分解尿素的微生物專家講座

尿素分子立體結(jié)構(gòu)CO（NH2）2+H2O CO2+2NH3脲酶分解尿素的微生物專家講座第1頁課題2土壤中分解尿素細(xì)菌分離與計(jì)數(shù)分解尿素的微生物專家講座第2頁1、常見分解尿素微生物芽孢桿菌、小球菌、假單胞桿菌、克氏桿菌、棒狀桿菌、梭狀芽孢桿菌，一些真菌和放線菌也能分解尿素。2、課題目標(biāo)一、從土壤中分離出能夠分解尿素細(xì)菌二、統(tǒng)計(jì)每克土壤樣品中尿素細(xì)菌數(shù)目分解尿素的微生物專家講座第3頁啟示：尋找目標(biāo)菌種時(shí)要依據(jù)它對(duì)生存環(huán)境要求，到對(duì)應(yīng)環(huán)境中去尋找。㈠.篩選菌株P(guān)CR技術(shù)是一個(gè)慣用DNA擴(kuò)增技術(shù)，此項(xiàng)技術(shù)自動(dòng)化，需要使用耐高溫DNA聚合酶，假如請(qǐng)你來找這種耐高溫酶，你會(huì)去哪里找？熱泉70-80攝氏度高溫條件淘汰了絕大多數(shù)微生物，而耐熱Taq細(xì)菌脫穎而出。水生耐高溫細(xì)菌Taq分解尿素的微生物專家講座第4頁1、試驗(yàn)室微生物篩選原理（P21）

人為提供有利于目標(biāo)菌株生長條件（包含營養(yǎng)、溫度、pH等），同時(shí)抑制或阻止其它微生物生長。（一）篩選菌株一、研究思緒分解尿素的微生物專家講座第5頁2、選擇培養(yǎng)基

在微生物學(xué)中，將允許特定種類微生物生長，同時(shí)抑制或阻止其它種類微生物生長培養(yǎng)基，稱做選擇培養(yǎng)基。（一）篩選菌株一、研究思緒加入青霉素培養(yǎng)基

——細(xì)菌不生長，酵母菌、霉菌等真菌能生長不加含碳有機(jī)物無碳培養(yǎng)基

——分離自養(yǎng)型微生物分解尿素的微生物專家講座第6頁1.在培養(yǎng)基配方中，為微生物生長提供碳源和氮源分別是是什么物質(zhì)？碳源是葡萄糖，氮源是尿素2.分析該配方培養(yǎng)基對(duì)微生物是否含有選擇作用？假如有，又是怎樣進(jìn)行選擇？有篩選作用。尿素是培養(yǎng)基中唯一氮源，所以，標(biāo)準(zhǔn)上只有能夠利用尿素微生物才能夠生長。閱讀22頁本課題使用培養(yǎng)基配方分解尿素的微生物專家講座第7頁二、統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目顯微鏡直接計(jì)數(shù)法稀釋涂布平板法（活菌計(jì)數(shù)法）分解尿素的微生物專家講座第8頁（二）微生物計(jì)數(shù)1、顯微鏡直接計(jì)數(shù)法1mm一、研究思緒分解尿素的微生物專家講座第9頁每一個(gè)大方格邊長為1mm，則每一大方格面積為1mm2，蓋上蓋玻片后，載玻片與蓋玻片之間高度為0.1mm，所以計(jì)數(shù)室容積為0.1mm3。1mm下面以一個(gè)大方格有25個(gè)中方格計(jì)數(shù)板為例進(jìn)行計(jì)算：設(shè)五個(gè)中方格中總菌數(shù)為A，菌液稀釋倍數(shù)為B，那么，一個(gè)大方格中總菌數(shù)是多少?1ml菌液中總菌數(shù)?(1ml=1cm3=1000mm3）

5AB×1045A缺點(diǎn)：不能區(qū)分死菌與活菌分解尿素的微生物專家講座第10頁2、統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目——稀釋涂布平板法（二）微生物計(jì)數(shù)分解尿素的微生物專家講座第11頁平板菌落數(shù)統(tǒng)計(jì)注意事項(xiàng)1、幾個(gè)菌落粘連一起，只要肉眼能區(qū)分，就算幾個(gè)；2、不論菌落大小，只要肉眼看得見，就應(yīng)該計(jì)數(shù)；3、菌落數(shù)目過多時(shí)，能夠合理采取樣方法。分解尿素的微生物專家講座第12頁某班級(jí)菌落數(shù)統(tǒng)計(jì)表格第1組第2組第3組第4組151216519095256820717716235721781881024平均每mL樣品中活菌數(shù)平板組別恰當(dāng)稀釋度、正確涂布操作是成功地統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目標(biāo)關(guān)鍵。（取樣0.1mL,稀釋倍數(shù)106）分解尿素的微生物專家講座第13頁【例1】某同學(xué)在稀釋倍數(shù)為106培養(yǎng)基上測(cè)得平板上菌落數(shù)平均值為234，那么每毫升樣品中菌落數(shù)是（涂布平板時(shí)所用稀釋液體積為0.1mL）A.2.34×108

B.2.34×109C.234

D.23.4思索1：怎樣依據(jù)平板上菌落數(shù)推測(cè)出每mL樣品中菌株數(shù)？分解尿素的微生物專家講座第14頁【解析】選B。稀釋倍數(shù)為106，0.1mL稀釋液菌落數(shù)平均值為234，則每毫升樣品中菌落數(shù)就為234/0.1×106=2.34×109。每mL樣品中菌株數(shù)=（C÷V）×MC：某一稀釋度下平板上生長平均菌落數(shù)V：涂布平板時(shí)所用稀釋液體積M：稀釋倍數(shù)分解尿素的微生物專家講座第15頁思索2：為何測(cè)平板上菌落數(shù)能夠推測(cè)樣品中活菌數(shù)目？當(dāng)樣品稀釋度足夠高時(shí)，培養(yǎng)基表面生長一個(gè)菌落，起源于樣品稀釋液中一個(gè)活菌。經(jīng)過統(tǒng)計(jì)平板上菌落數(shù)，就能推測(cè)出樣品中大約有多少活菌。為了確保結(jié)果準(zhǔn)確，普通選取菌落數(shù)在30~300平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。分解尿素的微生物專家講座第16頁思索3：統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)往往比活菌實(shí)際數(shù)目高還是低，為何？低。因?yàn)楫?dāng)兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞連在一起時(shí)，平板上觀察到只是一個(gè)菌落。所以，統(tǒng)計(jì)結(jié)果普通用菌落數(shù)而不是活菌數(shù)來表示。分解尿素的微生物專家講座第17頁

第一位同學(xué)只涂布了一個(gè)平板，沒有設(shè)置重復(fù)組，因此結(jié)果不含有說服力。

第二位同學(xué)考慮到設(shè)置重復(fù)組問題，涂布了3個(gè)平板，不過，其中1個(gè)平板計(jì)數(shù)結(jié)果與另2個(gè)相差太遠(yuǎn)，說明在操作過程中可能出現(xiàn)了錯(cuò)誤，所以，不能簡單地將3個(gè)平板計(jì)數(shù)值用來求平均值。實(shí)例分析1分解尿素的微生物專家講座第18頁啟示在設(shè)計(jì)試驗(yàn)時(shí)，一定要涂布最少3個(gè)平板，作為重復(fù)組，才能增強(qiáng)試驗(yàn)說服力與準(zhǔn)確性。在分析試驗(yàn)結(jié)果時(shí)，一定要考慮所設(shè)置重復(fù)組結(jié)果是否一致，結(jié)果不一致，意味著操作有誤，需要重新試驗(yàn)。分解尿素的微生物專家講座第19頁實(shí)例分析2想一想：A同學(xué)和其它同學(xué)所得試驗(yàn)結(jié)果差異如此之大，請(qǐng)分析原因可能有哪些？①②分解尿素的微生物專家講座第20頁實(shí)例分析2想一想：你能經(jīng)過設(shè)置對(duì)照，幫助A同學(xué)排除上述兩個(gè)可能影響試驗(yàn)結(jié)果原因嗎？一個(gè)方案：能夠由其它同學(xué)用與A同學(xué)一樣土樣進(jìn)行試驗(yàn)。假如結(jié)果與A同學(xué)一致，則證實(shí)A無誤；假如結(jié)果不一樣，則證實(shí)A同學(xué)存在操作失誤或培養(yǎng)基配制有問題。分解尿素的微生物專家講座第21頁實(shí)例分析想一想：你能經(jīng)過設(shè)置對(duì)照，幫助A同學(xué)排除上述兩個(gè)可能影響試驗(yàn)結(jié)果原因嗎？另一個(gè)方案：將A同學(xué)配制培養(yǎng)基在不加土樣情況下進(jìn)行培養(yǎng)，作為空白對(duì)照，以證實(shí)培養(yǎng)基是否受到污染。分解尿素的微生物專家講座第22頁

試驗(yàn)結(jié)果要有說服力，對(duì)照設(shè)置是必不可少！

實(shí)例啟示設(shè)置對(duì)照試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)是什么？

排除試驗(yàn)操作、培養(yǎng)條件等無關(guān)變量對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響，提升試驗(yàn)結(jié)果可信度。分解尿素的微生物專家講座第23頁（三）試驗(yàn)基本標(biāo)準(zhǔn)1、平行重復(fù)標(biāo)準(zhǔn)2、對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)3、單一變量標(biāo)準(zhǔn)一、研究思緒分解尿素的微生物專家講座第24頁試驗(yàn)名稱：土壤中分解尿素細(xì)菌分離與計(jì)數(shù)試驗(yàn)原理：試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)：材料用具：方法步驟：1、分組編號(hào)

2、處理（遵照試驗(yàn)設(shè)計(jì)基本標(biāo)準(zhǔn)）對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)、單一變量標(biāo)準(zhǔn)（等量標(biāo)準(zhǔn)）科學(xué)性標(biāo)準(zhǔn)、平行重復(fù)標(biāo)準(zhǔn)可行性標(biāo)準(zhǔn)

3、觀察統(tǒng)計(jì)（設(shè)計(jì)觀察統(tǒng)計(jì)表）試驗(yàn)預(yù)期：試驗(yàn)結(jié)果分析與評(píng)價(jià)：試驗(yàn)結(jié)論：設(shè)計(jì)時(shí)請(qǐng)利用P23-P24三個(gè)資料二、試驗(yàn)設(shè)計(jì)分解尿素的微生物專家講座第25頁試驗(yàn)名稱：土壤中分解尿素細(xì)菌分離與計(jì)數(shù)試驗(yàn)原理：試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)：材料用具：方法步驟：1、分組編號(hào)

2、處理（遵照試驗(yàn)設(shè)計(jì)基本標(biāo)準(zhǔn)）對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)、單一變量標(biāo)準(zhǔn)（等量標(biāo)準(zhǔn)）科學(xué)性標(biāo)準(zhǔn)、平行重復(fù)標(biāo)準(zhǔn)可行性標(biāo)準(zhǔn)

3、觀察統(tǒng)計(jì)（設(shè)計(jì)觀察統(tǒng)計(jì)表）試驗(yàn)預(yù)期：試驗(yàn)結(jié)果分析與評(píng)價(jià)：試驗(yàn)結(jié)論：設(shè)計(jì)時(shí)請(qǐng)利用P23-P24三個(gè)資料二、試驗(yàn)設(shè)計(jì)分解尿素的微生物專家講座第26頁試驗(yàn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)名稱：試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)：試驗(yàn)原理：試驗(yàn)用具：土壤中分解尿素細(xì)菌分離與計(jì)數(shù)將土壤中能夠分解尿素細(xì)菌篩選出來，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。1.提供以尿素作為唯一氮源培養(yǎng)基，標(biāo)準(zhǔn)上只有能分解尿素培養(yǎng)基才能生長。小鐵鏟、信封、酒精燈、培養(yǎng)皿、試管、試管架、移液管、膠頭滴管、蒸餾水、選擇培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基等。2.當(dāng)樣品稀釋度足夠高時(shí)，培養(yǎng)基表面生長一個(gè)菌落，起源于樣品稀釋液中一個(gè)活菌。分解尿素的微生物專家講座第27頁試驗(yàn)設(shè)計(jì)土壤中分解尿素細(xì)菌分離與記數(shù)1.土壤取樣2.制備培養(yǎng)基3.樣品稀釋、取樣涂布4.微生物培養(yǎng)、觀察并統(tǒng)計(jì)結(jié)果5.細(xì)菌計(jì)數(shù)分解尿素的微生物專家講座第28頁土壤中分解尿素細(xì)菌分離與計(jì)數(shù)從肥沃、濕潤土壤中取樣。先鏟去表層土3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準(zhǔn)備好信封中。試驗(yàn)步驟1．土壤取樣分解尿素的微生物專家講座第29頁

制備5個(gè)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和15個(gè)選擇培養(yǎng)基，準(zhǔn)備好無菌試管和移液管。試驗(yàn)步驟2.制備培養(yǎng)基分解尿素的微生物專家講座第30頁

制備5個(gè)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和15個(gè)選擇培養(yǎng)基，準(zhǔn)備好無菌試管和移液管。

注：每個(gè)稀釋度下需要3個(gè)選擇培養(yǎng)基（平行重復(fù)標(biāo)準(zhǔn)），1個(gè)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。選取稀釋倍數(shù)為103~107稀釋液。試驗(yàn)步驟2.制備培養(yǎng)基分解尿素的微生物專家講座第31頁為何分離不一樣微生物要采取不一樣稀釋度？測(cè)定土壤中細(xì)菌總量和測(cè)定土壤中能分解尿素細(xì)菌數(shù)量，選取稀釋范圍相同嗎？分解尿素的微生物專家講座第32頁因?yàn)橥寥乐懈黝愇⑸飻?shù)量(單位：株/kg)是不一樣，比如在干旱土壤中上層樣本中：好氧及兼性厭氧細(xì)菌數(shù)約為2185萬，放線菌數(shù)約為477萬，霉菌數(shù)約為23.1萬。所以，為取得不一樣類型微生物，就需要按不一樣稀釋度進(jìn)行分離，同時(shí)還應(yīng)該有針對(duì)性地提供選擇培養(yǎng)條件。分解尿素的微生物專家講座第33頁測(cè)定土壤中細(xì)菌數(shù)量，普通選取104、105和106倍稀釋液進(jìn)行平板培養(yǎng)；測(cè)定放線菌數(shù)量，普通選取103、104和105倍稀釋液；測(cè)定真菌數(shù)量，普通選取102、103和104倍稀釋液。注：樣品稀釋分解尿素的微生物專家講座第34頁將10g土樣加入盛有90mL無菌生理鹽水錐形瓶中,充分搖勻，吸收上清液1mL，轉(zhuǎn)移至盛有9mL水無菌試管中，依次等比稀釋至107稀釋度，并按照由107至103稀釋度次序分別吸收0.1mL進(jìn)行平板涂布操作。按照濃度從低到高次序涂布平板，無須更換移液管。試驗(yàn)步驟3.樣品稀釋、取樣涂布注意：因?yàn)槭状卧囼?yàn)，對(duì)于稀釋范圍沒有把握，所以選擇了一個(gè)較為寬泛范圍：稀釋倍數(shù)為103～107。分解尿素的微生物專家講座第35頁分解尿素的微生物專家講座第36頁將涂布好培養(yǎng)皿放在30℃下培養(yǎng)。比較牛肉膏培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基中菌落數(shù)量、形態(tài)等，并做好統(tǒng)計(jì)。

4.微生物培養(yǎng)、觀察并統(tǒng)計(jì)結(jié)果分解尿素的微生物專家講座第37頁不一樣種類微生物，往往需要不一樣培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間。細(xì)菌普通在30~37℃溫度下培養(yǎng)1~2d；放線菌普通在25~28℃溫度下培養(yǎng)5~7d；而霉菌普通在25~28℃溫度下培養(yǎng)3~4d。注：分解尿素的微生物專家講座第38頁普通來說，在一定培養(yǎng)條件下(相同培養(yǎng)基、溫度及培養(yǎng)時(shí)間)，同種微生物表現(xiàn)出穩(wěn)定菌落特征。分解尿素的微生物專家講座第39頁當(dāng)菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)，選取菌落數(shù)在30~300平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。在同一稀釋度下，最少對(duì)3個(gè)平板進(jìn)行重復(fù)計(jì)數(shù)，然后求出平均值，并依據(jù)平板所對(duì)應(yīng)稀釋度計(jì)算出樣品中細(xì)菌數(shù)目。試驗(yàn)步驟5.細(xì)菌計(jì)數(shù)分解尿素的微生物專家講座第40頁操作提醒[一]無菌操作1、取土用小鐵鏟盛土樣信封在使用前都需要滅菌。2、應(yīng)在火焰旁稱取土壤。在火焰附近將稱好土樣倒入錐形瓶中