青霉素提取精制工藝過程

青霉素提取精制工藝過程青霉素生產(chǎn)工藝摘要：青霉素是人類最早發(fā)現(xiàn)的一種極其重要的抗生素,其殺傷革蘭氏陽性細菌的神奇功效在二戰(zhàn)中挽救了眾多士兵的生命。它的發(fā)現(xiàn)對藥物學乃至整個人類發(fā)展的重要意義。本文將對青霉素的生產(chǎn)工藝及其提取進行深入的講解。關(guān)鍵詞：青霉素生產(chǎn)工藝發(fā)酵提取一、青霉素的生物學特性青霉素類抗生素是β-內(nèi)酰胺類中1種,在分類上屬于A類，酶的活性位點上有絲氨酸，又稱活性位點絲氨酸酶，其作用機制是水解β-內(nèi)酰胺類抗生素的β-內(nèi)酰胺環(huán)，使抗生素失去活性。由于β-內(nèi)酰胺類作用于細菌的細胞壁,而人類只有細胞膜無細胞壁,故對人類的毒性較小,除能引起嚴重的過敏反應外,在一般用量下,其毒性不甚明顯,但它不能耐受耐藥菌株(如耐藥金葡)所產(chǎn)生的酶,易被其破壞,且其抗菌譜較窄,主要對革蘭氏陽性菌有效。青霉素G有鉀鹽、鈉鹽之分,鉀鹽不僅不能直接靜注,靜脈滴注時,也要仔細計算鉀離子量,以免注入人體形成高血鉀而抑制心臟功能,造成死亡。二、青霉素的發(fā)酵青霉素的發(fā)酵生產(chǎn)的一般工藝流程：青霉素生產(chǎn)菌不同，發(fā)酵工業(yè)也有區(qū)別。絲狀菌的青霉素發(fā)酵工藝流程：沙土管→斜面母瓶（孢子培養(yǎng)，25℃，6～7d）→大米孢子斜面（孢子培養(yǎng)，25℃，6～7d）→種子罐（種子培養(yǎng)，25℃，40～45h）→繁殖罐（種子培養(yǎng)，25℃，13～15h）→發(fā)酵罐（發(fā)酵，26℃，6～7d）→放罐球狀菌的青霉素發(fā)酵工藝流程：冷凍管→斜面母瓶（孢子培養(yǎng)，25℃，6～8d）→大米孢子斜面（孢子培養(yǎng)，25℃，8～10d）→種子罐（種子培養(yǎng)，28℃，50～60h）→發(fā)酵罐（發(fā)酵，26℃，6～7d）→放罐青霉素的分批發(fā)酵分為菌絲生長和產(chǎn)物合成兩個階段，進入合成階段的必要條件是降低菌絲的生長速率。影響青霉素發(fā)酵產(chǎn)率的因素有環(huán)境和生理因素兩個方面，前者包括溫度、PH、培養(yǎng)基種類及濃度、溶解氧飽和度等；后者包括菌體濃度、菌體生長速率、菌絲形態(tài)等。菌體生長和青霉素合成最適溫度并不相同，一般前階段略高于后階段。因此，在菌體生長階段可以采取較高溫度，以縮短生長時間，而到達產(chǎn)物合成階段，應適當降低溫度，以利于青霉素的合成。青霉素發(fā)酵的最適PH一般在左右，由于青霉素在堿性條件下不穩(wěn)定，容易發(fā)生水解，因此應盡量避免PH超過。三、青霉素發(fā)酵過程控制反復分批式發(fā)酵，100m3發(fā)酵罐，裝料80m3，帶放6－10次，間隔24h。帶放量10％，發(fā)酵時間24h。發(fā)酵過程需連續(xù)流加補入葡萄糖、硫酸銨以及前體物質(zhì)苯乙酸鹽，補糖率是最關(guān)鍵的控制指標，不同時期分段控制。在青霉素的生產(chǎn)中，讓培養(yǎng)基中的主要營養(yǎng)物只夠維持青霉菌在前40h生長，而在40h后，靠低速連續(xù)補加葡萄糖和氮源等，使菌半饑餓，延長青霉素的合成期，大大提高了產(chǎn)量。所需營養(yǎng)物限量的補加常用來控制營養(yǎng)缺陷型突變菌種，使代謝產(chǎn)物積累到最大。（1）培養(yǎng)基青霉素發(fā)酵中采用補料分批操作法，對葡萄糖、銨、苯乙酸進行緩慢流加，維持一定的最適濃度。葡萄糖的流加，波動范圍較窄，濃度過低使抗生素合成速度減慢或停止，過高則導致呼吸活性下降，甚至引起自溶，葡萄糖濃度調(diào)節(jié)是根據(jù)pH，溶氧或CO2釋放率予以調(diào)節(jié)。碳源的選擇：生產(chǎn)菌能利用多種碳源，乳糖，蔗糖，葡萄糖，阿拉伯糖，甘露糖，淀粉和天然油脂。經(jīng)濟核算問題，生產(chǎn)成本中碳源占12％以上，對工藝影響很大；糖與6-APA結(jié)合形成糖基-6-APA，影響青霉素的產(chǎn)量。葡萄糖、乳糖結(jié)合能力強，而且隨時間延長而增加。通常采用葡萄糖和乳糖。發(fā)酵初期，利用快效的葡萄糖進行菌絲生長。當葡萄糖耗竭后，利用緩效的乳糖，使pH穩(wěn)定，分泌青霉素。可根據(jù)形態(tài)變化，滴加葡萄糖，取代乳糖。目前普遍采用淀粉的酶水解產(chǎn)物，葡萄糖化液流加。降低成本。氮源：玉米漿是最好的，是玉米淀粉生產(chǎn)時的副產(chǎn)品，含有多種氨基酸及其前體苯乙酸和衍生物。玉米漿質(zhì)量不穩(wěn)定，可用花生餅粉或棉籽餅粉取代。補加無機氮源。無機鹽：硫、磷、鎂、鉀等。鐵有毒，控制在30μg/ml以下。流加控制：補糖，根據(jù)殘?zhí)?、pH、尾氣中CO2和O2含量。殘?zhí)窃冢プ笥遥琾H開始升高時加糖。補氮：流加酸酸銨、氨水、尿素，控制氨基氮%。添加前體：合成階段，苯乙酸及其衍生物，苯乙酰胺、苯乙胺、苯乙酰甘氨酸等均可為青霉素側(cè)鏈的前體，直接摻入青霉素分子中。也具有刺激青霉素合成作用。但濃度大于％時對細胞和合成有毒性。還能被細胞氧化。策略是流加低濃度前體，一次加入量低于%，保持供應速率略大于生物合成的需要。（2）溫度一生長適宜溫度30℃，分泌青霉素溫度20℃。但20℃青霉素破壞少，周期很長。生產(chǎn)中采用變溫控制，不同階段不同溫度。前期控制25－26℃左右，后期降溫控制23℃。過高則會降低發(fā)酵產(chǎn)率，增加葡萄糖的維持消耗，降低葡萄糖至青霉素的轉(zhuǎn)化得率。有的發(fā)酵過程在菌絲生長階段采用較高的溫度，以縮短生長時間，生產(chǎn)階段適當降低溫度，以利于青霉素合成。（3）pH合成的適宜－左右，避免超過，青霉素在堿性條件下不穩(wěn)定，易水解。緩沖能力弱的培養(yǎng)基，pH降低，意味著加糖率過高造成酸性中間產(chǎn)物積累。pH上升，加糖率過低不足以中和蛋白產(chǎn)生的氨或其他生理堿性物質(zhì)。前期pH控制在~，中后期pH控制~，通過補加氨水進行調(diào)節(jié)。pH較低時，加入CaCO3、通氨調(diào)節(jié)或提高通氣量。pH上升時，加糖或天然油脂。一般直接加酸或堿自動控制，流加葡萄糖控制。（4）溶氧溶氧＜30％飽和度，產(chǎn)率急劇下降，低于10％，則造成不可逆的損害。所以不能低于30％飽和溶氧濃度。通氣比一般為1：。溶氧過高，菌絲生長不良或加糖率過低，呼吸強度下降，影響生產(chǎn)能力的發(fā)揮。適宜的攪拌速度，保證氣液混合，提高溶氧，根據(jù)各階段的生長和耗氧量不同，對攪拌轉(zhuǎn)速調(diào)整。（5）菌絲生長速度與形態(tài)、濃度對于每個有固定通氣和攪拌條件的發(fā)酵罐內(nèi)進行的特定好氧過程，都有一個使氧傳遞速率（OTR）和氧消耗率（OUR）在某一溶氧水平上達到平衡的臨界菌絲濃，超過此濃度，OUR＞OTR，溶氧水平下降，發(fā)酵產(chǎn)率下降。在發(fā)酵穩(wěn)定期，濕菌濃可達15~20%，絲狀菌干重約3%，球狀菌干重在5%左右。另外，因補入物料較多，在發(fā)酵中后期一般每天帶放一次，每次放掉總發(fā)酵液的10%左右。（6）消沫發(fā)酵過程泡沫較多，需補入消沫劑。天然油脂：玉米油；化學消沫劑：泡敵。少量多次。不適在前期多加入，影響呼吸代謝。四、青霉素的提取青霉素提純工藝流程簡圖：

青霉素不穩(wěn)定，發(fā)酵液預處理、提取和精制過程要條件溫和、快速，防止降解。1.發(fā)酵液預處理發(fā)酵液放罐后，首先要冷卻，因為青霉素在低溫時比較穩(wěn)定，細菌繁殖也比較慢，可避免青霉素迅速被破壞。青霉素菌絲教粗，一般過濾較容易，通常采用鼓式過濾及板框過濾；蛋白質(zhì)的處理方法包括等電點沉淀、變性沉淀、沉淀劑沉淀、凝聚劑沉淀、絮凝劑沉淀；吸附、酶解法去除不溶性多糖等；高價金屬離子的去除方法有離子交換法和沉淀法等。2.過濾發(fā)酵液在萃取之前需預處理，發(fā)酵液加少量絮凝劑沉淀蛋白，然后經(jīng)真空轉(zhuǎn)鼓過濾或板框過濾，除掉菌絲體及部分蛋白。青霉素易降解，發(fā)酵液及濾液應冷至10℃以下，過濾收率一般90%左右。（1）菌絲體粗長10μm，采用鼓式真空過濾機過濾，濾渣形成緊密餅狀，容易從濾布上刮下。濾液，蛋白質(zhì)含量。需要進一步除去蛋白質(zhì)。（2）改善過濾和除去蛋白質(zhì)的措施：硫酸調(diào)節(jié)，加入%溴代十五烷吡啶PPB，%硅藻土為助濾劑。再通過板框式過濾機。濾液澄清透明，進行萃取。3.萃取青霉素的提取采用溶媒萃取法。青霉素游離酸易溶于有機溶劑，而青霉素鹽易溶于水。利用這一性質(zhì)，在酸性條件下青霉素轉(zhuǎn)入有機溶媒中，調(diào)節(jié)pH，再轉(zhuǎn)入中性水相，反復幾次萃取，即可提純濃縮。選擇對青霉素分配系數(shù)高的有機溶劑。工業(yè)上通常用醋酸丁酯和戊酯。萃取2－3次。從發(fā)酵液萃取到乙酸丁酯時，pH選擇，從乙酸丁酯反萃到水相時，pH選擇。發(fā)酵濾液與乙酸丁酯的體積比為，即一次濃縮倍數(shù)為。為了避免pH波動，采用硫酸鹽、碳酸鹽緩沖液進行反萃。發(fā)酵液與溶劑比例為3－4。幾次萃取后，濃縮10倍，濃度幾乎達到結(jié)晶要求。萃取總收率在85％左右。所得濾液多采用二次萃取，用10%硫酸調(diào)~，加入醋酸丁酯，用量為濾液體積的三分之一，反萃取時常用碳酸氫鈉溶液調(diào)~。在一次丁酯萃取時，由于濾液含有大量蛋白，通常加入破乳劑防止乳化。第一次萃取，存在蛋白質(zhì)，加乳化劑PPB。萃取條件：為減少青霉素降解，整個萃取過程應在低溫下進行（10℃以下）。萃取罐冷凍鹽水冷卻。4.脫色萃取液中添加活性炭，除去色素、熱源，過濾，除去活性炭。5.結(jié)晶萃取液一般通過結(jié)晶提純。青霉素鉀鹽在醋酸丁酯中溶解度很小，在二次丁酯萃取液中加入醋酸鉀-乙醇溶液，青霉素鉀鹽就結(jié)晶析出。然后采用重結(jié)晶方法，進一步提高純度，將鉀鹽溶于KOH溶液，調(diào)pH至中性，加無水丁醇，在真空條件下，共沸蒸餾結(jié)晶得純品。直接結(jié)晶：在2次乙酸丁酯萃取液中加醋酸鈉－乙醇溶液反應，得到結(jié)晶鈉鹽。加醋酸鉀－乙醇溶液，得到青霉素鉀鹽。共沸蒸餾結(jié)晶：萃取液，再用MNaOH萃取，下得到鈉鹽水濃縮液。加倍體積丁醇，16－26℃，下蒸餾。水和丁醇形成共沸物而蒸出。鈉鹽結(jié)晶析出。結(jié)晶經(jīng)過洗滌、干燥后，得到青霉素產(chǎn)品。五、抗生素的精制1、濃縮在抗生素提取和精制的過程中，常需要通過蒸發(fā)將發(fā)酵濾液或提取液進一步濃縮，以利于后序操作?？股厣a(chǎn)中有真空濃縮和薄膜蒸發(fā)濃縮。2、干燥干燥的目的是除去抗生素中所含的水分，以提高產(chǎn)品的穩(wěn)定性，有利于產(chǎn)品的加工、儲存和使用。常用的干燥方法有減壓干燥、噴霧干燥、氣流干燥、冷凍干燥等。此外也有使用常壓干燥、固定床干燥及紅外線干燥等。3、脫色和去熱原提煉往往是注射用抗生素提取中不可缺少的一個單元操作。這一步操作的好壞，不僅影響下一道工序，更重要的是關(guān)系到成品的色極及熱原試驗等質(zhì)量指標。用活性碳可除去各種色素，同時也能出去熱原。4、結(jié)晶抗生素的精制過程中常常通過結(jié)晶的方法來制得較高純度的成品?？股氐木品椒ê芏?，生產(chǎn)中常用的結(jié)晶方法有以下幾種：改變溫度結(jié)晶、利用等電點結(jié)晶、加成鹽劑結(jié)晶、加入不同溶劑結(jié)晶、共沸結(jié)晶。另外還有鹽析法、中間鹽轉(zhuǎn)移法、晶體洗滌法等幾種精制方法。重結(jié)晶是進一步提純精制抗生素的有效方法，通過重結(jié)晶方法可獲得高純度抗生素產(chǎn)品。六、結(jié)論發(fā)酵罐是現(xiàn)代微生物發(fā)酵技術(shù)的象征，它是微生物在發(fā)酵過程中生長、繁殖和形成產(chǎn)品的外部環(huán)境裝置，它取代了傳統(tǒng)的發(fā)酵容器：培養(yǎng)瓶、醬缸和酒窖，它能實現(xiàn)大規(guī)模的生產(chǎn)，最大限度地利用原料和設備，獲得高產(chǎn)量和高效率。對青霉素生產(chǎn)的改進得益于來自于生物化學、遺傳學、微生物生理學以及生化工程等方面科技人員的共同努力。迄今為止，人們對青霉素生物合成的了解還十分膚淺，大部分機理仍還無法闡述清楚，然而可以預計，隨著對青霉素發(fā)酵過程和代謝途徑認識的不斷深入，人們一定能夠找到某種適當?shù)霓k法來解決青霉素合成中的阻遏因素，從而大幅度提高青霉素的效價和產(chǎn)量。參考文獻1.馮文亮，王麗麗，儀宏，趙紫華，馬蕙.青霉素發(fā)酵液的預處