微生物染色專題知識講座

微生物染色專題知識講座微生物染色專題知識講座第1頁一、試驗?zāi)繕?biāo)學(xué)習(xí)微生物染色原理、染色基礎(chǔ)操作技術(shù)，從而掌握微生物普通染色法和革蘭氏染色法。微生物染色專題知識講座第2頁二、染色原理因為微生物細(xì)胞含有大量水分，對光線吸收和反射與水溶液差異不大,機(jī)體是無色透明，與周圍背景沒有顯著反差,在普通光學(xué)顯微鏡下不易識別，必須對它們進(jìn)行染色，使經(jīng)染色后菌體與背景形成顯著色差，從而能更清楚地觀察到其形態(tài)和結(jié)構(gòu)。微生物細(xì)胞是由蛋白質(zhì)、核酸等兩性電解質(zhì)及其它化合物組成。所以，微生物細(xì)胞表現(xiàn)出兩性電解質(zhì)性質(zhì)。兩性電解質(zhì)兼有堿性基和酸性基，在酸性溶液中離解出堿性基呈堿性帶正電。在堿性溶液中離解出酸性基呈酸性帶負(fù)電。經(jīng)測定，細(xì)菌等電點pH在2-5之間，故在中性、堿性或偏酸性溶液中，細(xì)菌等電點均低于上述溶液pH值，所以細(xì)菌帶負(fù)電荷，輕易與帶正電荷堿性染料結(jié)合，故用堿性染料染色較多。微生物體內(nèi)各結(jié)構(gòu)與染料結(jié)協(xié)力不一樣，故可用各種染料分別染微生物各結(jié)構(gòu)方便觀察。微生物染色專題知識講座第3頁三、染色方法(一)簡單染色法簡單染色法又叫作普通染色法，只用一個染料使細(xì)菌染上顏色，假如僅為了在顯微鏡下看清細(xì)菌形態(tài)，用簡單染色即可。微生物染色專題知識講座第4頁(二)復(fù)染色法用兩種或各種染料染細(xì)菌，目標(biāo)是為了判別不一樣性質(zhì)細(xì)菌，所以又叫判別染色法。主要復(fù)染色法有革蘭氏染色法和抗酸性染色法。革蘭氏染色法：不但能觀察到細(xì)菌形態(tài)，而且還可將全部細(xì)菌區(qū)分為兩大類：染色反應(yīng)呈藍(lán)紫色稱為革蘭氏陽性細(xì)菌，用G+表示；染色反應(yīng)呈紅色（復(fù)染顏色）稱為革蘭氏陰性細(xì)菌，用G-表示。細(xì)菌對革蘭氏染色不一樣反應(yīng)，是因為它們細(xì)胞壁成份和結(jié)構(gòu)不一樣而造成。微生物染色專題知識講座第5頁四、試驗材料1.顯微鏡、香柏油、二甲苯、擦鏡紙、吸水紙、接種環(huán)、載玻片、酒精燈等。2.石炭酸復(fù)紅染液、草酸銨結(jié)晶紫染液、碘液、95％乙醇、蕃紅染液3.菌種：金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、大腸桿菌微生物染色專題知識講座第6頁五、試驗內(nèi)容與步驟(一)細(xì)菌簡單染色步驟涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→鏡檢1．涂片取潔凈載玻片于試驗臺上，在載玻片中央滴一滴無菌蒸餾水，將接種環(huán)在火焰上燒紅，待冷卻后從斜面挑取少許菌種(金黃色葡萄球菌或枯草桿菌)與玻片上水滴混勻后，在載玻片上涂布成一均勻薄層，涂布面不宜過大。2．干燥涂片最好在室溫下使其自然干燥，有時為了使之干得更加快些，可將標(biāo)本面向上，手持載玻片一端兩側(cè)，小心地在酒精燈上高處微微加熱，使水分蒸發(fā)，但切勿緊靠火焰或加熱時間過長，以防標(biāo)本烤枯而變形。

微生物染色專題知識講座第7頁3．固定固定經(jīng)常利用高溫，手持載玻片一端，標(biāo)本向上，在酒精燈火焰外層盡快往返經(jīng)過2~3次，共約2~3秒鐘，并不時以載玻片后面加熱觸及皮膚，不覺過燙為宜（不超出60℃）,放置待冷后，進(jìn)行染色。4．染色在涂片薄膜上滴加染色液(石炭酸復(fù)紅、草酸銨結(jié)晶紫或美藍(lán)任選一個)一滴，使染色液覆蓋涂片，染色約1min。5．水洗斜置載玻片，在自來水龍頭下用小股水流沖洗，直至洗下水呈無色為止。6．干燥用吸水紙吸去涂片邊緣水珠，置于室溫下自然干燥。用吸水紙時切勿將菌體擦掉。

微生物染色專題知識講座第8頁7．鏡檢用顯微鏡觀察，并用鉛筆繪出細(xì)菌形態(tài)圖。(二)細(xì)菌革蘭氏染色步驟涂片→干燥→固定→初染→水洗→媒染→水洗→脫色→水洗→復(fù)染→水洗→干燥→觀察1．取大腸桿菌和枯草桿菌(均以無菌操作)分別做涂片、干燥、固定，方法均與簡單染色相同。2．用草酸銨結(jié)晶紫染色1min后水洗。3．加碘液媒染1min后水洗。4．斜置載玻片，滴加95％乙醇脫色，至流出乙醇不現(xiàn)紫色為止，大約需時20~30s，隨即水洗。微生物染色專題知識講座第9頁5．用蕃紅染液復(fù)染1min，水洗。6．用吸水紙吸掉水滴，待標(biāo)本片干后置顯微鏡下，用低倍鏡觀察，發(fā)覺目標(biāo)物后用油鏡觀察，注意細(xì)菌細(xì)胞顏色。繪出細(xì)菌形態(tài)圖并說明革蘭氏染色結(jié)果。微生物染色專題知識講座第10頁六、注意事項1．革蘭氏染色成敗關(guān)鍵是脫色時間，如脫色過分，革蘭氏陽性菌也可被脫色而被誤認(rèn)為革蘭氏陰性菌；如脫色時間過短，革蘭氏陰性菌也會被誤認(rèn)為是革蘭氏陽性菌。所以必須嚴(yán)格把握脫色時間。

2．選取培養(yǎng)18-24小時菌齡細(xì)菌為宜，若細(xì)菌太老，因為菌體死亡或自溶常使革蘭氏陽性菌轉(zhuǎn)呈陰性反應(yīng)。微生物染色專題知識講座第11頁思索題及試驗作業(yè)1．不經(jīng)復(fù)染這一步，能否區(qū)分革蘭氏陽性菌和陰性菌？2．經(jīng)過革蘭氏染色，你認(rèn)為它在微生物學(xué)中有何實踐意義？七、試驗結(jié)果簡單染色：金黃色葡萄球菌和枯草桿菌染成（）色