轉(zhuǎn)基因動物2012課件

轉(zhuǎn)基因動物

2012年12月

主要內(nèi)容基本概念轉(zhuǎn)基因動物的命名目前制作轉(zhuǎn)基因動物的主要方法轉(zhuǎn)基因動物研究的意義及應(yīng)用隨著現(xiàn)代高新科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)代實驗動物學(xué)已從過去注重于動物飼養(yǎng)管理和實驗操作的宏觀向微觀方向發(fā)展。對小鼠基因組研究的目的不僅在于了解小鼠本身的基因結(jié)構(gòu)，更主要的是為人類基因組研究、人類遺傳疾病研究提供動物模型。

轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)發(fā)展的四個階段第一，實現(xiàn)外源基因的導(dǎo)入（隨機(jī)整合）第二，實現(xiàn)導(dǎo)入的外源基因定點整合（同源重組，基因打靶技術(shù)）第三，實現(xiàn)導(dǎo)入的外源基因的組織特異性表達(dá)（借助于一系列組織特異性啟動子的應(yīng)用）第四，實現(xiàn)導(dǎo)入的外源基因的時間特異性表達(dá)（應(yīng)用Cre/loxP重組酶系統(tǒng)）二、命名1．符號(1)一個轉(zhuǎn)基因符號由以下三部分組成：TgX(YYYYYY)＃＃＃＃＃Zzz，TgX=方式；(YYYYYY)=插入片段標(biāo)示；＃＃＃＃＃=實驗室指定序號；Zzz=實驗室注冊代號；(2)方式—TgX

轉(zhuǎn)基因符號通常冠以Tg字頭。隨后的一個字母X，表示DNA插入的方式：H代表同源重組；R代表經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染的插入；N代表非同源插入。應(yīng)注意以下幾點：1）標(biāo)示應(yīng)簡短，一般不超過六個字符。2）如果插入序列源于已經(jīng)命名的基因，應(yīng)盡量在插入標(biāo)示中使用基因的標(biāo)準(zhǔn)命名或縮寫，但基因符號中的連字符應(yīng)省去。3）插入片段標(biāo)示只表示插入的序列，并不表明其插入的位置或表型。一些標(biāo)示的標(biāo)準(zhǔn)命名縮寫：

An匿名序列；Ge基因組；Im插入突變；Nc非編碼序列；Rp報告基因；Sn合成序列；Et增強(qiáng)子捕獲裝置；Pt啟動子捕獲裝置。（4）實驗室指定序號及實驗室注冊代號實驗室指定序號：是由實驗室對已成功的轉(zhuǎn)基因系給予的特定編號，最多不超過5位數(shù)字。而且，插入片段標(biāo)示的字符與實驗室指定序號的數(shù)字位數(shù)之和不能超過11。實驗室注冊代號：是對從事轉(zhuǎn)基因動物研究生產(chǎn)的實驗室給予的特定符號。TgN(GPDHIm)1Bir以人的甘油磷酸脫氫酶基因（GPDH）插入（C57BL/6JXSJL/J）F1代雌鼠的受精卵中，并引起插入突變（Im），這是EdwardH.Birkenmeier(Bir)實驗室命名的第一只轉(zhuǎn)基因小鼠。根據(jù)轉(zhuǎn)基因動物命名原則，如果轉(zhuǎn)基因動物的遺傳背景由不同近交系或遠(yuǎn)交群混合而成時，該轉(zhuǎn)基因符號不使用動物品系或種群的名稱。縮寫：TgN1Bir三、遺傳修飾動物模型的建立方法1、轉(zhuǎn)基因技術(shù)：目的基因整合受精卵（或胚胎干細(xì)胞）導(dǎo)入受體子宮發(fā)育成含目的基因的個體，此個體能把目的基因遺傳下去。2、核移植技術(shù):又稱動物整體克隆技術(shù)。將一個體細(xì)胞的核導(dǎo)入另一個體的去核卵細(xì)胞中，使之發(fā)育成個體。3、基因剔除技術(shù)：又稱基因靶向滅活。指有目的地去除動物體內(nèi)某種基因的技術(shù)?；驹硎峭粗亟M技術(shù)。導(dǎo)入基因的主要方式顯微注射法ES細(xì)胞法電穿孔脂質(zhì)體逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法精子載體導(dǎo)入法等一、設(shè)計轉(zhuǎn)基因構(gòu)件

1、目的基因的獲取2、基因載體（復(fù)制子）的選擇與構(gòu)建3、目的基因與載體的連接（連接酶）：重組DNA分子二、動物操作

1、準(zhǔn)備假孕母鼠（養(yǎng)母）2、受精卵的準(zhǔn)備3、基因?qū)?、胚胎移植5、對幼鼠的鑒定

轉(zhuǎn)基因工作需要的動物1、需要的野生型小鼠類型包括：幼齡雌鼠（21-28天）用作胚胎供體；成年雄鼠；成年雌鼠，作為胚胎移植的受體；輸精管結(jié)扎的雄鼠，用來產(chǎn)生假孕雌鼠；青年野生型雄鼠和雌鼠，與轉(zhuǎn)基因鼠交配，建立轉(zhuǎn)基因品系。2、從胚胎移植到成年小鼠總計約11周的時間胚胎移植約19天幼鼠約21天斷乳小鼠約4-5周成年小鼠約19天幼鼠。原核注射法制備轉(zhuǎn)基因鼠技術(shù)路線優(yōu)點：外源DNA大小基本不受限制（1-50kb）；導(dǎo)入過程直觀；整合率高缺點：設(shè)備昂貴、環(huán)節(jié)較多對操作人員有較高的技術(shù)要求低效率（尤其是大家畜）對卵子傷害大，胚胎存活率低基因整合隨機(jī)性轉(zhuǎn)基因沉默優(yōu)點：外源基因整合情況的可控性高?？深A(yù)先在細(xì)胞水平檢測外源基因的拷貝數(shù)、定位、表達(dá)的水平及插入的穩(wěn)定性。外源基因?qū)隕S細(xì)胞的方法多樣，細(xì)胞鑒定及篩選方便。缺點：ES細(xì)胞系建立及培養(yǎng)困難維持ES細(xì)胞的未分化及多向分化潛能不易所得個體為嵌合體（三）完全基因剔除轉(zhuǎn)基因動物完全基因剔除(entirelyknock-out)：

又稱基因敲除、基因打靶，指應(yīng)用一段與胚胎干細(xì)胞染色體上的一段序列具有高度同源性的滅活外源DNA，通過同源重組取代原有目的基因，使靶基因在動物個體中的活性完全消除，來觀察靶基因失活、不表達(dá)的情況下會對動物個體產(chǎn)生哪些影響?；驹恚簻缁罨?/p>

電穿孔

體外ES細(xì)胞

同源重組，篩選

基因定點滅活的細(xì)胞顯微注射小鼠囊胚胚胎移植假孕鼠子宮內(nèi)發(fā)育嵌合體小鼠選擇培育基因剔除小鼠

轉(zhuǎn)基因動物研究的意義和作用：1、生命現(xiàn)象的基礎(chǔ)研究。轉(zhuǎn)基因動物是對多種生命現(xiàn)象本質(zhì)深入了解的工具，如研究基因的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，細(xì)胞發(fā)育的潛能性、細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)的相互關(guān)系、胚胎發(fā)育調(diào)控、腫瘤、神經(jīng)與發(fā)育等。2、可以用來建立多種動物模型，進(jìn)而研究這些疾病的發(fā)病機(jī)理、治療方法及新藥的篩選。3、可作為醫(yī)用或食用蛋白的生物反應(yīng)器。通過家畜乳腺分泌大量安全、高效、廉價的人體藥用蛋白，一直是轉(zhuǎn)基因動物研究的熱點?，F(xiàn)在已有數(shù)十種人體蛋白在家畜乳腺中表達(dá)，這些蛋白可以用于治療人類相關(guān)疾病。4、利用基因敲除技術(shù)提供廉價的異種移植器官。只要將引起強(qiáng)烈免疫排斥反應(yīng)的異源分子基因敲除掉就可以。例如培育不含免疫排斥的轉(zhuǎn)基因克隆豬。5、改良和培育動物新品種。如使生長速度加快，瘦肉率提高、肉質(zhì)改善、飼料利用率提高、抗病力增強(qiáng)等6、基因治療。人類第一例于1990年對SCID綜合癥的小孩實施體細(xì)胞基因治療獲得成功。轉(zhuǎn)基因動物的飼養(yǎng)管理