目基因分離專(zhuān)業(yè)知識(shí)講座

原核生物基因組成

目基因分離專(zhuān)業(yè)知識(shí)講座第1頁(yè)真核生物基因組成

目基因分離專(zhuān)業(yè)知識(shí)講座第2頁(yè)真核生物基因組成

目基因分離專(zhuān)業(yè)知識(shí)講座第3頁(yè)結(jié)構(gòu)基因

結(jié)構(gòu)基因（Structuralgene）是指一類(lèi)不但可轉(zhuǎn)錄成信使RNA（mRNA），而且可翻譯成多肽鏈，從而組成各種結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)（包含催化各種生化反應(yīng)酶）基因。目基因分離專(zhuān)業(yè)知識(shí)講座第4頁(yè)第一節(jié)目標(biāo)基因制備

直接分離法構(gòu)建基因組文庫(kù)分離法構(gòu)建cDNA基因文庫(kù)分離法聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)擴(kuò)增目標(biāo)基因基因化學(xué)合成

目基因分離專(zhuān)業(yè)知識(shí)講座第5頁(yè)一、直接分離法限制性核酸內(nèi)切酶酶切分離法基因分離物理化學(xué)法“鳥(niǎo)槍法”目基因分離專(zhuān)業(yè)知識(shí)講座第6頁(yè)目基因分離專(zhuān)業(yè)知識(shí)講座第7頁(yè)二、構(gòu)建基因組文庫(kù)分離法1、基因組DNA文庫(kù)（genomicDNAlibrary）從生物組織細(xì)胞提取出全部DNA，用物理方法或酶法將DNA降解成預(yù)期大小片段，然后將這些片段與適當(dāng)載體連接，轉(zhuǎn)入受體細(xì)菌或細(xì)胞，這么每一個(gè)細(xì)胞接收了含有一個(gè)基因組DNA片段與載體連接重組DNA分子，而且能夠繁殖擴(kuò)增，許多細(xì)胞一起組成一個(gè)含有基因組各DNA片段克隆集合體。目基因分離專(zhuān)業(yè)知識(shí)講座第8頁(yè)2、基本步驟①細(xì)胞染色體大分子DNA提取和大片段制備；②載體DNA制備；③載體與外源大片段連接；④體外包裝及基因組DNA文庫(kù)擴(kuò)增；⑤重組DNA篩選和判定。

目基因分離專(zhuān)業(yè)知識(shí)講座第9頁(yè)3、基因組DNA文庫(kù)特點(diǎn)1975年，Clarke和Carbon提出計(jì)算重組子數(shù)目標(biāo)公式：N=ln（1-P）/ln（1-f）目基因分離專(zhuān)業(yè)知識(shí)講座第10頁(yè)三、構(gòu)建cDNA基因文庫(kù)分離法

1、cDNA基因文庫(kù)概念提取出組織細(xì)胞全部mRNA，在體外反轉(zhuǎn)錄成cDNA，與適當(dāng)載體慣用噬菌體或質(zhì)粒載體連接后轉(zhuǎn)化受體菌，則每個(gè)細(xì)菌含有一段cDNA，并能繁殖擴(kuò)增，這么包含著細(xì)胞全部mRNA信息cDNA克隆集合稱(chēng)為該組織細(xì)胞cDNA文庫(kù)。目基因分離專(zhuān)業(yè)知識(shí)講座第11頁(yè)2、構(gòu)建步驟

細(xì)胞總RNA制備及mRNA分離與完整性確實(shí)定；cDNA第一條鏈與雙鏈cDNA合成及克隆；cDNA與載體連接、噬菌體顆粒包裝及轉(zhuǎn)染或質(zhì)粒轉(zhuǎn)化與判定等。目基因分離專(zhuān)業(yè)知識(shí)講座第12頁(yè)3、cDNA克隆主要優(yōu)點(diǎn)尤其適合用于一些RNA病毒基因組結(jié)構(gòu)研究篩選比較簡(jiǎn)單易行

目標(biāo)基因選擇中出現(xiàn)假陽(yáng)性概率比較低可用于在細(xì)菌中能進(jìn)行表示基因克隆可用于真核細(xì)胞mRNA結(jié)構(gòu)和功效研究目基因分離專(zhuān)業(yè)知識(shí)講座第13頁(yè)4、cDNA克隆主要缺點(diǎn)cDNA文庫(kù)所包含遺傳信息要遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于基因組DNA文庫(kù)不能直接取得基因內(nèi)含子序列和基因編碼區(qū)外大量調(diào)控序列結(jié)構(gòu)與功效方面信息低豐度mRNA

cDDNA克隆所占百分比比較低目基因分離專(zhuān)業(yè)知識(shí)講座第14頁(yè)四、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)擴(kuò)增目標(biāo)基因聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction）技術(shù)簡(jiǎn)稱(chēng)PCR技術(shù)，是一個(gè)體外擴(kuò)增特異DNA片段技術(shù)。目基因分離專(zhuān)業(yè)知識(shí)講座第15頁(yè)第四節(jié)目標(biāo)基因

二、分離目標(biāo)基因路徑4、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)擴(kuò)增目標(biāo)基因PCR原理

：經(jīng)過(guò)溫度改變控制DNA變性和復(fù)性，并設(shè)計(jì)引物做開(kāi)啟子，加入DNA聚合酶、dNTP就能夠完成特定基因體外復(fù)制。1、PCR原理

目基因分離專(zhuān)業(yè)知識(shí)講座第16頁(yè)2、PCR步驟DNA變性（90℃-96℃）退火（25℃-65℃）延伸（70℃-75℃）

目基因分離專(zhuān)業(yè)知識(shí)講座第17頁(yè)3、經(jīng)典PCR反應(yīng)體系

目基因分離專(zhuān)業(yè)知識(shí)講座第18頁(yè)五、基因化學(xué)合成

人工合成基因方法主要有兩條路徑：生物合成化學(xué)合成目基因分離專(zhuān)業(yè)知識(shí)講座第19頁(yè)1、全片段酶促連接法目基因分離專(zhuān)業(yè)知識(shí)講座第20頁(yè)2、酶促填充法目基因分離專(zhuān)業(yè)知識(shí)講座第21頁(yè)第二節(jié)核酸制備

天然DNA制備天然RNA制備核酸樣品分析與檢測(cè)目基因分離專(zhuān)業(yè)知識(shí)講座第22頁(yè)染色體DNA病毒和噬菌體DNA

質(zhì)粒DNA線(xiàn)粒體