃縮初步分離高度純化制劑產(chǎn)品

基因工程藥物分離純化的一般流程分離純化技術(shù)要求：(1)技術(shù)條件要溫和，能保持目的產(chǎn)物的生物活性；(2)選擇性要好，能從復(fù)雜的混合物中有效地將目的產(chǎn)物分離出來，達到較高純化倍數(shù)；(3)收率要高；(4)兩個技術(shù)之間要能直接銜接，不需要對物料加以處理或調(diào)整，這樣可減少工藝步驟；(5)整個分離純化過程要快，能夠滿足高生產(chǎn)率的要求。（一）基因重組蛋白的主要分離技術(shù)1.離心在轉(zhuǎn)子的高速旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生的離心力的作用下，利用固體及液體間的密度差來實現(xiàn)分離；往往是分離的第一個步驟2.沉淀在制備中，沉淀主要用于濃縮目的，或用于除去留在液相或沉淀在固相中的非必要成分。在生化制備中常用的有以下幾種沉淀方法和沉淀劑：1.鹽析法多用于各種蛋白質(zhì)和酶的分離純化。2.有機溶劑沉淀法多用于生物小分子、多糖及核酸產(chǎn)品的分離純化，有時也用于蛋白質(zhì)沉淀。3.等電點沉淀法用于氨基酸、蛋白質(zhì)及其它兩性物質(zhì)的沉淀。但此法單獨應(yīng)用較少，多與其它方法結(jié)合使用。等電點沉淀法兩性電解質(zhì)分子上的凈電荷為零時溶解度最低，不同的兩性電解質(zhì)具有不同的等電點，以此為基礎(chǔ)可進行分離。如工業(yè)上生產(chǎn)胰島素時，在粗提液中先調(diào)pH8.0去除堿性蛋白質(zhì)，再調(diào)pH3.0去除酸性蛋白質(zhì)。鹽析法定義：在稀鹽溶液中，蛋白質(zhì)的溶解度隨鹽濃度的增加而升高的這種現(xiàn)象稱為鹽溶(saltingin),但當(dāng)鹽濃度增加到一定量時，其溶解度又逐漸下降，直到某一濃度時便從溶液中沉出，即為鹽析(saltingout)原理：saltingin：蛋白質(zhì)吸附某種離子→蛋白質(zhì)彼此排斥，而蛋白質(zhì)與水相互作用加強→溶解度提高saltingout：大量中性鹽加入→破壞蛋白質(zhì)分子表面的水活膜，蛋白質(zhì)表面的電荷被中和→蛋白質(zhì)相互集聚而析出離子種類對蛋白質(zhì)溶解度也有一定影響，離子半徑小而很高電荷的離子在鹽析方面影響較強，離子半徑大而低電荷的離子的影響較弱幾種鹽的鹽析能力的排列次序：磷酸鉀>硫酸鈉>磷酸銨>檸檬酸鈉>硫酸鎂。最常用的硫酸銨，由于其在水中溶解度大，利于鹽析膜分離膜分離法是用天然或人工合成的高分子薄膜，以外界能量或化學(xué)位差為推動力，對雙組分或多組分的溶質(zhì)和溶劑進行分離、分級、提純和富集的方法膜分離過濾原理：膜是兩個或多個濃度相之間具有選擇性的分離屏障，采用錯流過濾分離方式，利用膜材料選擇性分離功能對組分進行分離、純化；錯流方式可有效降低膜污染及防止?jié)獠顦O化現(xiàn)象，系統(tǒng)連續(xù)操作。滲透和透析滲透是一個擴散過程，利用膜的兩側(cè)滲透壓差使溶劑產(chǎn)生流動。透析是利用膜兩側(cè)的濃度差為驅(qū)動力，從溶液中分離出小分子物質(zhì)的過程。如：醫(yī)療上用于處理腎功能衰竭病人。透析反滲透、超濾和微濾從溶液中分離出溶劑的膜分離操作為反滲透；分離溶液中微粒和大分子的膜分離操作為超濾；使不溶物濃縮過濾的操作為微濾。反滲透：外加壓力差大于滲透壓，使溶劑倒流，從而使高濃度溶液進一步濃縮。ReverseOsmosisisjustafilterwithmuchsmallerholesthanotherfilters.

反滲透反滲透、超濾和微濾的孔徑范圍反滲透超濾微濾常規(guī)過濾電滲透在電位差的驅(qū)動下，用離子交換膜從溶液中分離離子的過程。主要用于溶液中的蛋白與離子分離，達到脫鹽的目的。4.雙水相萃取雙水相萃取技術(shù)(Two-aqueousphaseextraction,簡稱ATPS)是指親水性聚合物水溶液在一定條件下可以形成雙水相,由于被分離物在兩相中分配不同,便可實現(xiàn)分離。雙水相的形成如兩種聚合物間存在強的吸引力，則它們結(jié)合后存在于一相中；如兩種聚合物間有斥力，即某種分子傾向與在它周圍的分子是同種分子而不是異種分子，達到平衡后會形成兩相。常用聚合物系統(tǒng)：聚乙二醇/葡聚糖系統(tǒng)聚乙二醇/無機鹽系統(tǒng)AddcleanimmiscibleaqueoussolventphaseShakeorstirtoallowmoleculestopartitionPhasessettleandseparatewithgravityPEG鹽相蛋白其他雙水相萃取基本原理細(xì)胞勻漿液+PEG/鹽第一步兩相萃取分離機下相細(xì)胞碎片、雜蛋白（核酸、多糖）上相目的蛋白+PEG第三步兩相萃取靜置分層下相雜蛋白（核酸、多糖）下相目的蛋白上相雜蛋白、PEG、色素上相目的蛋白靜置分層+鹽三步雙水相萃取蛋白流程（二）基因重組蛋白的主要純化技術(shù)分離純化目的產(chǎn)物主要依賴于色譜分離技術(shù)。色譜技術(shù)分為：

Ionexchangechromatography(IEC)Gelfiltrationchromatography(GFC)Hydrophobicinteractionchromatography(HIC)Affinitychromatography(AC)層析技術(shù)層析（chromatography）利用各組分物理性質(zhì)的不同，引起物質(zhì)在固定相與流動相之間不同的分配比例，達到分離目的的技術(shù)。層析對生物大分子如蛋白質(zhì)和核酸等復(fù)雜的有機物的混合物的分離分析有極高的分辨力。

離子交換層析法離子交換層析法是以具有離子交換性能的物質(zhì)作固定相，利用它與流動相中的離子能進行可逆的交換性質(zhì)來分離離子型化合物的一種方法。它是利用蛋白質(zhì)等電點的差異，來實現(xiàn)不同蛋白質(zhì)的分離和純化。洗脫洗脫離子交換親和層析法親和層析是利用待分離物質(zhì)和它的特異性配體間具有特異的親和力，從而達到分離目的的一類特殊層析技術(shù)。具有專一親和力的生物分子對主要有：抗原與抗體、DNA與互補DNA或RNA、酶與它的底物或競爭性抑制劑、激素（或藥物）與它們的受體、維生素和它的特異結(jié)合蛋白、糖蛋白與它相應(yīng)的植物凝集素等。親和層析3.凝膠層析：最常用的蛋白質(zhì)分離方法。系混合物隨流動相流經(jīng)裝有凝膠作為固定相的層析柱時，混合物中各物質(zhì)因分子大小不同而被分離的技術(shù)。所指凝膠從廣義上說是一類具有三維空間多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，如瓊脂糖凝膠，人工合成品的葡聚糖凝膠等。各物質(zhì)的分子大小和形狀不同，在洗柱過程中，分子量最大的物質(zhì)不能進入凝膠網(wǎng)孔而沿凝膠顆粒間的空隙最先流出柱外。分子量最小的物質(zhì)因能進入凝膠網(wǎng)孔而受阻滯，流速緩慢，致使最后流出柱外。瓊脂糖凝膠Sepharose根據(jù)分子大小根據(jù)蛋白分子形態(tài)凝膠層析反相色譜（reversedphasechromatography)、疏水色譜（hydrophobicinterationchromatography）是近年發(fā)展的新方法。它利用蛋白質(zhì)表面有一部分疏水性，與帶有疏水性的載體在高鹽濃度時結(jié)合。洗脫時將鹽濃度逐漸降低，蛋白質(zhì)因疏水性不同而逐個地先后被洗脫而純化。此法能分離其它一些方法不易純化的蛋白質(zhì)。色譜根據(jù)極性分類

流動相極性＞固定相極性-反相色譜

流動相極性＜固定相極性-正相色譜在反相液相色譜中，固定相的極性小于流動相，洗脫順序取決于溶質(zhì)分子的疏水性，疏水性強的保留時間長?。荆荆臼杷粤鲃酉喙滔嘟?jīng)常將幾種層析柱聯(lián)合應(yīng)用常用的液相色譜純化方法及其原理

方法

分離原理

基于凝膠過濾（GF）

分子大小/形狀

分子形態(tài)離子交換色譜（IEX）

分子所帶電荷

Asp、Glu、Lys、Arg、His等帶電氨基酸疏水作用色譜（HIC）

表面疏水性

Trp、Phe、Ile、Leu、Tyr、Pro、Met、Val、Ala等疏水性氨基酸親和色譜

特異生物識別作用

抗原-抗體，酶-底物，酶-抑制劑等產(chǎn)物特性作用等電點決定離子交換的種類及條件相對分子質(zhì)量選擇不同孔徑及分級分離范圍的介質(zhì)疏水性與疏水、反相介質(zhì)結(jié)合的程度特殊反應(yīng)性產(chǎn)物的氧化、還原及部分催化性能的抑制聚合性是否采用預(yù)防聚合、解聚及分離去除聚合體生物特異性決定親和配基溶解性決定分離體系及蛋白濃度穩(wěn)定性決定工藝采用的溫度及流程時間微不均一性影響產(chǎn)物的回收產(chǎn)物的主要特性及在分離純化中的作用

方法目的離心/過濾去除細(xì)胞、細(xì)胞碎片、顆粒性雜質(zhì)

陰離子交換層析去除雜蛋白、脂質(zhì)、DNA、病毒

40nm微孔濾膜過濾進一步去除病毒陽離子交換層析去除牛血清蛋白或轉(zhuǎn)鐵蛋白等超濾去除沉淀物及病毒疏水層析去除殘余的雜蛋白凝膠過濾與多聚體分離

0.22μm微孔濾膜過濾除菌基因工程藥物生產(chǎn)中常用的分離純化方法（三）選擇分離純化方法的依據(jù)1.根據(jù)產(chǎn)物表達形式來選擇分泌型表達—純化前需濃縮周質(zhì)表達—溶菌酶+滲透壓休克細(xì)胞內(nèi)可溶性表達—首選親和層析包涵體表達—變性復(fù)性2.根據(jù)分離單元之間的銜接選擇先縮小樣本體積—沉淀、超濾后采用高分辨率的操作—色譜前操作單元的產(chǎn)物適合于下一單元的操作如：鹽析后—疏水性層析3.根據(jù)分離純化的工藝要求來選擇基本原則：具有良好的穩(wěn)定性、重復(fù)性和較高的安全性盡可能減少組成工藝的步驟分離純化工藝所用的時間盡可能短工藝和技術(shù)必須高效（四）基因重組蛋白的分析和鑒定1.蛋白質(zhì)含量的測定紫外（UV)吸收光譜基本原理：因蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm處具有最大吸收，且各種蛋白質(zhì)的這三種氨基酸的含量差別不大，因此測定蛋白質(zhì)溶液在280nm處的吸光度值是最常用的紫外吸收法。操作：制備同類蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線BCA法：基本原理：堿性條件下，蛋白將Cu2+還原為Cu+，Cu+與BCA(二辛可酸）試劑形成紫顏色的絡(luò)合物，測定其在562nm處的吸收值，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比，即可計算待測蛋白的濃度。BCA蛋白質(zhì)檢測流程：Lowry法：基本原理：蛋白質(zhì)含有兩個以上的肽鍵(-CO-NH-)，因此有雙縮脲反應(yīng)，在堿性溶液中，能與Cu2+形成絡(luò)合物。蛋白質(zhì)—銅絡(luò)合物能還原磷鉬酸—磷鎢酸試劑，生成藍色物質(zhì)。在一定條件下，藍色強度與蛋白質(zhì)的量成正比例。本法的優(yōu)點是靈敏度高、較紫外吸收法靈敏10-20倍，較雙縮脲法靈敏100倍。其不足之處是此反應(yīng)受多種因素干擾。但操作步驟較多考馬斯亮藍染色法：基本原理：考馬斯亮藍在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)和染料結(jié)合符合比爾定律，因此可以通過測定染料在595nm處光吸收的增加量得到與其結(jié)合的蛋白質(zhì)量。該法簡單、迅速、靈敏度高（比Lowry法靈敏4倍）。但抗干擾能力弱蛋白質(zhì)純度的鑒定蛋白質(zhì)純度鑒定是指蛋白質(zhì)提純后以一定可靠的指標(biāo)表明它的純度。有各種電泳法、色譜法、質(zhì)譜法和末端氨基酸分析法最常用為電泳法：如樣品在不同pH條件下進行電泳，都是以單一的泳速前進，并顯示出一條區(qū)帶，即均一性，這是蛋白質(zhì)純度的一個重要指標(biāo)蛋白質(zhì)分子量測定SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法質(zhì)譜法：(massspectrum)原理：通過電離源將蛋白質(zhì)分子轉(zhuǎn)化為氣相離子，然后利用質(zhì)譜分析儀的電場、磁場將具有特定質(zhì)量與電荷比值(M/Z值)的蛋白質(zhì)離子分離開來，經(jīng)過離子檢測器收集分離的離子，確定離子的M/Z值。蛋白質(zhì)等電點的測定isoelectricpoint（pI）兩性離子所帶電荷因溶液的pH值不同而改變，當(dāng)兩性離子正負(fù)電荷數(shù)值相等時，溶液的pH值即其等電點。常采用等電聚焦法

蛋白質(zhì)序列分析常用的是N端氨基酸序列分析法所謂Edman降解就是將蛋白質(zhì)N-端游離的氨基和衍生化試劑作用，形成環(huán)狀化合物，再裂解并轉(zhuǎn)化形成穩(wěn)定的氨基酸衍生物，用于外標(biāo)定性、定量的分析。余下的蛋白質(zhì)進入下一個循環(huán)進行降解。Edman降解法示意圖蛋白質(zhì)二硫鍵分析二硫鍵(disulfidebond)是蛋白質(zhì)多肽鏈中二級結(jié)構(gòu)上相互靠近的半胱氨酸的巰基(-SH)經(jīng)過氧化而形成的鍵（-S-S-），起著穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用。二硫鍵位置的確定一般采用胃蛋白酶處理沒有斷開二硫鍵的多肽鏈，再利用雙向電泳技術(shù)分離出各個肽段，用過甲酸處理后，將可能含有二硫鍵的肽段進行組成及順序分析，然后同其它方法分析的肽段進行比較，確定二硫鍵的位置。蛋白質(zhì)活性的測定根據(jù)重組蛋白的特性選擇活性測定方法免疫測定法

第二節(jié)

基因工程藥物研發(fā)中的特殊要求一、基因工程藥物臨床前安全性評價的特殊性現(xiàn)行的化學(xué)藥物安全性評價體系并不適用于蛋白質(zhì)類藥物的評價結(jié)構(gòu)確證不完全性種屬特異性多功能性免疫原性（一）蛋白質(zhì)類藥物安全性問題的來源藥理作用的放大、延伸擴大的藥理作用或意外的受體結(jié)合分布于非靶組織細(xì)胞治療中細(xì)胞表型、功能和定位的改變免疫原性雜質(zhì)或污染物引起的毒性（二）受試物的純度表達蛋白的宿主細(xì)胞的污染會導(dǎo)致安全性評價結(jié)果的復(fù)雜性。應(yīng)盡可能地純化，減少雜物的污染（三）相關(guān)動物的選擇生物技術(shù)藥物的種屬特異性要求在實驗開始前確定實驗動物的種屬相關(guān)性。一般而言,通過檢測受試產(chǎn)品在體外對人和動物的細(xì)胞結(jié)合力或功能活性,并確定受試品在體內(nèi)具有藥理活性或交叉反應(yīng)來選擇合適的實驗動物。生物技術(shù)藥物的臨床前毒理學(xué)研究最好使用擁有相應(yīng)靶受體或表位的動物。TGF2β1,IL28和G-CSF等高度保守,在多個動物種屬中有活性;其他細(xì)胞因子如IL-2和IL-6在人與小鼠的氨基酸序列上同源性較低,其重組蛋白在嚙齒類動物中有活性,但活性降低;IFNg,GM-CSF和IL-3等細(xì)胞因子和生長因子的種屬特異性較明顯（四）給藥劑量的選擇動物的給藥方案與臨床應(yīng)用盡可能一致，需觀察包括中毒劑量和無不良反應(yīng)劑，以考察量效關(guān)系。由于生長因子和細(xì)胞因子的受體在體內(nèi)分布較廣,而所希望的治療效果常靶向一種細(xì)胞或局部組織,因此全身給藥可能會導(dǎo)致不良反應(yīng)。依據(jù)TGF-β的生物學(xué)活性,有人對rhTGF-β作為促進傷口愈合藥物進行了評價,毒理試驗方案為給大鼠每日靜脈注射,高劑量為1000μg·kg-1。結(jié)果發(fā)現(xiàn),給藥5d后高劑量組有動物死亡,在肝臟、骨骼、腎臟、心臟、胸腺、胰腺和小腸等出現(xiàn)病理變化。最后確定為局部給藥（五）免疫原性生物技術(shù)藥物大多數(shù)為蛋白、多肽和核酸等生物大分子,具有生物活性和種屬的特異，往往導(dǎo)致實驗動物的免疫應(yīng)答。生物技術(shù)藥物尤其是治療用細(xì)胞因子對免疫系統(tǒng)常具有直接作用,而這些免疫調(diào)節(jié)劑等生物技術(shù)藥物誘發(fā)免疫毒性的方式和機制與化學(xué)藥物有較大的差異,常規(guī)的免疫毒性評價分級試驗法及標(biāo)準(zhǔn)測試組合并不適用生物技術(shù)藥物。（六）遺傳毒性和致癌性常規(guī)的藥品遺傳毒性研究范圍和類型不適用于生物技術(shù)藥物。利用標(biāo)準(zhǔn)的遺傳毒性研究來評價工藝中污染物潛在遺傳毒性也被認(rèn)為是不合適的對于某些僅在靈長類動物中才顯示生理活性的生物技術(shù)藥物而言,很難對其進行生殖毒性評價,因為標(biāo)準(zhǔn)的大鼠和兔生殖毒性研究不適合于評價該類藥物對人體的生殖發(fā)育效應(yīng)。一般認(rèn)為對生物技術(shù)藥物不適合進行標(biāo)準(zhǔn)的致癌性生物檢測。如在作用機制上有致癌的可能，應(yīng)進行致癌性監(jiān)測。（如FGF）（七）藥代動力學(xué)由于蛋白質(zhì)在體內(nèi)很快被降解為多肽和氨基酸，因此其藥代動力學(xué)的研究十分困難。三、基因工程藥物穩(wěn)定性研究的相關(guān)問題影響生物制品的因素：藥物濃度：蛋白在低濃度下易失活—與化學(xué)藥物不同，改變劑型時要重新鑒定其穩(wěn)定性溫度：升溫加速實驗不適合于生物制品濕度：應(yīng)低于1-3％氧：應(yīng)測定在有氧環(huán)境中的穩(wěn)定性，采用密封包裝光照：應(yīng)測定光解作用的影響，采用遮光包裝pH：應(yīng)測定pH的影響第三節(jié)基因工程藥物的修飾與改造

(自學(xué))第四節(jié)基因工程在制藥工業(yè)上的應(yīng)用基因工程藥物的種類人生長激素釋放抑制因子1.激素類及神人胰島素經(jīng)遞質(zhì)類藥物人