豬瘟的間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)專家講座

實(shí)驗(yàn)五

豬瘟間接免疫熒光試驗(yàn)

龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院

2015.5.25豬瘟的間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)專家講座第1頁一、試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)：了解和掌握豬瘟臨床診療方法和試驗(yàn)室診療方法（間接免疫熒光法）。豬瘟的間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)專家講座第2頁熒光免疫顯微技術(shù)直接法---熒光素標(biāo)識Ab直接檢測間接法---熒光素標(biāo)識二抗補(bǔ)體結(jié)正當(dāng)---熒光素標(biāo)識抗補(bǔ)體Ab雙結(jié)正當(dāng)---兩種熒光素標(biāo)識Ab豬瘟的間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)專家講座第3頁二、試驗(yàn)原理：固定在載片上待檢病變組織與適當(dāng)稀釋豬瘟陽性血清反應(yīng)后，假如待檢組織中有豬瘟病毒抗原就會與豬瘟陽性血清中抗體特異性結(jié)合，加入FITC(異硫氰酸熒光素)標(biāo)識兔抗豬IgG二抗又可與豬瘟陽性抗體特異性結(jié)合，在熒光顯微鏡下可見展現(xiàn)綠色熒光。豬瘟的間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)專家講座第4頁豬瘟的間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)專家講座第5頁

能夠產(chǎn)生顯著熒光并能作為染料使用有機(jī)化合物稱為熒光色素或熒光染料。用于標(biāo)識抗體熒光色素，必須含有化學(xué)上活性基因，能與蛋白質(zhì)穩(wěn)定結(jié)合，且不影響標(biāo)識抗體生物活性及抗原抗體特異性結(jié)合。異硫氰酸熒光素(FITC)豬瘟的間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)專家講座第6頁熒光二抗熒光素發(fā)射熒光色激發(fā)波長（nm）發(fā)射波長（nm）異硫氰酸熒光素（FITC）

綠495528四乙基羅丹明

RB200紅570595

熒光素及其激發(fā)波長和發(fā)射波長豬瘟的間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)專家講座第7頁三、試劑與儀器：1.豬瘟病料、抗原片、FITC熒光標(biāo)識兔抗豬二抗、PBS緩沖液、豬瘟標(biāo)準(zhǔn)陰、陽性血清、封片介質(zhì):磷酸鹽緩沖甘油、蓋玻片、濾紙2.熒光顯微鏡、搖床、移液器、吸管等豬瘟的間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)專家講座第8頁生物薄片生物薄片馬賽克：將包被有不一樣基質(zhì)生物薄片固定在一個載片反應(yīng)區(qū)中，可同時檢測各種抗不一樣組織或病原體抗體。豬瘟的間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)專家講座第9頁熒光顯微鏡：豬瘟的間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)專家講座第10頁四、IIF操作步驟：１．準(zhǔn)備：取病豬扁桃體，淋巴結(jié)、脾或其它組織一小片，用濾紙吸去外面液體。用筆編號、標(biāo)識。２．觸片：取潔凈載玻片一塊，稍為烘熱，將組織小片切面觸壓玻片，略加轉(zhuǎn)動，作成壓印置室溫內(nèi)干燥。或用所采病理組織，做成切片。固定：滴加冷丙酮數(shù)滴，置–20℃固定15一20分。清洗：用PBS（pH7.2）洗滌3次，每次5min，陰干。第一次溫育：滴加25ul稀釋后血清覆蓋觸片樣品，防止產(chǎn)生氣泡。滴加完全部待測標(biāo)本后才開始室溫溫育30分鐘。豬瘟的間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)專家講座第11頁四、IIF操作步驟：6．清洗：用磷PBS沖洗載片（注意水流不要太急，不要直接對著觸片組織沖），然后馬上將其浸入裝有磷酸鹽緩沖液平皿中浸洗3次，每次5分鐘。7．第二次溫育：滴上標(biāo)識熒光抗體（30ul），置37℃飽和濕度箱內(nèi)處理10—30分鐘。8．清洗：用pH7.2PBS漂洗3次，每次5—10分鐘。

9．封閉：干后，滴上甘油緩沖液數(shù)滴，加蓋玻片封閉，用熒光顯微鏡檢驗(yàn)。10．結(jié)果判斷：如細(xì)胞胞漿內(nèi)有彌散性、絮狀或點(diǎn)狀亮黃綠色熒光，為豬瘟，如僅見喑綠或灰藍(lán)則不是豬瘟。對照試驗(yàn)用已知豬瘟病毒材料壓印片先用抗豬瘟血清處理，然后用豬瘟熒光抗體處如上檢驗(yàn)，應(yīng)不出現(xiàn)豬瘟病毒感染特異熒光。豬瘟的間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)專家講座第12頁五.注意事項(xiàng):1．觸片要求均勻。2．每