酶聯(lián)免疫測定法

酶聯(lián)免疫測定法酶聯(lián)免疫測定法第1頁

經(jīng)典化學(xué)分析方法（滴定分析、重量分析、簡單吸光光度法）是以簡單離子或分子為檢測對象常量或微量分析，面對生物體系成份復(fù)雜且待測物濃度較低測試條件則往往無能為力。

于是，一系列針對生物體系中化學(xué)成份測量方法應(yīng)運而生。免疫化學(xué)分析即其主要組員，它將免疫學(xué)知識與化學(xué)分析伎倆有機結(jié)合，為生命體系中高特異性、超微量分析提供了處理方法。酶聯(lián)免疫測定法第2頁基礎(chǔ)概念：

抗原：抗原是指進入人或動物機體后，可刺激機體免疫系統(tǒng)發(fā)生免疫應(yīng)答，從而引發(fā)動物產(chǎn)生抗體或形成致敏淋巴細胞，并能和抗體或致敏淋巴細胞發(fā)生特異性反應(yīng)物質(zhì)。

抗體：是由抗原刺激動物免疫系統(tǒng)后，由免疫系統(tǒng)產(chǎn)生分泌能和對應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合免疫球蛋白。酶聯(lián)免疫測定法第3頁1.1抗原抗體反應(yīng)基礎(chǔ)特征：

1.1.1可逆性

抗原與抗體結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物過程是一個動態(tài)平衡，其反應(yīng)式為：Ag+Ab→Ag·Ab

高親和力抗體抗原結(jié)合點與抗原決定簇在空間構(gòu)型上非常適合，二者結(jié)合牢靠，不易解離。解離后抗原或抗體均能保持原有結(jié)構(gòu)和活性。酶聯(lián)免疫測定法第4頁1.1.2特異性

抗原抗體結(jié)合發(fā)生在抗原決定簇與抗體結(jié)合位點之間?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型互補關(guān)系，含有高度特異性。

測定某一特定物質(zhì)，而不需先分離待檢物。

酶聯(lián)免疫測定法第5頁1.1.3最適百分比

酶聯(lián)免疫測定法第6頁1.1.4敏感性化學(xué)比色法敏感度為mg/ml水平酶反應(yīng)測定法敏感度約為5-10μg/ml標(biāo)識免疫敏感度可提升數(shù)千倍，達ng/ml水平比如，HBsAg，其敏感度可達0.1ng/ml。酶聯(lián)免疫測定法第7頁第一章概述1標(biāo)識免疫技術(shù)：將試劑抗原或試劑抗體用能夠微量檢測標(biāo)識物（比如放射性核素、熒光素、酶等）進行標(biāo)識，試劑與標(biāo)本中對應(yīng)抗體或抗原反應(yīng)后，無須測定抗原抗體復(fù)合物本身，而是測定復(fù)合物中標(biāo)識物，這種免疫技術(shù)，稱為標(biāo)識免疫技術(shù).

2標(biāo)識免疫技術(shù)分類：⑴按標(biāo)識物分類：同位素標(biāo)識熒光素酶標(biāo)識等等酶聯(lián)免疫測定法第8頁放射免疫技術(shù)發(fā)光免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)三大經(jīng)典標(biāo)識技術(shù)三大經(jīng)典標(biāo)識技術(shù)酶聯(lián)免疫測定法第9頁放射免疫技術(shù)放射免疫技術(shù)是利用放射性核素可探測靈敏性、準(zhǔn)確性，抗原抗體反應(yīng)特異性組合而創(chuàng)建一類免疫測定技術(shù)醫(yī)學(xué)生物學(xué)超微量分析里程碑。放射免疫技術(shù)分為：放射免疫分析免疫放射分析酶聯(lián)免疫測定法第10頁酶聯(lián)免疫測定法第11頁放射免疫分析測定原理Ag+AbAg–Ab+Ag（待測品）

Ag–AbRR將標(biāo)識抗原（Ag*）和未標(biāo)識抗原（Ag）與特異性抗體（Ab）相混合，結(jié)果形成標(biāo)識和未標(biāo)識抗原抗體復(fù)合物。標(biāo)識和未標(biāo)識抗原競爭與抗體進行結(jié)合現(xiàn)象，成為競爭性抑制作用。酶聯(lián)免疫測定法第12頁Ab限量，Ag*定量,Ag*和Ag量大于Ab結(jié)合位點，二者經(jīng)過競爭方式與Ab結(jié)合；伴隨Ag增加，Ag*與Ab結(jié)合形成Ag*Ab復(fù)合物放射量降低,二者改變成函數(shù)關(guān)系。

酶聯(lián)免疫測定法第13頁放射免疫技術(shù)應(yīng)用放射免疫技術(shù)特異性強、精密度好，靈敏度高（10-9-10-15g/L），對半抗原和抗原測定及儀器設(shè)備條件要求不高，是基層醫(yī)院測定超微量物質(zhì)主要伎倆，常見于各種激素、微量白蛋白、腫瘤標(biāo)識物和藥品等微量物質(zhì)檢測。酶聯(lián)免疫測定法第14頁放射免疫技術(shù)缺點放射性核素半衰期短，試劑使用期短，通常為一個月。因為標(biāo)識物不停改變，使試劑批間、批內(nèi)差異大，標(biāo)準(zhǔn)曲線無法保留備用。放射免疫使用放射性核素標(biāo)識，需要一定防護及廢物處理辦法。結(jié)果測定依靠時間累計，最少每一樣本一分鐘。無法進行自動化分析酶聯(lián)免疫測定法第15頁第二節(jié)酶聯(lián)免疫法免疫酶技術(shù)：酶標(biāo)識試劑制備輕易、穩(wěn)定、使用期長，免疫酶技術(shù)敏感性靠近放射免疫試驗，可直接肉眼觀察也可借助簡單儀器作定量測定，所得結(jié)果比較客觀。酶聯(lián)免疫測定法第16頁一、酶免疫測定法概念和分類把抗原抗體免疫反應(yīng)和酶高效催化作用原理有機地結(jié)合起來。將酶與抗體或抗原用交聯(lián)劑結(jié)合起來，形成酶標(biāo)抗體或抗原。這種抗原或抗體與體內(nèi)或者固相上抗體或抗原特異性結(jié)合，加入對應(yīng)酶底物時，底物被酶催化生成有色產(chǎn)物，依據(jù)呈色深淺來判斷待測抗原或抗體活性和濃度。

酶聯(lián)免疫測定法第17頁酶免疫技術(shù)酶免疫組化酶免疫測定均相非均相固相酶免疫測定液相酶免疫測定組織切片或其它標(biāo)本中抗原定位

液體標(biāo)本中抗原或抗體定性和定量酶聯(lián)免疫測定法第18頁均相法：不需分離復(fù)合物與游離標(biāo)識物即可直接測定方法。異相法則需分離后測定酶聯(lián)免疫測定法第19頁

1971年瑞典學(xué)者Engvail和Perlmann,荷蘭學(xué)者VanWeerman和Schuurs分別報道將免疫技術(shù)發(fā)展為檢測體液中微量物質(zhì)固相免疫測定方法，即酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)

。ELISA現(xiàn)在已成為當(dāng)前分析化學(xué)領(lǐng)域中前沿課題，它是一個特殊試劑分析方法，是在免疫酶技術(shù)(immunoenzymatictechniques)基礎(chǔ)上發(fā)展起來一個新型免疫測定技術(shù)。

酶聯(lián)免疫測定法第20頁ELISA基礎(chǔ)原理和方法ELISA種類和改變ELISA特點ELISA應(yīng)用實例ELISA酶聯(lián)免疫測定法第21頁ELISA基礎(chǔ)原理有三條：（1）抗原或抗體能以物理性地吸附于固相載體表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面間疏水性個別相互吸附，并保持其免疫學(xué)活性；（2）抗原或抗體可經(jīng)過共價鍵與酶連接形成酶結(jié)合物，而此種酶結(jié)合物仍能保持其免疫學(xué)和酶學(xué)活性；（3）酶結(jié)合物與對應(yīng)抗原或抗體結(jié)合后，可依據(jù)加入底物顏色反應(yīng)來判定是否有免疫反應(yīng)存在，而且顏色反應(yīng)深淺是與標(biāo)本中對應(yīng)抗原或抗體量成正百分比，所以，能夠按底物顯色程度顯示試驗結(jié)果。用于定量測定。酶聯(lián)免疫測定法第22頁在這種測定方法中有3種必要試劑：①固相抗原或抗體（免疫吸附劑）②酶標(biāo)識抗原或抗體（標(biāo)識物）③酶作用底物（顯色劑）測定對象能夠是抗體也能夠是抗原酶聯(lián)免疫測定法第23頁標(biāo)本標(biāo)本酶標(biāo)抗體底物顯色有色為陽性顯色有色為陽性酶標(biāo)二抗底物酶聯(lián)免疫測定法第24頁測量時，抗原（抗體）先結(jié)合在固相載體上，但仍保留其免疫活性，然后加一個抗體（抗原）與酶結(jié)合成偶聯(lián)物（標(biāo)識物），此偶聯(lián)物仍保留其原免疫活性與酶活性，當(dāng)偶聯(lián)物與固相載體上抗原（抗體）反應(yīng)結(jié)合后，再加上酶對應(yīng)底物，即起催化水解或氧化還原反應(yīng)而呈顏色。酶聯(lián)免疫測定法第25頁顏色反應(yīng)深淺與對應(yīng)抗體或抗原量成正比，所以可借助于顏色反應(yīng)深淺來定量抗體或抗原。

這種有色產(chǎn)物可用肉眼、光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡觀察，也能夠用分光光度計（酶標(biāo)儀）加以測定。

其方法簡單，方便快速，特異性強。酶聯(lián)免疫測定法第26頁ELISA種類和改變

（一）雙抗體夾心法（二）間接法（三）競爭法（四）雙位點一步法（假陰性）（五）捕捉法測IgM抗體（六）應(yīng)用親和素和生物素ELISA

酶聯(lián)免疫測定法第27頁1.雙抗體夾心法方法：用已知抗體包被，加入待測抗原，再加酶標(biāo)抗體，加底物顯色應(yīng)用：這種方法欲測抗原必須有兩個能夠與抗體結(jié)合部位，因為其一端要包被于固相載體上抗體作用，而另一端則要與酶標(biāo)識特異性抗體作用。所以，不能用于分子量小于5000半抗原之類抗原測定。

乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等ELISA檢測抗原方法酶聯(lián)免疫測定法第28頁酶聯(lián)免疫測定法第29頁1、已知抗體包被于載體表面3、加酶標(biāo)抗體與抗原結(jié)合4、加酶作用底物產(chǎn)生顏色2、加待檢物抗原與抗體結(jié)合4、加酶作用底物不產(chǎn)生顏色洗滌洗滌洗滌洗滌雙抗體夾心法測抗原1、已知抗體包被于載體表面2、加待檢物無抗原與抗體結(jié)合3、加酶標(biāo)抗體無抗原結(jié)合+-YYYEYEYEYYEYEYEYYYYEYEYEYYYYYYYYYYYYYYYYYY酶聯(lián)免疫測定法第30頁取得待分析物未標(biāo)定抗體將特異性抗體與固相載體連接形成固相抗體洗滌除去未結(jié)合抗體及雜質(zhì)加入封閉蛋白溶液以封閉載體表面殘留蛋白結(jié)合位點洗滌并除去未結(jié)合封閉蛋白加受檢標(biāo)本（抗原）形成固相抗體－抗原復(fù)合物洗滌除去其它未結(jié)合物質(zhì)加酶標(biāo)抗體生成抗體—待測抗原—酶標(biāo)識抗體復(fù)合物徹底洗滌未結(jié)合酶標(biāo)抗體加底物進行酶催化反應(yīng)依據(jù)顏色反應(yīng)程度進行該抗原定性或定量測定酶聯(lián)免疫測定法第31頁2.間接法方法

用已知抗原包被，加入待測血清，再加酶標(biāo)抗人IgG（抗抗體或二抗）加底物顯色。優(yōu)點一個酶標(biāo)抗抗體檢測各種與抗原對應(yīng)抗體應(yīng)用

常見于HCV抗體、HIV抗體和梅毒螺旋體抗體等測定ELISA檢測抗體方法酶聯(lián)免疫測定法第32頁酶聯(lián)免疫測定法第33頁1、已知抗原吸附于載體表面2、加待檢物無抗體與抗原結(jié)合3、加酶標(biāo)抗Ig與抗體結(jié)合4、加酶作用底物產(chǎn)生顏色1、已知抗體吸附于載體表面2、加待檢物有抗體與抗原結(jié)合3、加酶標(biāo)抗Ig抗體4、加酶作用底物不產(chǎn)生顏色洗滌洗滌洗滌洗滌間接法測抗體-YEYYYEYEYYYEYYEYYEYYEYYEYEY+酶聯(lián)免疫測定法第34頁包被固相載體:用已知抗原包被固相載體加待檢標(biāo)本:使對應(yīng)抗體與固相抗原結(jié)合洗滌，除去無關(guān)物質(zhì)加酶標(biāo)抗抗體:與固相載體上抗原抗體復(fù)合物結(jié)合；洗滌，除去未結(jié)合酶標(biāo)抗抗體加底物顯色依據(jù)顏色反應(yīng)程度進行該抗原定性或定量測定酶聯(lián)免疫測定法第35頁競爭法

方法：用已知抗體包被，加入待測血清，再加酶標(biāo)抗原，酶標(biāo)抗原與待檢物競爭與包被物結(jié)合。加底物顯色。

應(yīng)用：用于只有一個抗原決定簇小分子半抗原（藥品、激素等）ELISA檢測抗原方法酶聯(lián)免疫測定法第36頁洗滌洗滌競爭法測抗原+-YYYYYYEYYEYYYYEYYEYEYEYE2、加待檢物抗原與酶標(biāo)抗原競爭與抗體結(jié)合3、加酶作用底物不顯色或顯色弱3、加酶作用底物顯色1、已知抗體包被于載體表面1、已知抗體包被于載體表面2、加待測物和酶標(biāo)抗原，酶標(biāo)抗原與抗體結(jié)合YE酶聯(lián)免疫測定法第37頁用已知特異性抗體包被固相載體測定管加待測抗原和一定量酶標(biāo)抗原使二者與固相抗體競爭結(jié)合對照管只加一定量酶標(biāo)抗原與固相抗體直接結(jié)合分別洗滌除去未結(jié)合成份加底物顯色分別測定兩管吸光度值，依據(jù)對照管與測定管吸光度值之比，計算標(biāo)本中待測抗原含量酶聯(lián)免疫測定法第38頁

對照管因為只加酶標(biāo)抗原，與固相抗體充分結(jié)合，故分解底物顯色深；測定管顯色程度則隨待測抗原和酶標(biāo)抗原與固相抗體競爭結(jié)合結(jié)果而異。如待測抗原量多，競爭性地抑制酶標(biāo)抗原與固相抗體結(jié)合，使固相上結(jié)合酶標(biāo)抗原量降低。所以，加入底物后顯色反應(yīng)較弱。酶聯(lián)免疫測定法第39頁酶聯(lián)免疫測定法第40頁ELISA方法類型及應(yīng)用雙抗體夾心法：檢測抗原最常見方法，適合用于檢測兩個以上抗原決定簇多價抗原。間接法：是測定抗體最常見方法。競爭法：可用于抗原和半抗原定量測定，也可反抗體進行測定。酶聯(lián)免疫測定法第41頁ELISA中有三個必要試劑：免疫吸附劑、結(jié)合物和酶底物。（1）已包被抗原或抗體固相載體（免疫吸附劑）；（2）酶標(biāo)識抗原或抗體（結(jié)合物）；（3）酶底物；（4）陰性對照品和陽性對照品，參考標(biāo)準(zhǔn)品；第四節(jié)ELISA技術(shù)關(guān)鍵點酶聯(lián)免疫測定法第42頁固相抗體或抗原是非均相酶免技術(shù)中將游離和結(jié)合酶標(biāo)識物快速分離最常見方法

固相抗體或抗原就是把抗體或抗原結(jié)合到固相載體表面

(1)固相載體酶聯(lián)免疫測定法第43頁要求

結(jié)合抗體或抗原容量大抗體或抗原牢靠地固定在其表面不影響免疫反應(yīng)性利于反應(yīng)充分進行固相方法簡便易行，快速經(jīng)濟種類塑料制品

微顆粒膜載體

固相載體酶聯(lián)免疫測定法第44頁固相載體聚苯乙烯含有較強吸附蛋白質(zhì)性能，抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后仍保留原來免疫學(xué)活性。聚氯乙烯。聚氯乙烯對蛋白質(zhì)吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。良好ELISA板應(yīng)該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間、同一板各孔之間、同一板各孔之間性能相近。酶聯(lián)免疫測定法第45頁3.1.2包被方式

將抗原或抗體固定在過程稱為包被(coating)。

蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是經(jīng)過物理吸附結(jié)合，靠是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上疏水基團與固相載體表面疏水基團間作用。酶聯(lián)免疫測定法第46頁包被用抗原：天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原三大類。合成多肽抗原是抗原決定簇氨基酸序列人工合成多肽片段。普通只含有一個抗原決定簇，純度高，特異性也高，但因為分子量太小，往往難于直接吸附于固相上。借助于偶聯(lián)物與固相載體吸附，間接地結(jié)合到固相載體表面。酶聯(lián)免疫測定法第47頁包被用抗體IgG對聚苯乙烯有強吸附力，其聯(lián)結(jié)發(fā)生在Fc段上，抗體結(jié)合點暴露于外。酶聯(lián)免疫測定法第48頁封閉

封閉(blocking)是繼包被之后用高濃度無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被過程。封閉就是讓大量不相關(guān)蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥ELISA后步驟中干擾物質(zhì)再吸附.常見封閉劑：0.05%-0.5%BSA;10%小牛血清或1%明膠;

脫脂奶粉,比較價廉，能夠高濃度使用（5%）。酶聯(lián)免疫測定法第49頁酶免疫技術(shù)關(guān)鍵組成個別

酶結(jié)合物（conjugate）酶標(biāo)識物經(jīng)過化學(xué)反應(yīng)或免疫學(xué)反應(yīng)，讓酶與抗體或抗原形成結(jié)合物

（2）酶標(biāo)識抗體或抗原結(jié)合物酶聯(lián)免疫測定法第50頁3.2結(jié)合物

即酶標(biāo)識抗體（或抗原）是ELISA中關(guān)鍵試劑，對制備方法要求：

1酶催化活性（不影響）

2抗體（或抗原）免疫活性

3不含有或少含有游離抗體（或抗原）

4結(jié)合物尚要有良好穩(wěn)定性。酶聯(lián)免疫測定法第51頁3.2.1結(jié)合物用抗原和抗體

制備結(jié)合物時所用純度較高IgG，以免在與酶聯(lián)結(jié)時其它雜蛋白干擾。最好用層析純化抗體?？贵w需要特異性好、效價高、親協(xié)力強以及比活性較高，能批量生產(chǎn)，易純化。在ELISA中用酶標(biāo)抗原模式不多，總要求是抗原必須是高純度。酶聯(lián)免疫測定法第52頁3.2.2酶純度高，催化反應(yīng)轉(zhuǎn)化率高，專一性強，性質(zhì)穩(wěn)定，起源豐富，價格不貴，受檢標(biāo)本中不存在相同酶。酶結(jié)合物保留活性個別和催化能力，底物易于制備和保留，價格低廉，有色產(chǎn)物易于測定等。堿性磷酸酶，（AP），辣根過氧化物酶（HRP）另外還有葡萄糖氧化酶，β-半乳糖甙酶，糖化酶及乙酰膽堿酯酶等等。其中以前兩種（AP和HRP）最為常見。酶聯(lián)免疫測定法第53頁酶聯(lián)免疫測定法第54頁3.2.3結(jié)合物制備酶標(biāo)識抗體制備方法主要有兩種，（1）戊二醛交聯(lián)法：（2）過碘酸氧化法(強氧化劑)：酶聯(lián)免疫測定法第55頁戊二醛交聯(lián)法戊二醛分子中有兩個相同醛基，可分別與HRP和蛋白質(zhì)分子中氨基結(jié)合。該法有一步法和二步法。二步法標(biāo)識效率比一步法高，酶標(biāo)識物質(zhì)量較均一。

酶聯(lián)免疫測定法第56頁酶聯(lián)免疫測定法第57頁過碘酸氧化法酶聯(lián)免疫測定法第58頁純化及判定標(biāo)識完成后應(yīng)除去反應(yīng)液中游離酶、游離抗體或抗原、酶聚合物以及抗體或抗原聚合物，防止游離酶增加非特異顯色，以及游離抗體或抗原起競爭作用而降低特異性染色強度

常見純化方法：葡聚糖凝膠G-200/G-150過柱層析純化50%飽和硫酸銨沉淀提純酶標(biāo)識抗體或抗原酶聯(lián)免疫測定法第59頁（三）酶標(biāo)抗體判定

1．酶標(biāo)抗體活性判定普通以瓊脂擴散和免疫電泳進行判定。

2．酶結(jié)合物定量測定包含酶量、IgG含量、酶與IgG克分子比值以及結(jié)合率測定。

分光光度法P74酶聯(lián)免疫測定法第60頁標(biāo)識酶要求：

活性高性質(zhì)穩(wěn)定專一性強酶催化底物顯色信號易于判斷和測量方法敏感，重復(fù)性好，簡單易行酶底物易于配制保留，酶及底物價廉

(3)酶和酶作用底物酶聯(lián)免疫測定法第61頁酶及其底物酶結(jié)合物是酶與抗體或抗原,半抗原在交聯(lián)劑作用下聯(lián)結(jié)產(chǎn)物。是ELISA成敗關(guān)鍵試劑，它不但含有抗體抗原特異免疫反應(yīng)，還含有酶促反應(yīng)，顯示出生物放大作用，但不一樣酶選取不一樣底物，將得到不一樣顏色反應(yīng).酶聯(lián)免疫測定法第62頁酶底物顯色反應(yīng)

測定波長

辣根過氧化物酶鄰苯二胺

四甲替聯(lián)苯胺

氨基水楊酸

鄰聯(lián)苯甲胺

2,2‘-連胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)銨鹽

橘紅色

黃色

棕色

蘭色

藍綠色492460449

425

642

堿性磷酸酯酶

4-硝基酚磷酸鹽(PNP)

萘酚-AS-Mx磷酸鹽+重氮鹽黃色

紅色400

500葡萄糖氧化酶

ABTS+HRP+葡萄糖

葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑蘭黃色

深藍色405420β-Ｄ－半乳糖苷酶

甲基傘酮基半乳糖苷(4MuG)

硝基酚半乳糖苷(ONPG)熒光

黃色

360,450

420

酶聯(lián)免疫測定法第63頁4對照設(shè)定

陽性對照品(positivecontrol)和陰性對照品(negativecontrol)是檢驗試驗有效性控制品，同時也作為判斷結(jié)果對照。 陽性對照品基礎(chǔ)組成應(yīng)盡可能與檢測標(biāo)本組成相一致

陰性對照品須先行檢測確定不含待測物質(zhì)。酶聯(lián)免疫測定法第64頁二、反應(yīng)條件選擇酶標(biāo)抗體濃度：包被Ag或Ab濃度：棋盤滴定法3.溫度、時間等

酶聯(lián)免疫測定法第65頁酶聯(lián)免疫測定法第66頁酶聯(lián)免疫測定法第67頁10μg/ml

1:10001.170.150.09

1:50000.460.030

1:250000.1200

1μg/ml

1:1000＞20.250.10

1:50000.910.120.01

1:250000.250.010

0.1μg/ml

1:10000.420.130.13

1:50000.110.030.02

1:250000.0300

酶聯(lián)免疫測定法第68頁三、操作標(biāo)準(zhǔn)化

1加樣

2保溫

3洗滌

4比色酶聯(lián)免疫測定法第69頁加樣:

在ELISA中普通有3次加樣步聚，即加標(biāo)本，加酶結(jié)合物，加底物。加樣時應(yīng)將所加物加在LEISA板孔底部，防止加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。基礎(chǔ)操作注意事項酶聯(lián)免疫測定法第70頁保溫抗原抗體完成反應(yīng)保溫過程稱為溫育(incubation)。ELISA屬固相免疫測定，抗原、抗體結(jié)合只在固相表面上發(fā)生。溫育常采取溫度有43℃、37℃、室溫和4℃（冰箱溫度）等。37℃是試驗室中常見保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合適當(dāng)溫度。酶聯(lián)免疫測定法第71頁洗滌洗滌在ELISA過程中雖不是一個反應(yīng)步驟，但卻也決定著試驗成敗。ELSIA洗滌：到達分離游離和結(jié)合酶標(biāo)識物目標(biāo)。去除殘留在板孔中游離物質(zhì)，以及非特異性地吸附干擾物質(zhì)。能夠說在ELISA操作中，洗滌是最主要關(guān)鍵技術(shù)。洗滌方式除一些ELISA儀器配有特殊自動洗滌儀外，手工操作有流水沖洗式和浸泡式兩種酶聯(lián)免疫測定法第72頁顯色顯色是酶催化無色底物生成有