一部分微生物利用

一部分微生物利用一部分微生物利用第1頁試驗?zāi)繕?.進行大腸桿菌擴增，利用液體培養(yǎng)基進行細菌培養(yǎng)操作2.進行大腸桿菌分離，用固體平面培養(yǎng)基進行細菌劃線培養(yǎng)3.說明大腸桿菌培養(yǎng)條件和試驗原理一部分微生物利用第2頁一.基礎(chǔ)知識（一）微生物（二）微生物培養(yǎng)基（三）無菌技術(shù)二.微生物試驗所需操作技術(shù)三.大腸桿菌培養(yǎng)和分離試驗四.課題小結(jié)一部分微生物利用第3頁1.1微生物結(jié)構(gòu)都相當簡單，個體多數(shù)十分微小，通常要用光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡才能看到，有甚至沒有細胞結(jié)構(gòu)。且體內(nèi)普通不含有葉綠素，不能進行光合作用五類病毒細菌放線菌真菌原生動物病毒界原核生物界真菌界原生生物界1.1.1微生物特點1.1.2微生物種類1.1.3細菌形態(tài)、結(jié)構(gòu)和菌落一部分微生物利用第4頁1.1.3細菌形態(tài)結(jié)構(gòu)和菌落圖1-1常見三種細菌經(jīng)典形態(tài)A.球菌B.桿菌C.弧菌單細胞不分枝原核微生物，細菌細胞微小而透明，通常見適當染料染色后顯微鏡觀察1.1.3.1細菌形態(tài)1.1.3.2細菌結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)：細胞壁、細胞膜、細胞質(zhì)，細胞質(zhì)中有液泡、儲存性顆粒、核質(zhì)等從屬結(jié)構(gòu)：鞭毛、纖毛、莢膜、芽孢（抗逆休眠體）等1.1.3.3菌落革蘭氏染色：陽性或陰性，細胞壁成份不一樣一部分微生物利用第5頁1.1.3.3菌落單個或少數(shù)細菌在固體培養(yǎng)基上大量繁殖時，就會形成一個肉眼可見，含有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)子細胞群體，叫做菌落細菌菌落特征因種而異

菌落是判定菌種主要依據(jù)大腸桿菌大腸菌群一部分微生物利用第6頁1.2微生物培養(yǎng)基培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是微生物生存環(huán)境和營養(yǎng)物質(zhì)1.2.1培養(yǎng)基分類（按物理形態(tài)分）（1）液體培養(yǎng)基（液）（2）半固體培養(yǎng)基（3）固體培養(yǎng)基添加瓊脂量決定1.2.2培養(yǎng)基所含成份（1）水（2）無機鹽（3）碳源（4）氮源（5）生長因子含碳無機物或有機物，后者通?？勺髂茉春獰o機鹽或有機物，用于合成氨基酸等生長必需，而本身不能合成化合物不一樣微生物所需無機鹽、碳源、氮源和生長因子種類不一樣培養(yǎng)基需要調(diào)整pH、滲透壓、控制含氧量等條件細菌：用蛋白胨和酵母提取物配制霉菌：用無機物或添加蔗糖豆芽汁配制細菌：中性偏堿（7.5~8.5）霉菌：中性偏酸（5.0~6.0）通常見NaCl調(diào)整一部分微生物利用第7頁1.3無菌技術(shù)1.3.1取得純凈微生物培養(yǎng)物關(guān)鍵預(yù)防外來雜菌入侵1.3.2無菌技術(shù)四個方面（1）對試驗操作空間、操作者衣著和手進行清潔和消毒

（2）將培養(yǎng)器皿、接種用具和培養(yǎng)基等器具進行滅菌（3）為防止周圍微生物污染，試驗操作應(yīng)在酒精燈火焰附近旁進行（4）防止已滅菌處理材料用具與周圍物品相接觸1.3.3消毒與滅菌一部分微生物利用第8頁1.3.3.1消毒使用較為溫和物理或化學(xué)方法僅殺死物體表面或內(nèi)部一個別對人體有害微生物普通不能殺死芽孢和孢子常見消毒方法常見于牛奶消毒煮沸消毒法巴氏消毒法紫外線消毒化學(xué)藥劑消毒法酒精、氯氣、石碳酸、煤酚皂溶液等一部分微生物利用第9頁在充分燃燒層灼燒1.3.3.2滅菌使用強烈理化原因殺死物體內(nèi)外全部微生物，包含芽孢和孢子常見滅菌方法和適用范圍灼燒滅菌干熱滅菌高壓蒸汽滅菌微生物接種工具（接種環(huán)、接種針）或其它金屬用具能耐高溫需要保持干燥物品（玻璃器皿）160－170℃；1－2h100kPa121℃15—30min最常見方式，通常見于培養(yǎng)基滅菌及各種器具滅菌一部分微生物利用第10頁2.微生物試驗所需操作技術(shù)2.1器具滅菌2.2培養(yǎng)液（基）配置、滅菌，放斜面和倒平板技術(shù)2.3細菌接種和純化技術(shù)棉花塞口牛皮紙（或報紙）包口或包扎60~80℃烘干121℃（1Kg/cm2）滅菌15min不能用脫脂棉：易吸水后造成污染2.3.1平板劃線法2.3.2稀釋涂布平板法簡便，常見效果好一部分微生物利用第11頁2.2培養(yǎng)液配置、滅菌，放斜面和倒平板技術(shù)

2.2.1配置LB（Luria-Bertani，溶菌肉湯）培養(yǎng)基配方蛋白胨：0.5g酵母提取物：0.25gNaCl：0.5g水：50mL瓊脂：1g（固體）pH：7.4～7.6配制過程計算、稱量混合加熱溶化NaOHHCl調(diào)pH（7．6）分裝三角漏斗分三角瓶試管棉塞或封口膜加塞包扎通氣；阻止微生物進入牛皮紙滅菌高壓蒸汽1Kg/cm2，121℃，15min放斜面倒平板未凝固時固體培養(yǎng)基一部分微生物利用第12頁分裝、放斜面、倒平板分裝培養(yǎng)基不能沾上塞子、管口和管壁易造成污染固體分裝試管，培養(yǎng)液不超出管高1/5便于放斜面液體分裝三角瓶，普通培養(yǎng)基高度為瓶高1/4左右本試驗中，將50mL液體LB培養(yǎng)基和50mL固體LB培養(yǎng)基分別裝入2個250mL三角瓶中，加封口膜（或棉塞）放斜面固體培養(yǎng)基置于試管中滅菌后，斜靠在平放鉛筆上，冷卻倒平板培養(yǎng)接種用菌種超凈臺和雙手消毒點燃酒精燈創(chuàng)造無菌環(huán)境倒平板操作一部分微生物利用第13頁倒平板操作倒平板操作中問題討論一部分微生物利用第14頁倒平板操作中問題討論

（1）培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50℃左右時，才能用來倒平板。你用什么方法來預(yù)計培養(yǎng)基溫度？（2）為何需要使錐形瓶瓶口經(jīng)過火焰？（3）平板冷凝后，為何要將平板倒置？（4）在倒平板過程中，假如不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間部位，這個平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為何？能夠用手觸摸盛有培養(yǎng)基錐形瓶，感覺錐形瓶溫度下降到剛才不燙手時，就能夠進行倒平板了經(jīng)過灼燒滅菌，預(yù)防瓶口微生物污染培養(yǎng)基平板冷凝后，皿蓋上會凝結(jié)水珠，凝固后培養(yǎng)基表面濕度也比較大，將平板倒置，既能夠使培養(yǎng)基表面水分更加好地揮發(fā)，又能夠預(yù)防皿蓋上水珠落入培養(yǎng)基，造成污染空氣中微生物可能在皿蓋與皿底之間培養(yǎng)基上滋生，所以最好不要用這個平板培養(yǎng)微生物一部分微生物利用第15頁2.3.1平板劃線法平板劃線法操作中問題討論一部分微生物利用第16頁平板劃線法操作問題討論1平板劃線詳細方法連續(xù)劃線法

交叉劃線法213平板劃線詳細方法（1）為何在操作第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時，依然需要灼燒接種環(huán)嗎？為何？每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束接種環(huán)上殘留菌種，使下一次劃線菌種直接起源于上次劃線末端，使每次劃線時菌種數(shù)目逐步降低，方便得到菌落。結(jié)束后要灼燒接種環(huán)以及時殺死殘留菌種，防止污染環(huán)境和感染操作者單菌落123460—70°一部分微生物利用第17頁平板劃線法操作問題討論2（2）在灼燒接種環(huán)之后，為何要等其冷卻后再進行劃線？（3）在作第二次以及其后劃線操作時，為何總是從上一次劃線末端開始劃線？以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種線條末端細菌數(shù)目較少，這么操作能使細菌數(shù)目伴隨劃線次數(shù)增加而逐步降低，最終得到由單個細菌繁殖而來菌落（4）為何平板劃線時不能劃破培養(yǎng)基表面？一是劃破后會造成劃線不均勻，難以到達分離單菌落目標二是存留在劃破處單個細胞無法形成規(guī)矩菌落，菌落會沿著劃破處生長，會形成一個條狀菌落一部分微生物利用第18頁2.3.2稀釋涂布平板法操作方法梯度稀釋

涂布分離問題：涂布平板全部操作都應(yīng)在火焰附近進行。結(jié)合平板劃線與系列稀釋無菌操作要求，想一想，第2步應(yīng)怎樣進行無菌操作？一部分微生物利用第19頁3.大腸桿菌培養(yǎng)和分離試驗3.1設(shè)備及用具滅菌鍋或高壓鍋、250ml三角瓶、封口膜和橡皮圈、直徑90mm培養(yǎng)皿、接種環(huán)和玻璃三角刮刀、恒溫培養(yǎng)箱、搖床、酒精燈和超凈臺、一次性塑料手套、裝有酒精棉球廣口瓶、鑷子、有棉塞試管（15mm×120mm）5支3.2試驗材料（1）50mlLB液體培養(yǎng)基：蛋白胨0.5g、酵母提取物0.25g、NaCl0.5g、加水50ml（2）大腸桿菌菌種斜面（3）空白斜面3.3試驗過程3.4課題結(jié)果評價革蘭氏陰性，兼性厭氧菌一部分微生物利用第20頁3.3試驗過程1.配制LB培養(yǎng)基2.滅菌LB液體培養(yǎng)基LB固體培養(yǎng)基各50mL，三角瓶3.倒平板固體冷卻成平板培養(yǎng)基4個培養(yǎng)皿液體4.接種擴充培養(yǎng)1.培養(yǎng)基冷卻2.接種環(huán)燒灼3.接種環(huán)在菌種斜面培養(yǎng)基上冷卻4.挑取菌種接種到液體培養(yǎng)基中5.37℃搖床震蕩培養(yǎng)12h培養(yǎng)大腸桿菌菌種5.平板劃線分離37℃培養(yǎng)24h4℃保留6.單菌落接種6.菌種培養(yǎng)、保留1.挑取單菌落菌種2.斜面連續(xù)劃線酒精燈旁操作細菌培養(yǎng)分離視頻一部分微生物利用第21頁3.4課題結(jié)果評價培養(yǎng)基制作是否合格接種操作是否符合無菌要求是否進行了及時細致觀察與統(tǒng)計假如未接種培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫1～2d