發(fā)光分析包括熒光磷光化學發(fā)光

發(fā)光分析包括熒光磷光化學發(fā)光6.1分子熒光分析及磷光分析分子發(fā)光：處于基態(tài)的分子吸收能量（電、熱、化學和光能等）被激發(fā)至激發(fā)態(tài)，然后從不穩(wěn)定的激發(fā)態(tài)返回至基態(tài)并發(fā)射出光子，此種現(xiàn)象稱為發(fā)光。發(fā)光分析包括熒光、磷光、化學發(fā)光、生物發(fā)光等。物質(zhì)分子吸收光能后所產(chǎn)生的光輻射稱之為熒光和磷光。一、基本原理1.分子能級、熒光及磷光的產(chǎn)生分子能級=電子能級(Ee)+振動能級(Ev)+轉(zhuǎn)動能級(Er)。其中電子能級包含振-轉(zhuǎn)能級，如圖。激發(fā)三重態(tài)：分子吸收能量，電子自旋不再配對，為三重態(tài)，稱為激發(fā)三重態(tài)，以T1，T2….表示?；鶓B(tài)：電子自旋配對，多重度=2s+1=1，為單重態(tài)，以S0表示。激發(fā)單重態(tài)：分子吸收能量，電子自旋仍然配對，為單重態(tài)，稱為激發(fā)單重態(tài)，以S1，S2…表示三重態(tài)能級低于單重態(tài)（Hund規(guī)則）2.去活化過程（Deactivation）

處于激發(fā)態(tài)分子不穩(wěn)定，通過輻射或非輻射躍遷等去活化過程返回至基態(tài)。這些過程包括：1）振動弛豫（VibrationalRelaxation,VR）在液相或壓力足夠高的氣相中，處于激發(fā)態(tài)的分子因碰撞將剩余的振動能量以熱的形式傳遞給周圍的分子，從而從高振動能層失活至低振動能層的過程，稱為振動弛豫。2）內(nèi)轉(zhuǎn)換（InternalConversion，IC）對于具有相同多重度的分子，若較高電子能級的低振動能層與較低電子能級的高振動能層相重疊時，常發(fā)生電子從高電子能級以無輻射躍遷形式轉(zhuǎn)移至低電子能級。如S2-S1；T2-T1。

3）熒光發(fā)射

分子電子從單重激發(fā)態(tài)（Kasha規(guī)則）的最低振動能級在很短時間（10-9-10-6s）躍遷到基態(tài)各振動能級時所產(chǎn)生的光子輻射稱為熒光。由于各種去活化過程的存在，熒光輻射能通常要比激發(fā)能量低，或者說，熒光波長大于激發(fā)波長（Stokes效應(yīng)）。4）系間跨躍（IntersystemConversion，ISC）系間跨躍是發(fā)生在兩個不同多重態(tài)之間的無輻射躍遷，如從S1到T1，該躍遷是禁阻的。然而，當不同多重態(tài)的兩個電子能層有較大重疊時，處于這兩個能層上的受激電子的自旋方向發(fā)生變化，即可通過自旋-軌道耦合而產(chǎn)生無輻射躍遷，該過程稱為系間跨躍。5）磷光發(fā)射

從單重態(tài)到三重態(tài)分子間發(fā)生系間跨躍躍遷后，再經(jīng)振動弛豫回到三重態(tài)最低振動能層，最后，在10-4-10s內(nèi)躍遷到基態(tài)的各振動能層所產(chǎn)生的輻射。6）外轉(zhuǎn)換（ExternalConversion，EC）受激分子與溶劑或其它分子相互作用發(fā)生能量轉(zhuǎn)換而使熒光或磷光強度減弱甚至消失的過程，也稱“熄滅”或“猝滅”。3.定性分析

熒光和磷光均屬于光致發(fā)光。任何熒（磷）光都具有兩種特征光譜：激發(fā)光譜與發(fā)射光譜－－熒（磷）光定性分析的基礎(chǔ)。1）激發(fā)光譜

通過測量熒光(或磷光)體的發(fā)光強度隨激發(fā)光波長的變化而獲得的光譜，稱為激發(fā)光譜。具體測繪方法：通過掃描激發(fā)單色器，使不同波長的入射光照射激發(fā)熒光(磷光)體，發(fā)出的熒光(磷光)通過固定波長的發(fā)射單色器而照射到檢測器上，檢測其熒光(磷光)強度，最后通過記錄儀記錄光強度對激發(fā)光波長的關(guān)系曲線，即為激發(fā)光譜。通過激發(fā)光譜，選擇最佳激發(fā)波長——發(fā)射熒光(磷光)強度最大的激發(fā)光波長，常用λex表示。

2）發(fā)射光譜，也稱熒光光譜或磷光光譜

通過測量熒光(或磷光)體的發(fā)光強度隨發(fā)射光波長的變化而獲得的光譜，稱為發(fā)射光譜。其測繪方法，是固定激發(fā)光的波長，掃描發(fā)射光的波長，記錄發(fā)射光強度對發(fā)射光波長的關(guān)系曲線，即為發(fā)射光譜。通過發(fā)射光譜選擇最佳的發(fā)射波長——發(fā)射熒光(磷光)強度最大的發(fā)射波長，常用λem表示，磷光發(fā)射波長比熒光來得長，右圖為萘的激發(fā)光譜及熒光和磷光的發(fā)射光譜。3）激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的特征

i）斯托克斯位移

與激發(fā)（或吸收）波長相比，熒光發(fā)射波長更長，即產(chǎn)生所謂Stokes位移。（振動弛豫失活所致）ii）熒光發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān)

盡管分子受激可到達不同能級的激發(fā)態(tài)，但由于去活化（內(nèi)轉(zhuǎn)換和振動弛豫）到達第一電子激發(fā)態(tài)的速率或幾率很大，好像是分子受激只到達第一激發(fā)態(tài)一樣。換句話說，不管激發(fā)波長如何，電子都是從電子第一激發(fā)態(tài)的最低振動能層躍遷到基態(tài)的各個振動能層。iii）熒光激發(fā)光譜的形狀與發(fā)射波長無關(guān)由于在稀溶液中，熒光發(fā)射的效率(稱為量子產(chǎn)率)與激發(fā)光的波長無關(guān)，因此用不同發(fā)射波長繪制激發(fā)光譜時，激發(fā)光譜的形狀不變，只是發(fā)射強度不同而已。

iV）鏡像對稱通常熒光光譜與吸收光譜呈鏡像對稱關(guān)系（如下圖）。解釋1：能層結(jié)構(gòu)相似性熒光為第一電子激發(fā)單重態(tài)的最低振動能層躍遷到基態(tài)的各個振動能層而形成，即其形狀與基態(tài)振動能級分布有關(guān)。吸收光譜是由基態(tài)最低振動能層躍遷到第一電子激發(fā)單重態(tài)的各個振動能層而形成，即其形狀與第一電子激發(fā)單重態(tài)的振動能級分布有關(guān)。由于激發(fā)態(tài)和基態(tài)的振動能層分布具有相似性，因而呈鏡像對稱。S1S0解釋2：位能曲線（Frank-Condon原理）。由于電子吸收躍遷速率極快（10-15s），此時核的相對位置可視為不變（核較重）。當兩個能層間吸收躍遷的幾率越大，其相反躍遷的幾率也越大，即產(chǎn)生的光譜呈鏡像對稱4.影響熒光及熒光強度的因素

產(chǎn)生并可觀察到熒光的條件：i）分子具有與輻射頻率相應(yīng)的熒光結(jié)構(gòu)（內(nèi)因）；ii）吸收特征頻率的光后，應(yīng)可產(chǎn)生具一定量子效率的熒光。即量子效率足夠大：

kF熒光發(fā)射過程的速率常數(shù)，∑ki為其它有關(guān)過程的速率常數(shù)的總合?？梢?，凡是使kF增加，使其它去活化常數(shù)降低的因素均可增加熒光量子產(chǎn)率。通常，kF由分子結(jié)構(gòu)決定（內(nèi)因），而其它參數(shù)則由化學環(huán)境（外因）和結(jié)構(gòu)共同決定。下面討論影響熒光及強度的因素。1）躍遷類型：通常，具有—*及n—*躍遷結(jié)構(gòu)的分子才會產(chǎn)生熒光。而且具—*躍遷的量子效率比n—*躍遷的要大得多（前者大、壽命短）。2）共軛效應(yīng)：共軛度越大，熒光物質(zhì)的摩爾吸收系數(shù)越大，熒光越強。3）剛性結(jié)構(gòu)：分子剛性（Rigidity）越強，分子振動少，與其它分子碰撞失活的機率下降，熒光量子效率提高。如熒光素（=0.92）,酚酞（=0）芴（=1）聯(lián)苯（=0.18）給電子取代基增強熒光(p-共軛)，如-OH、-OR、-NH2、-CN、NR2等；吸電子基降低熒光，如-COOH、-C=O、-NO2、-NO、-X等；重原子降低熒光但增強磷光，如苯環(huán)被鹵素取代，從氟苯到碘苯，熒光逐漸減弱到消失。該現(xiàn)象也稱重原子效應(yīng)。這是因為原子序數(shù)高的原子中，電子自旋和軌道運動之間的相互作用大，增大了系間竄躍速度4）取代基：

溶劑極性可增加或降低熒光強度（改變—*及n—*躍遷的能量）；與溶劑作用從而改變熒光物質(zhì)結(jié)構(gòu)來增加或降低熒光強度。6）溫度5）溶劑效應(yīng)溫度增加，熒光強度下降（因為內(nèi)、外轉(zhuǎn)換增加、粘度或“剛性”降低）。因此體系降低溫度可增加熒光分析靈敏度。9）熒光猝滅：熒光物質(zhì)與溶劑分子或其他物質(zhì)的分子的相互作用引起熒光強度降低的現(xiàn)象稱為熒光猝滅。引起熒光強度降低的物質(zhì)稱為熄滅劑或猝滅劑。熒光猝滅的原因多，機理復(fù)雜。這里只討論幾種類型：8）內(nèi)濾光和自吸：體系內(nèi)存在可以吸收熒光的物質(zhì)，或熒光物質(zhì)的熒光短波長與激發(fā)光長波長有重疊，均可使熒光強度下降，稱為內(nèi)濾光；當熒光物質(zhì)濃度較大時，可吸收自身的熒光發(fā)射，稱為熒光自吸。7）pH值：具酸或堿性基團的有機物質(zhì)，在不同pH值時，其結(jié)構(gòu)可能發(fā)生變化，因而熒光強度將發(fā)生改變；對無機熒光物質(zhì)因pH值會影響其穩(wěn)定性，因而也可使其熒光強度發(fā)生改變。①碰撞猝滅:主要原因是，當處在單重激發(fā)態(tài)上的熒光分子M*與熄滅劑Q發(fā)生碰撞，使激發(fā)態(tài)分子以無輻射的躍遷方式回到基態(tài)，產(chǎn)生熒光熄滅作用。這個過程可用下列反應(yīng)式表示。顯然，熒光熄滅程度主要取決于相應(yīng)反應(yīng)的速率常數(shù)的相對大小和熄滅劑Q的濃度。

②靜態(tài)猝滅:熒光分子與猝滅劑形成不發(fā)熒光的基態(tài)配合物從而使熒光猝滅。氧是最典型的熒光猝滅劑，可能是順磁性的氧分子與處于單重激發(fā)態(tài)的熒光分子相互作用，加速熒光物質(zhì)激發(fā)態(tài)分子的系間竄躍導(dǎo)致熒光猝滅。③能量轉(zhuǎn)移：熄滅劑與激發(fā)單重態(tài)的熒光分子作用后，發(fā)生能量轉(zhuǎn)移，使熄滅劑Q得到激發(fā)。

④自熄滅和自吸收：自熄滅指溶液濃度較大時，激發(fā)態(tài)分子之間的碰撞引起能量損失，使熒光強度降低；自吸收是指，當熒光物質(zhì)的吸收光譜與熒光光譜重疊時熒光被溶液中處于基態(tài)的熒光分子吸收，導(dǎo)致熒光強度降低。5.定量分析熒光強度IF正比于該體系吸收的激發(fā)光的光強。

I0是入射光的強度；I是入射光通過厚度為b的介質(zhì)后的光強；常數(shù)K’取決于熒光效率。根據(jù)比耳定律代入上式，得

展開上式，得上式可近似為，

若恒定，有

上式表明熒光強度與熒光物質(zhì)的濃度成正比。不過這種線性關(guān)系只在稀溶液中才成立。

二、熒光儀器第一單色器或濾光片記錄儀第二單色器或濾光片熒光光源激發(fā)樣品池1）光源：要求具有強度大，適用波長范圍寬等特點，常用的有高壓汞燈和氙燈。前者使用的譜線365nm，405nm，436nm；后者是連續(xù)光源，可用于200-700nm波長范圍，此范圍內(nèi)光強幾乎相同。此外還有激光；3）兩個單色器：選擇激發(fā)光單色器；分離熒光單色器；前者用于選擇所需要的激發(fā)光的波長；后者消除溶液中可能存在的其它光線的干擾，以獲得所需要的熒光。4）檢測器：光電倍增管。2）樣品池：石英（低熒光材料）；熒光分析的特點：g/mL之間。可見，比UV-Vis的靈敏度高得多?、谶x擇性好：可同時用激發(fā)光譜和熒光發(fā)射光譜定性。③結(jié)構(gòu)信息量多：包括物質(zhì)激發(fā)光譜、發(fā)射光譜、光強、熒光量子效率、熒光壽命等。④應(yīng)用不廣泛：主要是因為能發(fā)熒光的物質(zhì)不具普遍性、增強熒光的方法有限、外界環(huán)境對熒光量子效率影響大、干擾測量的因素較多。三、磷光分析1.磷光的特點：

磷光波長比熒光的長(T1<S1)；磷光壽命比熒光的長(磷光為禁阻躍遷產(chǎn)生，速率常數(shù)小)；磷光壽命和強度對重原子和氧敏感(自旋軌道耦合，使去活化速率常數(shù)增加)。2.低溫磷光（液氮）

由于磷光壽命長，T1的非輻射躍遷（內(nèi)轉(zhuǎn)換）幾率增加，碰撞失活（振動弛豫）的幾率、光化學反應(yīng)幾率都增加，從而降低磷光強度。因此有必要在低溫下測量磷光。同時要求溶劑：易提純且在分析波長區(qū)無強吸收和發(fā)射；低溫下形成具有足夠粘度的透明的剛性玻璃體。常用的溶劑：EPA——乙醇+異戊烷+二乙醚（2+2+5）IEPA——CH3I+EPA（1+10）。3.室溫磷光

低溫磷光需低溫實驗裝置且受到溶劑選擇的限制，1974年后發(fā)展了室溫磷光（RTP）。1）固體基質(zhì)：在室溫下以固體基質(zhì)（如纖維素等）為吸附磷光體，增加分子剛性、減少三重態(tài)猝滅等非輻射躍遷，從而提高磷光量子效率。2）膠束增穩(wěn)：利用表面活性劑在臨界濃度形成具有多相性的膠束，改變磷光體的微環(huán)境、增加定向約束力，從而減小內(nèi)轉(zhuǎn)換和碰撞等去活化的幾率，提高三重態(tài)的穩(wěn)定性。

利用膠束增穩(wěn)、重原子效應(yīng)和溶液除氧是該法的三要素。3）敏化磷光：其過程可以簡單表示為：4.磷光儀器在熒光儀樣品池上增加磷光配件：低溫杜瓦瓶和斬光片。如右圖所示。斬光片的作用是利用其分子受激所產(chǎn)生的熒光與磷光的壽命不同獲取磷光輻射。轉(zhuǎn)筒式轉(zhuǎn)盤式6.2化學發(fā)光分析一、概述

1.化學發(fā)光:利用化學反應(yīng)所釋放的化學能激發(fā)了體系中某種化學物質(zhì)分子,當受激分子躍遷回到基態(tài)時而產(chǎn)生的光發(fā)射.2.化學發(fā)光分析法:利用化學發(fā)光測定體系中化學物質(zhì)濃度的方法直接化學發(fā)光：A+B→C*+D；C*→C+hν（被測物A的產(chǎn)物被激發(fā)發(fā)光）間接化學發(fā)光：A+B→C*+D；C*+F→F*+E；F*→F+hν（待測物的產(chǎn)物作為激發(fā)中間體將能量傳給受體F，F(xiàn)*發(fā)光。3.特點：（1）靈敏度極高。例如，用熒光素酶和三磷酸腺苷（ATP）的化學反應(yīng)可測定低至2×10-17moL·L-1的ATP。（2）測定線性范圍寬，一般有5-6個數(shù)量級。（3）儀器設(shè)備