儀器分析-紫外-可見分光光度法

儀器分析-紫外—可見分光光度法..第一頁(yè)，共123頁(yè)。學(xué)習(xí)內(nèi)容

（第6～9周）紫外-可見分光光度法（第3章）分子發(fā)光分析法（第5章）紅外光譜法（第4章）分子?光譜第二頁(yè)，共123頁(yè)。第3章紫外-可見分光光度法

ultravioletandvisiblespectrophotometry

（UV-Vis）

3.1

紫外-可見吸收光譜3.2

光的吸收定律3.3

紫外-可見分光光度計(jì)3.4

分析條件的選擇3.5

紫外-可見吸收光譜法的應(yīng)用第三頁(yè)，共123頁(yè)?；靖拍顂pectrum：復(fù)色光被色散系統(tǒng)分光后按照波長(zhǎng)或頻率的大小依次排列的圖像。

spectrum第四頁(yè)，共123頁(yè)。spectroscopicanalysis：利用物質(zhì)的光譜進(jìn)行定性、定量和結(jié)構(gòu)分析的方法。(是以光與物質(zhì)的相互作用為基礎(chǔ)建立起來(lái)的儀器分析方法。)基本概念250500第五頁(yè)，共123頁(yè)。基本概念

UV-Vis：利用某些物質(zhì)分子對(duì)200～800nm

光譜區(qū)域內(nèi)輻射能的吸收來(lái)研究物質(zhì)的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和含量的方法。UV-Vis主要反映共軛體系和芳香族化合物的結(jié)構(gòu)特征。第六頁(yè)，共123頁(yè)。3.1紫外-可見吸收光譜(基本原理)500250鄰甲苯胺紫外-可見吸收光譜圖第七頁(yè)，共123頁(yè)。3.1紫外-可見吸收光譜光的基本性質(zhì)；物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收；分子吸收光譜的形成；有機(jī)化合物的紫外-可見光譜；無(wú)機(jī)化合物的紫外-可見光譜；紫外-可見光譜中的常用術(shù)語(yǔ)；影響紫外-可見吸收光譜的因素第八頁(yè)，共123頁(yè)。光的基本性質(zhì)光是一種電磁波，具有波粒二象性。

E＝hυ

υ＝c/λ

波長(zhǎng)越長(zhǎng)，光量子能量越小，反之能量越大。E=hc/λ第九頁(yè)，共123頁(yè)。舉例：白光硫酸銅溶液？色的光被吸收呈藍(lán)色互補(bǔ)色光：如果兩種顏色的光按一定比例混合后可成為白色光，這兩種光稱互補(bǔ)色光。（黃色）

物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收第十頁(yè)，共123頁(yè)。/nm

顏色

互補(bǔ)光400-450紫黃綠450-480藍(lán)黃480-490綠藍(lán)橙490-500藍(lán)綠紅500-560綠紅紫560-580黃綠紫580-610黃藍(lán)610-650橙綠藍(lán)650-760紅藍(lán)綠第十一頁(yè)，共123頁(yè)。物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收是物質(zhì)與輻射能相互作用的一種形式。只有當(dāng)入射光的能量（Eλ）與吸光物質(zhì)分子從基態(tài)躍遷到某一激發(fā)態(tài)所需能量（△E）相等時(shí)才會(huì)被吸收。第十二頁(yè)，共123頁(yè)。

激發(fā)態(tài)

E1

E=Eλ

基態(tài)

E0躍遷幾率越大，物質(zhì)的摩爾吸光系數(shù)越大。第十三頁(yè)，共123頁(yè)。3.1.1紫外-可見分子吸收光譜的形成

UV-Vis是分子吸收光譜，它的產(chǎn)生可以看做是分子對(duì)紫外-可見光光子選擇性俘獲的過(guò)程，本質(zhì)上是分子內(nèi)價(jià)電子躍遷的結(jié)果。第十四頁(yè)，共123頁(yè)。

分子的價(jià)電子在吸收電磁輻射并躍遷到高能級(jí)后所產(chǎn)生的吸收光譜，通常被稱為電子光譜，由于其波長(zhǎng)范圍是在光譜的紫外和可見區(qū)，所以電子光譜又叫紫外/可見光譜。紫外可見光譜的產(chǎn)生第十五頁(yè)，共123頁(yè)。3.1.1紫外-可見分子吸收光譜的形成

分子內(nèi)部運(yùn)動(dòng)價(jià)電子運(yùn)動(dòng)Ee核的振動(dòng)Ev分子繞其重心的轉(zhuǎn)動(dòng)Er△E=△Ee+△Ev+△Er△Ee>△Ev>

△Er第十六頁(yè)，共123頁(yè)。帶狀光譜線光譜第十七頁(yè)，共123頁(yè)。化合物的紫外-可見光譜決定于分子的結(jié)構(gòu)和分子軌道上電子的性質(zhì)。300400500600700/nm350525545Cr2O72-MnO4-1.00.80.60.40.2Absorbance350第十八頁(yè)，共123頁(yè)。化合物分子的特征吸收波長(zhǎng)（λmax）決定于分子的激發(fā)態(tài)與基態(tài)之間的能量差。第十九頁(yè)，共123頁(yè)。3.1.2有機(jī)化合物的紫外-可見吸收光譜

O：nCπHH

σ

σ*

>π*

>n>

π>σ與紫外-可見吸收光譜產(chǎn)生有關(guān)的電子：第二十頁(yè)，共123頁(yè)。有機(jī)化合物分子內(nèi)電子躍遷類型σ

σ*

nσ*

n

π*

ππ*

分子的電子能級(jí)躍遷σ*π*nπσ

E第二十一頁(yè)，共123頁(yè)。3.1.2有機(jī)化合物的紫外-可見吸收光譜（1）σ

σ*躍遷：發(fā)生在遠(yuǎn)紫外區(qū)，實(shí)際應(yīng)用價(jià)值不大。例：甲烷λmax125nm.（2）nσ*躍遷：含有未共享電子對(duì)的取代基都可能發(fā)生這一躍遷，所需能量取決于n電子所屬原子的性質(zhì)。例：碘甲烷λmax259nm.1.飽和有機(jī)化合物第二十二頁(yè)，共123頁(yè)。3.1.2有機(jī)化合物的紫外-可見吸收光譜

ππ*

躍遷可發(fā)生在任何具有不飽和鍵的

有機(jī)化合物分子中。特征是ε較大，為強(qiáng)吸收（K帶，共軛作用得名）。

n

π*

躍遷發(fā)生在含有雜原子雙鍵的不飽和有機(jī)化合物中，吸收強(qiáng)度弱（R帶，雜原子不飽和基團(tuán)得名）。2.

不飽和脂肪族化合物第二十三頁(yè)，共123頁(yè)。3.1.2有機(jī)化合物的紫外-可見吸收光譜3.芳香族化合物E1和E2是由苯環(huán)中的ππ*

躍遷產(chǎn)生，B帶由苯得名，是芳香族化合物特征吸收帶。第二十四頁(yè)，共123頁(yè)。3.1.3無(wú)機(jī)化合物的紫外-可見光譜1.電荷轉(zhuǎn)移光譜

電荷轉(zhuǎn)移光譜：某些無(wú)機(jī)配合物和有機(jī)物可產(chǎn)生此類光譜,實(shí)質(zhì)是分子內(nèi)氧化還原過(guò)程；其特點(diǎn)是摩爾吸光系數(shù)大(>104)，用于定量分析可獲得較高的檢測(cè)靈敏度。第二十五頁(yè)，共123頁(yè)。3.1.3無(wú)機(jī)化合物的紫外-可見光譜2.配位體場(chǎng)吸收光譜

ε＜102,位于可見光區(qū)，較少用于定量分析，可用于研究配合物的結(jié)構(gòu)及無(wú)機(jī)配合物鍵合理論。第二十六頁(yè)，共123頁(yè)。第二十七頁(yè)，共123頁(yè)。3.1.4紫外-可見光譜中的常用術(shù)語(yǔ)（P25自學(xué)）吸收峰谷肩峰末端吸收吸收峰第二十八頁(yè)，共123頁(yè)。

是指分子中產(chǎn)生吸收帶的主要官能團(tuán)；吸收帶的λmax＞210nm,屬于π→π*

、n→π*等躍遷類型。

生色團(tuán)為不飽和基團(tuán)：C=C、N=N-、C=O、C=S、-NO2等；生色團(tuán)吸收帶的位置受相鄰取代基或溶劑效應(yīng)的影響，吸收峰向長(zhǎng)波或短波移動(dòng)。生色團(tuán)(chromophore)第二十九頁(yè)，共123頁(yè)。助色團(tuán)(auxochrome)是指分子中一些帶有非成鍵電子的雜原子飽和基團(tuán),本身在紫外-可見光區(qū)不產(chǎn)生吸收，但是當(dāng)它與生色團(tuán)連接后，使生色團(tuán)的吸收帶向長(zhǎng)波移動(dòng)，且吸收強(qiáng)度增強(qiáng)。-OH、-OR、-NH2、-SH、-Cl、-Br、-I等第三十頁(yè)，共123頁(yè)。

溶劑效應(yīng)體系pH的影響

3.1.5影響紫外-可見光譜的因素共軛效應(yīng)立體化學(xué)效應(yīng)分子結(jié)構(gòu)分析條件核心是對(duì)分子中電子共軛結(jié)構(gòu)的影響UV-Vis主要反映共軛體系和芳香族化合物的結(jié)構(gòu)特征第三十一頁(yè)，共123頁(yè)。3.1.5影響紫外-可見光譜的因素1.共軛效應(yīng)：共軛的π電子在整個(gè)共軛體系內(nèi)流動(dòng)，屬于共軛基鏈上全部原子所有，所以它們受到的束縛力較小，只要受到能量較低的輻射即可被激發(fā)。共軛體系越長(zhǎng)，最大吸收波長(zhǎng)越向長(zhǎng)波方向移動(dòng)，吸收強(qiáng)度也增強(qiáng)。第三十二頁(yè)，共123頁(yè)。3.1.5影響紫外-可見光譜的因素2.立體化學(xué)效應(yīng)空間位阻跨環(huán)效應(yīng)第三十三頁(yè)，共123頁(yè)。3.1.5影響紫外-可見光譜的因素物質(zhì)以氣態(tài)存在時(shí)的吸收光譜精細(xì)結(jié)構(gòu)；物質(zhì)在極性溶劑中的吸收光譜溶劑化。3.

溶劑效應(yīng)溶劑對(duì)吸收峰的位置、強(qiáng)度及光譜形狀均有影響第三十四頁(yè)，共123頁(yè)。溶劑效應(yīng)

（1）溶劑極性對(duì)ππ*躍遷的影響

π*

π*

π

能量E非

E極π水>甲醇>乙醇>丙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>氯仿>二氯甲烷>苯>四氯化碳>己烷>石油醚第三十五頁(yè)，共123頁(yè)。溶劑效應(yīng)（2）溶劑極性對(duì)n

π*躍遷的影響能量π*n

E非π*nE極第三十六頁(yè)，共123頁(yè)。（a）苯酚的UV光譜圖（b）苯胺的UV光譜圖

4.

體系pH值對(duì)吸收帶的影響第三十七頁(yè)，共123頁(yè)。小結(jié)：

UV-Vis涉及分子外層電子的能級(jí)躍遷；光譜區(qū)域在200～800nm；有機(jī)、無(wú)機(jī)化合物紫外-可見光區(qū)電子躍遷的類型；影響紫外-可見吸收光譜的因素。UV-Vis法是分子光譜分析法，利用的是分子對(duì)外來(lái)輻射的吸收特性；第三十八頁(yè)，共123頁(yè)。課后練習(xí)1.何為生色團(tuán)、助色團(tuán)？2.紫外吸收光譜法中，極性溶劑為什么會(huì)使ππ*躍遷的吸收峰長(zhǎng)移，卻使ｎπ*躍遷的吸收峰短移？3.課后題1、2（P50）第三十九頁(yè)，共123頁(yè)。本節(jié)參考書

1.《分析化學(xué)》，人民衛(wèi)生出版社，參考“紫外-可見分光光度法的基本原理和概念”的相關(guān)內(nèi)容。2.《儀器分析》，復(fù)旦大學(xué)出版社，參考第二章“紫外-可見吸收光譜法”的相關(guān)內(nèi)容。

3.《無(wú)機(jī)化學(xué)》，高等教育出版社，參考“化學(xué)鍵與分子結(jié)構(gòu)”的內(nèi)容。第四十頁(yè)，共123頁(yè)。復(fù)習(xí)紫外-可見吸收光譜的形成；有機(jī)物、無(wú)機(jī)物的紫外-可見吸收光譜；影響紫外-可見吸收光譜的因素本次課內(nèi)容3.2Lambert-Beer’s

Law3.3

紫外-可見分光光度計(jì)第四十一頁(yè)，共123頁(yè)。3.2Lambert-Beer’sLaw

（分光光度法定量分析的基礎(chǔ)）選定波長(zhǎng)的入射光待測(cè)溶液

A？c被測(cè)組分的含量透射光T第四十二頁(yè)，共123頁(yè)。3.2.13.2.2T,A,Lambert-Beer’sLaw

IrI0ItIa

I0=Ia+It+Ir

(1)第四十三頁(yè)，共123頁(yè)。3.2.13.2.2T,A,Lambert-Beer’sLawI0=Ia+It+Ir

（1）

I0=Ia+It

（2）

T=

It/I0

（3）A=-lgT

（4）如果在多組分溶液中，各組分間不存在相互作用，測(cè)得的吸光度具有加和性。這一性質(zhì)是分光光度法測(cè)定混合組分的依據(jù)。第四十四頁(yè)，共123頁(yè)。3.2.13.2.2T,A,Lambert-Beer’sLawLambert定律描述了A與l的關(guān)系A(chǔ)=k′lBeer定律描述了A與c的關(guān)系A(chǔ)=k″c

實(shí)驗(yàn)證明，溶液對(duì)光的吸收程度(A)與c、l、λ有關(guān)。第四十五頁(yè)，共123頁(yè)。Lambert-Beer’sLaw

當(dāng)入射光波長(zhǎng)一定時(shí)，溶液對(duì)光的吸收程度只與溶液濃度和液層厚度有關(guān)。

A=kcl=-lgT=lgI0/It

(5)上式說(shuō)明T與c,l

之間是指數(shù)函數(shù)的關(guān)系，當(dāng)c增加一倍時(shí)，T降至T2；而A與c,l

之間是簡(jiǎn)單的正比關(guān)系。第四十六頁(yè)，共123頁(yè)。3.2.3吸光系數(shù)-k摩爾吸光系數(shù)吸光系數(shù)百分吸光系數(shù)K值物理意義：數(shù)值上等于吸光物質(zhì)在單位濃度和單位厚度時(shí)的吸光度值。在給定波長(zhǎng)、溶劑和溫度等條件下，K是物質(zhì)特征常數(shù)，表明物質(zhì)對(duì)某一特定波長(zhǎng)光的吸收能力。ε1ε2第四十七頁(yè)，共123頁(yè)。摩爾吸光系數(shù)（ε）

當(dāng)l以cm

表示，c以mol/L表示時(shí)，k值稱為摩爾吸光系數(shù)，用ε表示。單位是L·mol-1·cm-1

。A=εlc第四十八頁(yè)，共123頁(yè)。摩爾吸光系數(shù)與靈敏度ε是吸光物質(zhì)分子的一個(gè)特征常數(shù)，可作為估量定量分析方法靈敏度的指標(biāo)。ε越大，改變濃度而引起的吸光度的改變就越顯著，測(cè)定的靈敏度也就越高。提高摩爾吸光系數(shù)的方法分子結(jié)構(gòu)測(cè)量條件第四十九頁(yè)，共123頁(yè)。吸光系數(shù)（a）

當(dāng)c以g/L

表示時(shí)，k

值稱吸光系數(shù)，單位是：L·g-1·cm–1

。A=alc

A1cm1%

(百分吸光系數(shù))

一種吸光物質(zhì)的百分濃度為1%（g/100ml）的溶液在1cm吸收池中的吸光度。

A=a1cm

1%

lca1cm

1%=10a=10ε/M（6）第五十頁(yè)，共123頁(yè)。例題用紫外-可見分光光度法測(cè)定Fe，有下述兩種方法。A法：a=1.97X102L?g-1?cｍ-1;B法:ε=4.10X103L?mol?cｍ-1.問(wèn)：何種方法靈敏度高？第五十一頁(yè)，共123頁(yè)。3.2.4偏離Lambert-BeerLaw的因素偏離Lambert-BeerLaw

的因素主要與樣品（化學(xué)因素）和儀器（光學(xué)因素）有關(guān)。

A=kcl第五十二頁(yè)，共123頁(yè)。1.與測(cè)定樣品溶液有關(guān)的因素A=klc當(dāng)c不變時(shí)

A與l之間的線性關(guān)系普遍存在A=klc當(dāng)l不變時(shí)c

>0.01M

時(shí),A與c的線性關(guān)系會(huì)發(fā)生偏差。吸收定律是一個(gè)有限的定律(1)濃度第五十三頁(yè)，共123頁(yè)。為什么在

c>0.01M時(shí),A與c的線性關(guān)系會(huì)發(fā)生偏差？當(dāng)c>0.01M

時(shí)當(dāng)c≤0.01M

時(shí)比爾定律在低濃度時(shí)正確，高濃度時(shí)受限。1.鄰近質(zhì)點(diǎn)彼此電荷分布2.各組分之間的相互作用分子間的相互作用可忽略不計(jì)第五十四頁(yè)，共123頁(yè)。(2)溶劑

由于待測(cè)物與溶劑發(fā)生締合、離解及溶劑化反應(yīng)，產(chǎn)生的生成物與待測(cè)物具有不同的吸收光譜，出現(xiàn)化學(xué)偏離。(3)光散射的影響當(dāng)試樣是膠體或有懸浮物時(shí)，入射光通過(guò)溶液后，有一部分光因散射而損失，使吸光度增大，對(duì)BeerLaw

產(chǎn)生正偏差。第五十五頁(yè)，共123頁(yè)。

2.與儀器有關(guān)的因素Lambert-BeerLaw只適用于單色光。單色光：是由單色器從連續(xù)光譜中分離出的一小段波長(zhǎng)范圍的復(fù)合光，不是絕對(duì)的單色光，有可能造成對(duì)比爾定律的偏移。譜帶寬度（bandwidth）：指具有某一波長(zhǎng)范圍的光譜帶，常用半峰寬來(lái)表示。第五十六頁(yè)，共123頁(yè)。譜帶寬度對(duì)吸收定律的影響

相同譜帶寬度的情況下，選擇哪一個(gè)譜帶寬度（波長(zhǎng)）作為測(cè)定波長(zhǎng)？

實(shí)驗(yàn)證明：選用一束吸光度隨波長(zhǎng)變化不大的復(fù)合光作為入射光進(jìn)行測(cè)定（吸光物質(zhì)最大吸收波長(zhǎng)）。由于在此范圍內(nèi)，吸光物質(zhì)的吸光系數(shù)變化不大，對(duì)比爾定律造成的偏離較小，并能保證測(cè)定有較高的靈敏度。第五十七頁(yè)，共123頁(yè)。譜帶寬度對(duì)吸收定律的影響

圖示：AλAc譜帶A譜帶B譜帶A譜帶B?A1?A2第五十八頁(yè)，共123頁(yè)。3.3紫外-可見分光光度計(jì)

UV-Visspectrophotometer3.3.1

儀器主要部件及作用3.3.2常用分光光度計(jì)類型及功能簡(jiǎn)介3.3.3分光光度計(jì)的校正第五十九頁(yè)，共123頁(yè)。3.3.1主要部件及作用0.575光源單色器吸收池檢測(cè)器顯示第六十頁(yè)，共123頁(yè)。3.3.2分光光度計(jì)類型簡(jiǎn)介1.單波長(zhǎng)分光光度計(jì)單光束分光光度計(jì)雙光束分光光度計(jì)2.

雙波長(zhǎng)分光光度計(jì)第六十一頁(yè)，共123頁(yè)。1.單波長(zhǎng)分光光度計(jì)

單光束分光光度計(jì)特點(diǎn)：只有一條光束第六十二頁(yè)，共123頁(yè)。單光束分光光度計(jì)

不足：要求光源和檢測(cè)系統(tǒng)必須要有較高的穩(wěn)定性；每更換一個(gè)測(cè)定波長(zhǎng)，都要用空白溶液重新校準(zhǔn)。

實(shí)驗(yàn)：蘆丁含量測(cè)定；差示法測(cè)定樣品中高含量鎳。752型紫外-可見分光光度計(jì)第六十三頁(yè)，共123頁(yè)。

單波長(zhǎng)雙光束分光光度計(jì)特點(diǎn)：在同一臺(tái)儀器中使用兩個(gè)完全相同的光束。第六十四頁(yè)，共123頁(yè)。雙光束分光光度計(jì)優(yōu)點(diǎn)：可自動(dòng)掃描樣品溶液吸收光譜；消除光源強(qiáng)度不穩(wěn)引入的誤差；儀器開機(jī)后無(wú)須預(yù)熱可直接測(cè)樣；能減小放大器增益的漂移。

島津UV3101型吸光度測(cè)定光譜掃描時(shí)間光譜掃描功能第六十五頁(yè)，共123頁(yè)。雙波長(zhǎng)分光光度計(jì)

特點(diǎn)：

可將兩種不同波長(zhǎng)的光交替通過(guò)同一樣品

溶液，得到這兩個(gè)波長(zhǎng)下的吸光信號(hào)，再通過(guò)適當(dāng)?shù)男盘?hào)轉(zhuǎn)換系統(tǒng)轉(zhuǎn)換為它們之間的吸光度差A(yù)。

A=Aλ1–Aλ2

第六十六頁(yè)，共123頁(yè)。雙波長(zhǎng)分光光度計(jì)

優(yōu)點(diǎn)：不需要參比溶液；能夠減少背景吸收和干擾吸收以及光源電壓變化產(chǎn)生的影響；可用于相互有干擾的多組分混合物的分析。島津UV300型第六十七頁(yè)，共123頁(yè)。3.3.3分光光度計(jì)的校正波長(zhǎng)校正：檢查儀器的波長(zhǎng)刻度與實(shí)際波長(zhǎng)是否能較好的保持一致。用鐠釹玻璃或鈥玻璃第六十八頁(yè)，共123頁(yè)。3.3.3分光光度計(jì)的校正吸光度校正：在實(shí)際工作中，有時(shí)需對(duì)儀器的吸光度標(biāo)度進(jìn)行檢查和校正。用K2CrO4標(biāo)準(zhǔn)溶液吸收池校正：在吸收池A內(nèi)裝入試樣溶液，B內(nèi)裝入?yún)⒈热芤?，測(cè)吸光度；洗凈、調(diào)換兩種溶液，再測(cè)吸光度。前后兩次測(cè)得吸光度差值應(yīng)小于1%。第六十九頁(yè)，共123頁(yè)。臨床檢驗(yàn)常用分子光譜儀酶標(biāo)儀、全自動(dòng)生化分析儀、尿液分析儀、血紅蛋白測(cè)定儀：專用分光光度計(jì)，工作原理均遵循朗伯-比爾定律，采用比色法進(jìn)行分析，儀器的核心都有一個(gè)“分光光度計(jì)”。知識(shí)拓展第七十頁(yè)，共123頁(yè)。酶標(biāo)儀是一臺(tái)變相的專用分光光度計(jì)；是酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)專用儀器；利用比色法來(lái)分析抗原或抗體的含量。如：血清中乙肝病毒表面抗原、抗體的檢測(cè)。第七十一頁(yè)，共123頁(yè)。全自動(dòng)生化分析儀主要采用比色法進(jìn)行分析，工作波長(zhǎng)在340～800nm之間；通過(guò)對(duì)人體血液中脂類、酶類、蛋白質(zhì)、膽紅素等的分析來(lái)測(cè)定各種生化指標(biāo)；是臨床最常用的檢驗(yàn)儀器之一。第七十二頁(yè)，共123頁(yè)。尿液分析儀是檢測(cè)尿液中某些化學(xué)成分（尿蛋白、葡萄糖、膽紅素等）含量的專用自動(dòng)化儀器；是反射光比色計(jì)，采用球面積分儀接受雙波長(zhǎng)反射光，檢測(cè)試紙帶顏色變化進(jìn)行定量分析。第七十三頁(yè)，共123頁(yè)。血紅蛋白測(cè)定儀用光電器件測(cè)透射光強(qiáng)度，并與已定標(biāo)的血色素值相比較，即可得出血紅蛋白含量；本質(zhì)是一臺(tái)專用比色計(jì)。第七十四頁(yè)，共123頁(yè)。小結(jié)Lambert-Beer’sLaw的數(shù)學(xué)表達(dá)式，吸光系數(shù)，偏離定律的因素；紫外-可見分光光度計(jì)各類型儀器特點(diǎn)。習(xí)題：課后3、5、9、15（P50）第七十五頁(yè)，共123頁(yè)。本節(jié)課參考書1.《儀器分析》復(fù)旦大學(xué)出版社2.《最新儀器分析技術(shù)全書》化學(xué)工業(yè)出版社3.《分析化學(xué)》人民衛(wèi)生出版社4.《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》東南大學(xué)出版社第七十六頁(yè)，共123頁(yè)。復(fù)習(xí)Lambert-Beer’sLaw，吸光系數(shù)，偏離定律的因素；紫外-可見分光光度計(jì)的主要部件，主要類型。本次課內(nèi)容3.4分析條件的選擇

3.5

紫外-可見吸收光譜的應(yīng)用第七十七頁(yè)，共123頁(yè)。3.4分析條件的選擇

3.4.1

儀器測(cè)量條件的選擇3.4.2反應(yīng)條件的選擇3.4.3參比溶液的選擇3.4.4干擾及消除方法第七十八頁(yè)，共123頁(yè)。

3.4分析條件的選擇提高方法的靈敏度、準(zhǔn)確度儀器測(cè)量條件試樣反應(yīng)條件參比溶液干擾及消除第七十九頁(yè)，共123頁(yè)。3.4.1

儀器測(cè)量條件

入射光波長(zhǎng)的選擇雜散光的影響透光率讀數(shù)的影響（選擇合適的吸光度范圍）第八十頁(yè)，共123頁(yè)。入射光波長(zhǎng)的選擇應(yīng)用“最大吸收原則”，在此波長(zhǎng)（λmax）下測(cè)定，吸光系數(shù)大，靈敏度高。當(dāng)最大吸收峰峰形比較尖銳時(shí)，可選吸收稍低、峰形稍平坦的次強(qiáng)峰或肩峰進(jìn)行測(cè)定。當(dāng)有干擾物存在時(shí)，可根據(jù)“吸收盡可能大，干擾盡可能小的原則”選擇入射光波長(zhǎng)。第八十一頁(yè)，共123頁(yè)。雜散光的影響

設(shè)雜散光強(qiáng)度為Is

,測(cè)得吸光度為：

A測(cè)=lgI0+IsIt+IsIt<I0，I0+IsIt+Is<I0/It即A測(cè)<

A，令I(lǐng)s/I0=

S,有：Is=S·I0雜散光：指儀器內(nèi)部通過(guò)非預(yù)定途徑照射到檢測(cè)器上的額外的光輻射。第八十二頁(yè)，共123頁(yè)。雜散光的影響A測(cè)

=lgI0+S·I0It·I0/I0+S·I0=lg1+ST+S例：當(dāng)S=1.0%,T=10%，求A測(cè)？

當(dāng)

S=0,T=10%，求A？當(dāng)S小于0.01%，可忽略雜散光的影響。第八十三頁(yè)，共123頁(yè)。任何分光光度計(jì)都有一定的測(cè)量誤差。（這一誤差來(lái)源于光源、檢測(cè)器、顯示系統(tǒng)）這一測(cè)量誤差的總和最終表現(xiàn)在透光率讀數(shù)T上，設(shè)為?T。

透光率讀數(shù)的影響第八十四頁(yè)，共123頁(yè)。

對(duì)同一臺(tái)儀器來(lái)說(shuō)，?T是一常數(shù)。但由于A=-lgT，所以在不同的透光率讀數(shù)范圍內(nèi)，同樣大小的?T所引起的吸光度誤差?A是不同的。

透光率讀數(shù)的影響第八十五頁(yè)，共123頁(yè)。

根據(jù)朗伯-比爾定律：A與c成正比關(guān)系

因此，?A與?c也成正比關(guān)系。

?A=K·?c

（?T、?A、?c均為絕對(duì)誤差）

測(cè)量結(jié)果的誤差通常用相對(duì)誤差來(lái)表示：

?c/c透光率讀數(shù)的影響第八十六頁(yè)，共123頁(yè)。?c/c與A、T的關(guān)系

A=-lgT=εlc（1）

(-0.434/T)dT=εldc（2）

將（2）式代入朗伯-比爾定律，整理后得：

0.434

（3）TlgT

?c/c=

?T

第八十七頁(yè)，共123頁(yè)。?c/c與T的關(guān)系?c/c

36.8%

T

?c/c=0.434

TlgT

?T0.434Amin第八十八頁(yè)，共123頁(yè)。結(jié)論1.

?c/c

取決于透光率T和透光率測(cè)量誤差?T的大小;當(dāng)T=36.8%時(shí)(或A=0.434)，?c/c最小。2.當(dāng)T讀數(shù)在70%～10%,即A

讀數(shù)0.15～1.0

范圍時(shí),

?c/c

較小(<5%)，并且變化不大。第八十九頁(yè)，共123頁(yè)。3.4.2反應(yīng)條件的選擇顯色反應(yīng)：使待測(cè)物與顯色劑作用，生成有顏色的化合物，顏色深淺與待測(cè)物濃度相關(guān)，在一定范圍內(nèi)呈直線關(guān)系。目的：使被測(cè)組分在所選擇反應(yīng)條件下能有效地轉(zhuǎn)變?yōu)檫m于吸光度測(cè)定的化合物形態(tài)。第九十頁(yè)，共123頁(yè)。顯色反應(yīng)需滿足以下要求反應(yīng)有較高的選擇性，生成物在紫外-可見光區(qū)有較強(qiáng)吸光能力。生成物組成恒定、穩(wěn)定性好，與被測(cè)物之間必須有確定的定量關(guān)系，顯色條件易于控制。對(duì)照性要好，顯色劑與生成物的最大吸收波長(zhǎng)差別要在60nm以上。第九十一頁(yè)，共123頁(yè)。反應(yīng)條件的選擇（影響顯色反應(yīng)的因素）

顯色反應(yīng)：M+nRMRn

1.顯色劑用量：作吸光度隨顯色劑濃度變化曲線，選恒定吸光度值時(shí)的顯色劑用量。

2.同時(shí)還需考慮顯色反應(yīng)的靈敏度、穩(wěn)定性和反應(yīng)的選擇性。第九十二頁(yè)，共123頁(yè)。反應(yīng)條件的選擇（影響顯色反應(yīng)的因素）2.溶液酸度的影響：介質(zhì)酸度直接影響顯色劑離解程度，從而影響顯色反應(yīng)的完全程度。

固定溶液中待測(cè)組分與顯色劑的濃度，改變?nèi)芤核岫龋╬H值），測(cè)定溶液A與pH的關(guān)系曲線，找出最適pH范圍。第九十三頁(yè)，共123頁(yè)。反應(yīng)條件的選擇（影響顯色反應(yīng)的因素）3.其他問(wèn)題反應(yīng)的時(shí)間、溫度、放置的時(shí)間等。此外，加顯色劑和試劑的順序與實(shí)驗(yàn)成敗有重要關(guān)系！第九十四頁(yè)，共123頁(yè)。反應(yīng)條件的控制須通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定顯色反應(yīng)最適宜條件。對(duì)于已建立的比色方法，不應(yīng)隨意更改條件。需要改變條件，或新建方法中要考察某一條件對(duì)顯色的影響時(shí)，可通過(guò)實(shí)驗(yàn)描繪吸光度-條件曲線，或不同條件下的吸光度-濃度曲線，從中選定適宜條件。第九十五頁(yè)，共123頁(yè)。3.4.3參比溶液的選擇溶劑參比：待測(cè)試樣組成簡(jiǎn)單，共存組分少且對(duì)測(cè)定波長(zhǎng)幾乎無(wú)吸收，可用溶劑做參比。試劑參比：在不加樣品的條件下，加入所需試劑和溶劑。試樣參比：除不含顯色劑以外，其余成分都含有。平行操作參比：不含待測(cè)組分。第九十六頁(yè)，共123頁(yè)。3.4.4干擾及消除方法

干擾物的影響：干擾物本身有顏色或與顯色劑形成有色化合物；在顯色條件下，干擾物水解，析出沉淀使溶液渾濁；與待測(cè)離子或顯色劑形成更穩(wěn)定的配合物，使顯色反應(yīng)不能進(jìn)行。第九十七頁(yè)，共123頁(yè)。3.4.4干擾及消除方法

消除方法：控制酸度，提高反應(yīng)的選擇性；選擇適當(dāng)?shù)难诒蝿荒芘c待測(cè)離子作用；與待測(cè)物生成惰性配合物；選擇適當(dāng)?shù)臏y(cè)量波長(zhǎng)；分離。第九十八頁(yè)，共123頁(yè)。3.5紫外-可見吸收光譜的應(yīng)用紫外-可見吸收光譜適用于不飽和有機(jī)化合物，尤其是共軛體系的鑒定，以此推斷未知物的骨架結(jié)構(gòu)。利用紫外-可見吸收光譜進(jìn)行化合物的定性鑒別，一般采用比較吸收光譜特征的方法。3.5.1定性分析（鑒別）第九十九頁(yè)，共123頁(yè)。3.5紫外-可見吸收光譜的應(yīng)用3.5.1.定性分析1.對(duì)比吸收光譜特征數(shù)據(jù)：λmax,ε或A1cm1%

第一百頁(yè)，共123頁(yè)。3.5.1.定性分析2.對(duì)比吸光度的比值有多個(gè)吸收峰的化合物，可用在不同吸收峰處測(cè)得吸光度的比值作為鑒別依據(jù)。例：中國(guó)藥典規(guī)定，VitB12

在361nm與278nm吸光度的比值應(yīng)為1.70～1.88，361nm與550nm吸光度的比值應(yīng)為3.15～3.45.第一百零一頁(yè)，共123頁(yè)。3.5.1.定性分析3.對(duì)比吸收光譜的一致性將試樣與已知標(biāo)準(zhǔn)品配成相同濃度的溶液，在同一條件下分別描繪吸收光譜，核對(duì)其一致性。例：醋酸可的松、醋酸氫化可的松與醋酸潑尼松三者有幾乎完全相同的λmax,（240nm）、ε（1.57×104）和A1cm1%

（390），但它們的光譜曲線有差別，據(jù)此可得到鑒別。第一百零二頁(yè)，共123頁(yè)。3.5紫外-可見吸收光譜的應(yīng)用4.純度檢查雜質(zhì)檢查雜質(zhì)的限量檢測(cè)第一百零三頁(yè)，共123頁(yè)。3.5紫外-可見吸收光譜的應(yīng)用3.5.2結(jié)構(gòu)分析用于判別順反異構(gòu)體和互變異構(gòu)體（可以確定一些化合物的構(gòu)型和構(gòu)象）。第一百零四頁(yè)，共123頁(yè)。3.5.3定量分析1.

單組分定量方法單組分：樣品溶液中含一種組分，或者在混合物溶液中待測(cè)組分的吸收峰與其他共存物質(zhì)的吸收峰無(wú)重疊。紫外-可見吸收光譜常用于具有共軛體系的化合物的定量分析，靈敏度高，檢出限低。第一百零五頁(yè)，共123頁(yè)。(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線法(calibrationcurvemethod)

標(biāo)準(zhǔn)曲線：配制一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以不含被測(cè)組分空白溶液為參比，分別測(cè)定其吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)作圖。

A

Ax

CxC吸光度-濃度曲線第一百零六頁(yè)，共123頁(yè)。

(2)

標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比法

∵

A=klcA/c=kl

∴

AS/cS=AX/cX即:

cX=AX.csAS1.單組分定量方法同種物質(zhì)、同臺(tái)儀器、同一波長(zhǎng)，所以標(biāo)準(zhǔn)和樣品的k和l相等。方法簡(jiǎn)便，但誤差較標(biāo)準(zhǔn)曲線法大。第一百零七頁(yè)，共123頁(yè)。2.

示差分光光度法(高吸光度示差法)

原理:1.采用濃度比試樣含量稍低的已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液作為參比溶液，調(diào)100%；2.然后測(cè)量一個(gè)或數(shù)個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液（其濃度均必須大于參比溶液的濃度）的吸光度和待測(cè)試樣溶液的吸光度?A（?A=Ax-As）；3.用比較法或工作曲線法求得待測(cè)溶液的濃度。第一百零八頁(yè)，共123頁(yè)。2.

示差分光光度法以?A與?c做標(biāo)準(zhǔn)曲線，查得相應(yīng)?cx。

cx=cs+?cx

cs是參比溶液的濃度應(yīng)用：測(cè)定高含量組分第一百零九頁(yè)，共123頁(yè)。為什么示差分光光度法能準(zhǔn)確測(cè)量高含量組分？

設(shè)：待測(cè)溶液濃度為cx，標(biāo)準(zhǔn)溶液（參比溶液）濃度為cs(cs<cx)。1.采用普通光度法以試劑空白為參比溶液分別測(cè)定二者的透光率。假設(shè)：測(cè)得的待測(cè)溶液透光率為：Tx=5%標(biāo)準(zhǔn)溶液（參比）透光率為：Ts=10%第一百一十頁(yè)，共123頁(yè)。2.

高含量組分測(cè)定

示差分光光度法2.采用示差光度法以標(biāo)準(zhǔn)溶液為參比溶液測(cè)定，此時(shí)是用標(biāo)準(zhǔn)溶液將儀器的