基因診斷與基因治療

基因診斷與基因治療基因診斷與基因治療能夠在比較短的時(shí)間從理論設(shè)想變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)，主要是由于分子生物學(xué)的理論及技術(shù)方法，特別是重組DNA技術(shù)的迅速發(fā)展，使人們可以在實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建各種載體、克隆及分析目標(biāo)基因。所以對(duì)疾病能夠深入全分子水平的研究，并已取得了重大的進(jìn)展。因此在20世紀(jì)70年代末誕生了基因診斷(genediagnosis)；隨后于1990年美國(guó)實(shí)施了第一個(gè)基因治療(genetherapy)的臨床試驗(yàn)方案?？梢?，基因診斷和基因治療是現(xiàn)代分子生物學(xué)的理論和技術(shù)與醫(yī)學(xué)相結(jié)合的范例。?基因診斷o基因診斷的含義傳統(tǒng)對(duì)疾病的診斷主要是以疾病的表型改變?yōu)橐罁?jù)，如患者的癥狀、血尿各項(xiàng)指標(biāo)的變化，或物理檢查的異常結(jié)果，然而表型的改變?cè)谠S多情況下不是特異的，而且是在疾病發(fā)生的一定時(shí)間后才出現(xiàn)，因此常不能及時(shí)作出明確的診斷?，F(xiàn)知各種表型的改變是由基因異常造成的，也就是說(shuō)基因的改變是引起疾病的根本原因?；蛟\斷是指采用分子生物學(xué)的技術(shù)方法來(lái)分析受檢者的某一特定基因的結(jié)構(gòu)(DNA水平)或功能(RNA水平)是否異常，以此來(lái)對(duì)相應(yīng)的疾病進(jìn)行診斷?；蛟\斷有時(shí)也稱為分子診斷或DNA診斷(DNAdiagnosis)?；蛟\斷是病因的診斷，既特異又靈敏，可以揭示尚未出現(xiàn)癥狀時(shí)與疾病相關(guān)的基因狀態(tài)，從而可以對(duì)表型正常的攜帶者及某種疾病的易感者作出診斷和預(yù)測(cè)，特別對(duì)確定有遺傳疾病家族史的個(gè)體或產(chǎn)前的胎兒是否攜帶致病基因的檢測(cè)具有指導(dǎo)意義。o基因診斷的原理及方法基因診斷的原理疾病的發(fā)生不僅與基因結(jié)構(gòu)的變異有關(guān)，而且與其表達(dá)功能異常有關(guān)?；蛟\斷的基本原理就是檢測(cè)相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)及其表達(dá)功能特別是RNA產(chǎn)物是否正常。由于DNA的突變、缺失、插入、倒位和基因融合等均可造成相關(guān)基因結(jié)構(gòu)變異，因此，可以直接檢測(cè)上述的變化或利用連鎖方法進(jìn)行分析，這就是DNA診斷。對(duì)表達(dá)產(chǎn)物mRNA質(zhì)和量變化的分析為RNA診斷(RNAdiagnosis)?；蛟\斷的方法基因診斷是以核酸分子雜交(nucleicacidmolecularhybridization)和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)為核心發(fā)展起來(lái)的多種方法，同時(shí)配合DNA序列分析，近年新興的基因芯片可能會(huì)發(fā)展成為一種很有用的基因診斷方法。?DNA診斷常用檢測(cè)致病基因結(jié)構(gòu)異常的方法有下列幾種。⑴斑點(diǎn)雜交：根據(jù)待測(cè)DNA樣本與標(biāo)記的DNA探針雜交的圖譜，可以判斷目標(biāo)基因或相關(guān)的DNA片段是否存在，根據(jù)雜交點(diǎn)的強(qiáng)度可以了解待測(cè)基因的數(shù)量。⑵等位基因特異的寡核苷酸探針(allele-specificoligonucleotideprobe,ASOprobe)雜交：是一種檢測(cè)基因點(diǎn)突變的方法，根據(jù)點(diǎn)突變位點(diǎn)上下游核苷酸序列，人工合成約19個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的片段，突變的堿基位于當(dāng)中，經(jīng)放射性核素或地高辛標(biāo)記后可作為探針，在嚴(yán)格雜交條件下，只有該點(diǎn)突變的DNA樣本，才出現(xiàn)雜交點(diǎn)，即使只有一個(gè)堿基不配對(duì)，也不可能形成雜交點(diǎn)。一般尚合成正?；蛲恍蛄?，同一大小的寡核苷酸片段作為正常探針。如果受檢的DNA樣本只能與突變ASO探針，不與正常ASO探針雜交，說(shuō)明受檢二條染色體上的基因都發(fā)生這種突變，為突變純合子；如果既能與突變ASO探針又能與正常ASO探針雜交，說(shuō)明一條染色體上的基因發(fā)生突變，另一條染色體上為正?；?，為這種突變基因的雜合子；如果只能與正常ASO探針雜交，不能與突變ASO雜交，說(shuō)明受檢者不存在該種突變基因，如圖21-1所示。若與PCR方法聯(lián)合應(yīng)用，即PCR/ASO探針雜交法(PCR/ASOprobehybridization)，是一種檢測(cè)基因點(diǎn)突變的簡(jiǎn)便方法，先用PCR方法擴(kuò)增突變點(diǎn)上下游的序列，擴(kuò)增產(chǎn)物再與ASO探針雜交，可明確診斷突變的純合子和雜合子。此法對(duì)一些已知突變類型的遺傳病，如地中海貧血、苯丙酮尿癥等純合子和雜合子的診斷很方便。也可分析癌基因如H-ras和抑癌基因如p53的點(diǎn)突變。⑶單鏈構(gòu)象多態(tài)性(singlestrandconformationpolymorphism,SSCP)分析相同長(zhǎng)度的單鏈DNA因其序列不同，甚至單個(gè)堿基不同，所形成的構(gòu)象不盡相同，在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí)速度就不同，若單鏈DNA用放射性核素標(biāo)記，顯影后即可區(qū)分電泳條帶。一般先設(shè)計(jì)引物對(duì)突變點(diǎn)所在外顯子進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)變性成單鏈后進(jìn)行電泳分析。PCR/SSCP方法，能快速、靈敏、有效地檢測(cè)DNA突變點(diǎn)，如圖21-2，此法可用檢測(cè)點(diǎn)突變的遺傳疾病，如苯丙酮尿癥、血友病等，以及點(diǎn)突變的癌基因和抑癌基因。⑷限制性內(nèi)切酶圖譜(restrictionmap)分析，如果DNA突變后改變了某一核酸限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)，使原來(lái)某一識(shí)別位點(diǎn)消失，或形成了新的識(shí)別位點(diǎn)，那么相應(yīng)限制性內(nèi)切酶片段的長(zhǎng)度和數(shù)目會(huì)發(fā)生改變。一般基因組DNA經(jīng)該種限制性內(nèi)切酶水解，再做Southern印跡，根據(jù)雜交片段的圖譜，可診斷該點(diǎn)突變，如圖21-3所示。如果用PCR擴(kuò)增該突變點(diǎn)的外顯子，PCR產(chǎn)物經(jīng)該種酶消化后，進(jìn)行瓊脂糖電泳，漠乙錠染色后可直接觀察片段的大小及數(shù)目。此法可用于檢測(cè)有些限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)消失的遺傳疾病，如鐮狀細(xì)胞貧血?；蚧蛉笔У募膊∪鏰地中海貧血癥，單純性生長(zhǎng)激素缺之癥等。⑸限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)遺傳連鎖分析人群中個(gè)體間DNA的序列存在差異，據(jù)估計(jì)每100-200個(gè)核苷酸中便有1個(gè)發(fā)生突變，這種現(xiàn)象稱為DNA多態(tài)性。有些DNA多態(tài)性可改變某一限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)，因而產(chǎn)生了DNA限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性。RFLP按孟德爾方式遺傳，在某一特定的家庭中，如果某一致病基因與特定的多態(tài)性片段連鎖，可以遺傳給子代，因此這一多態(tài)性片段可作為遺傳標(biāo)記，來(lái)判斷該家庭成員或胎兒的基因組中是否攜帶該致病基因，見圖21-4,此法可用于診斷甲型血友病、苯丙酮尿癥、享延頓舞蹈病等。⑹DNA序列分析對(duì)致病有關(guān)的DNA片段進(jìn)行序列測(cè)定，是診斷基因異常(已知和未知)最直接和準(zhǔn)確的方法。RNA診斷RNA診斷主要是分析基因的表達(dá)功能，檢測(cè)轉(zhuǎn)錄物的質(zhì)和量，以判斷基因轉(zhuǎn)錄效率的高低，以及轉(zhuǎn)錄物的大小。(l)RNA印跡(Northernblot)RNA印跡是檢測(cè)基因是否表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物mRNA的大小的可靠方法，根據(jù)雜交條帶的強(qiáng)度，可以判斷基因表達(dá)的效率。⑵RT-PCR是一種檢測(cè)基因表達(dá)產(chǎn)物mRNA靈敏的方法，若與熒光定量PCR結(jié)合可對(duì)RT-PCR產(chǎn)物量進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定。o基因診斷的應(yīng)用遺傳疾病現(xiàn)知遺傳疾病有數(shù)千種，但多數(shù)遺傳疾病屬少見病例，有些遺傳疾病在不同民族，不同地區(qū)的人群中發(fā)病率不同，例如鐮狀細(xì)胞貧血(sicklecellanemia),非洲黑色人種發(fā)病率高，而囊性纖維化癥(cysticfibrosis)常見于美國(guó)白色人種，這二種遺傳疾病在我國(guó)為罕見病例。中國(guó)較常見的遺傳疾病有地中海貧血、甲型血友病、乙型血友病、苯丙酮尿癥、杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥(DMD)、葡萄糖-6磷酸脫氫酶(G-6PD)缺乏癥、唐氏綜合癥(Down’ssyndrome)等。根據(jù)不同遺傳疾病的分子基礎(chǔ)，可采用不同的技術(shù)方法進(jìn)行診斷，不但可對(duì)有癥狀患者進(jìn)行檢測(cè)，而且對(duì)遺傳疾病家族中未發(fā)病的成員乃至胎兒甚至胚胎著床前(preimplantation)進(jìn)行診斷是否攜帶有異?；?，這對(duì)婚育具有指導(dǎo)意義。地中海貧血(地貧)是世界上最常見和發(fā)生率最高的一種單基因遺傳疾病(monogenicdisease)，由于一種或幾種珠蛋白合成障礙導(dǎo)致a類與p類珠蛋白不平衡造成的，臨床以貧血、黃疸、肝脾腫大及特殊外貌為特征，地貧最常見的有兩類：a地貧和p地貧。a地貧(a-thalassemias)的分子基礎(chǔ)主要為a珠蛋白基因缺失，也有部分病例是由于堿基突變?cè)斐傻??？刹捎孟拗菩詢?nèi)切酶圖譜方法檢測(cè)a珠蛋白基因的缺失。人a珠蛋白基因簇位于16號(hào)染色體，長(zhǎng)度29kb，包含7個(gè)連鎖的a類基因或假基因。a基因（a1及a2編碼序列相同，僅非編碼序列稍有差別，產(chǎn)物相同），該基因簇上有2個(gè)EcoRI識(shí)別位點(diǎn)，經(jīng)EcoRI酶解，進(jìn)行Southern印跡，用標(biāo)記的a基因片段作探針，得到一條23kb的雜交條帶，BamHI識(shí)別位點(diǎn)有4個(gè)，但只有14kb片段能與mRNA基因探針雜交，見圖21-5。HbBart’s胎兒水腫綜合征：由于該病患兒二條16號(hào)染色體的4個(gè)a珠蛋白基因均缺失，不能合成a鏈，胎兒全身水腫、肝脾腫大、四肢短小，常于妊娠30-40周死亡或早產(chǎn)后半小時(shí)內(nèi)死亡。樣本DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶圖譜分析不能顯示a珠蛋白基因區(qū)帶，RNA診斷也測(cè)定不出有a珠蛋白基因的mRNA。缺失型HBH?。河捎谝粭l16號(hào)染色體上的兩個(gè)a珠蛋白基因均缺失，另一條16號(hào)染色體上則缺失一個(gè)a珠蛋白基因，并缺失3.7kb長(zhǎng)度的DNA片段（右側(cè)缺失型）或4.2kb片段（左側(cè)缺失型），DNA診斷只產(chǎn)生19kb長(zhǎng)度的EcoRI片段，或10kbBamHI片段。標(biāo)準(zhǔn)型a地貧：一條16號(hào)染色體上2個(gè)a珠蛋白基因全部缺失。而另一條16號(hào)染色體上具有2個(gè)正常的a珠蛋白基因，DNA診斷結(jié)果，EcoRI和BamHI都出現(xiàn)與正常一樣的23kb或14kb的條帶，但雜交條帶的放射性自顯影較正常人淺。P地貧（。-thalassemias）的基因診斷：p地貧的分子基礎(chǔ)不同于a地貧，P珠蛋白基因通常并不缺失，而是由于基因點(diǎn)突變或個(gè)別堿基的插入或缺失。每一民族和人群P珠蛋白基因點(diǎn)突變部位不盡相同，都有特定的類型譜。（二）感染性疾病過(guò)去對(duì)感染性疾?。╥nfectiousdiseases）的診斷，一是直接分離檢查病原體，或者對(duì)患者血清學(xué)或生物化學(xué)的分析。有些病原體不容易分離，有些需經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期培養(yǎng)才能獲得。血清學(xué)對(duì)病原體抗體的檢測(cè)雖然很方便，但是病原體感染人體后需要間隔一段時(shí)間后才出現(xiàn)抗體，并且血清學(xué)檢查只能確定是否接觸過(guò)該種病原體，但不能確定是否有現(xiàn)行感染，對(duì)潛伏病原體的檢查有困難。對(duì)感染性疾病的基因診斷具有快速、靈敏、特異等優(yōu)點(diǎn)。80年代建立的PCR技術(shù)已廣泛應(yīng)用于對(duì)病原體的檢測(cè)。一般根據(jù)各病原體特異和保守的序列設(shè)計(jì)引物，有的還合成ASO探針，對(duì)病原體的DNA可用PCR技術(shù)直接檢查，而對(duì)RNA病毒，則采用RT-PCR?，F(xiàn)在市場(chǎng)已經(jīng)有許多種病原體的測(cè)定藥盒供應(yīng)，每一盒包含擴(kuò)增某種病原體的特異引物，所需的酶以及配妥的各種反應(yīng)試劑，并附有可行的操作方法步驟。?病毒性感染：多種病毒性感染都可采用基因診斷檢測(cè)相應(yīng)的病原體，如甲型、乙型、丙型和丁型肝炎病毒，人免疫缺陷病毒、可薩奇病毒、脊髓灰質(zhì)類病毒、腺病毒、EB病毒、皰疹病毒、人巨細(xì)胞病毒、乳頭狀病毒等。最近新發(fā)現(xiàn)的SARS冠狀病毒，在基因組(RNA)序列確定后，便很快建立了RT-PCR的基因診斷法。?細(xì)菌性感染：可應(yīng)用基因診斷檢測(cè)多種致病性的細(xì)菌，如結(jié)核分枝桿菌、痢疾性大腸桿菌、霍亂弧菌、淋球菌、綠膿桿菌……等。?寄生蟲：惡性瘧原蟲、克魯斯錐蟲、利什曼原蟲、血吸蟲、弓形蟲……等都有基因診斷的方法?其它:如衣原體、支原體、真菌性感染也均用基因診斷。惡性腫瘤分析一些原癌基因的點(diǎn)突變、插入突變、基因擴(kuò)增、染色體易位和抑癌基因的丟失或突變，可以了解惡性腫瘤的分子機(jī)制，有助于對(duì)惡性腫瘤的診斷，對(duì)腫瘤治療及預(yù)后有指導(dǎo)意義。法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用對(duì)生物個(gè)體識(shí)別和親子鑒定傳統(tǒng)的方法有血型、血清蛋白型、紅細(xì)胞酶型和白細(xì)胞膜抗原(HLA)等，但這些方法都存在著一些不確定的因素。近年來(lái)對(duì)人基因結(jié)構(gòu)的深入研究發(fā)現(xiàn)，有些具有個(gè)體特征的遺傳標(biāo)記可用于個(gè)體識(shí)別和親子鑒定。1.DNA指紋分析(DNAfingerprinting)近年研究發(fā)現(xiàn)，人類基因組中許多位點(diǎn)存在著一種可變串聯(lián)重復(fù)序列(variablenumberoftandemrepeat，VNTR)。這種VNTR主要存在于基因的非編碼區(qū)，重復(fù)序列是頭對(duì)尾串聯(lián)排列著。人類某些VNTR是由20-50個(gè)重復(fù)單位組成，每個(gè)單位含15-100bp，DNA的長(zhǎng)度為1kb至5kb，較普通衛(wèi)星DNA(約100kb)小，所以稱為小衛(wèi)星DNA(minisatelliteDNA)。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)VNTR有高度的多態(tài)性，在人群中的分布表現(xiàn)高度的個(gè)體特異性，甚至同一個(gè)體同源染色體的等位VNTR的重復(fù)單位數(shù)也不同，等位基因按孟德爾方式遺傳。VNTR區(qū)的重復(fù)單位數(shù)目不同，所以該區(qū)的DNA長(zhǎng)度不同。但每一位點(diǎn)VNTR的核心序列卻有高度的保守性，因此可認(rèn)為VNTR是一種判斷個(gè)體的遺傳標(biāo)記。1985年，Jeffreys根據(jù)VNTR的特點(diǎn)，選擇某些核心序列作為探針，并選用核心序列無(wú)切割位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶如Hinfl，對(duì)DNA樣品進(jìn)行酶解，然后作Southern印跡。圖譜顯示不同個(gè)體具有不同條帶，如同人的指紋具有高度的個(gè)體特異性一樣，因此把這種Southern印跡圖稱作DNA指紋圖譜(DNAfingerprint)，如圖21-6所示。實(shí)驗(yàn)證明，除同卵雙生子有相同的圖譜外，兩個(gè)人不可能有完全相同的圖譜，所以這種方法對(duì)個(gè)體識(shí)別，親子鑒定，嫌疑罪犯的判斷準(zhǔn)確可靠。圖21-7是引自文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果?？墒荢ourthern印跡技術(shù)操作繁瑣，所需時(shí)間長(zhǎng)，需要DNA量較大，若DNA降解還會(huì)影響對(duì)結(jié)果的判斷。所以，Jeffreys又根據(jù)每一VNTR區(qū)翼側(cè)保守序列設(shè)計(jì)引物，用PCR方法對(duì)該區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，因VNTR長(zhǎng)度不同，所以產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，染色后，根據(jù)條帶的不同，可以判斷結(jié)果。這種方法既方便又省時(shí)，對(duì)部分酶解DNA也適用，對(duì)單根毛發(fā)，血斑，皮屑和精跡都可進(jìn)行分析。但有些VNTR重復(fù)片斷較長(zhǎng)，PCR難以擴(kuò)增。?短串聯(lián)重復(fù)(shorttandemrepeat,STR)多態(tài)性分析90年代初，發(fā)現(xiàn)人基因組中存在著數(shù)量眾多的STR,STR的重復(fù)單元較短，核心序列含2-4bp，DNA片段長(zhǎng)度為100-500bp，故稱為微衛(wèi)星DNA(microsatelliteDNA).與VNTR相同，有不少的微衛(wèi)星DNA存在著個(gè)體間重復(fù)單元數(shù)目不同的多態(tài)性，所以是一種應(yīng)用價(jià)值很高的遺傳標(biāo)記。又因?yàn)槲⑿l(wèi)星DNA較短，易進(jìn)行PCR操作，也能適用于降解的DNA分析。目前，STR-PCR技術(shù)在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用已占主導(dǎo)地位。VNTR和STR除在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用外，還用于遺傳作圖，基因定位及遺傳疾病的診斷等。?基因治療o(wú)基因治療的慨念基因治療的定義從基因角度可以理解為對(duì)缺陷的基因進(jìn)行修復(fù)或?qū)⒄Ｓ泄δ艿幕蛑脫Q或增補(bǔ)缺陷基因的方法。若從治療角度可以廣義地說(shuō)是一種基于導(dǎo)入遺傳物質(zhì)以改變患者細(xì)胞的基因表達(dá)從而達(dá)到治療或預(yù)防疾病的目標(biāo)的新措施。導(dǎo)入的基因可以是與缺陷基因相對(duì)應(yīng)的有功能的同源基因或與缺陷基因無(wú)關(guān)的治療基因?；蛑委熡袃煞N形式，一種是改變體細(xì)胞的基因表達(dá)，即體細(xì)胞基因治療(somaticgenetherapy)，另一種是改變生殖細(xì)胞的基因表達(dá)，即種系基因治療(germlinegenetherapy)，從理論上講，若對(duì)缺陷的生殖細(xì)胞進(jìn)行矯正，不但當(dāng)代可以得到根治，而且可以將正常的基因傳給子代。但生殖的生物學(xué)極其復(fù)雜，且尚未清楚，一旦發(fā)生差錯(cuò)將給人類帶來(lái)不可想象的后果，涉及一系列倫理學(xué)的問(wèn)題，目前還不能用于人類。在現(xiàn)有的條件下，基因治療僅限于體細(xì)胞，基因型的改變只限于某一類體細(xì)胞，其影響只限于某個(gè)體的當(dāng)代。（二）基因治療的方式基因治療的方式（typeofgenetherapy）主要有3類，一類為基因矯正或置換，即對(duì)缺陷基因的異常序列進(jìn)行矯正，對(duì)缺陷基因精確地原位修復(fù)，或以正?；蛟恢脫Q異?；?，因此不涉及基因組的任何改變，目前尚無(wú)體內(nèi)成功的報(bào)道。另一類為基因增補(bǔ)，不去除異?；?，而是通過(guò)外源基因的導(dǎo)入，使其表達(dá)正常產(chǎn)物，從而補(bǔ)償缺陷基因的功能。再有一類為基因封閉，有些基因異常過(guò)度表達(dá)，如癌基因或病毒基因可導(dǎo)致疾病，可用反義核酸技術(shù)、核酶或誘餌（decoy）轉(zhuǎn)錄因子來(lái)封閉或消除這些有害基因的表達(dá)。除上述3大類外，近日發(fā)展其它多種形式，如導(dǎo)入病毒或細(xì)菌來(lái)源的所謂“自殺基因”或經(jīng)過(guò)改造的條件性復(fù)制病毒，只能在p53缺陷的腫瘤細(xì)胞繁殖以達(dá)到溶解腫瘤細(xì)胞。（三）導(dǎo)入的方式導(dǎo)入基因有兩種方式，一種是體外導(dǎo)入（exvivo），即在體外將基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)，再將這種基因修飾過(guò)的細(xì)胞回輸病人體內(nèi)，使這種帶有外源基因的細(xì)胞在體內(nèi)表達(dá)，從而達(dá)到治療或預(yù)防的目的。被用于修飾的細(xì)胞可以是自體，同種異體或異種的體細(xì)胞。合適的細(xì)胞應(yīng)易于從體內(nèi)取出和回輸，能在體外增殖，經(jīng)得起體外實(shí)驗(yàn)操作，能夠高效表達(dá)外源基因，且能在體內(nèi)長(zhǎng)期存活。目前常用的細(xì)胞有淋巴細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、皮膚成纖維細(xì)胞、肝細(xì)胞、肌細(xì)胞、角骯細(xì)胞（keratinocyte）、多種腫瘤細(xì)胞等。另一種是體內(nèi)導(dǎo)入（invivo），即將外源基因直接導(dǎo)入體內(nèi)有關(guān)的組織器官，使其進(jìn)入相應(yīng)的細(xì)胞并進(jìn)行表達(dá)。o外源治療基因無(wú)論是exvivo或invivo導(dǎo)入基因的方式，首先要選擇合適的能達(dá)到治療或預(yù)防用的目的基因。如導(dǎo)入遺傳疾病所缺陷的基因或增強(qiáng)機(jī)體免疫的細(xì)胞因子基因。目前用于臨床試驗(yàn)的治療基因主要為該基因的cDNA。一些臨床試驗(yàn)用的基因見表21-1作為外源治療基因的條件：基因的大小要根據(jù)所用載體（vector）能夠運(yùn)載的容量；若為分泌性產(chǎn)物需含信號(hào)肽序列；cDNA序列應(yīng)正確無(wú)誤；翻譯時(shí)要求有起始密碼子及終止密碼子。o載體系統(tǒng)要有效將治療基因?qū)肴梭w細(xì)胞內(nèi)需要靠合適的運(yùn)送基因的工具，即載體（vector）,載體有兩類：一類為病毒載體（viralvector），另一類為非病毒載體（non-viralvector）目前臨床636個(gè)基因治療方案所用的載體列于表21-2目前臨床試驗(yàn)用的載體仍然以病毒載體居多，占70%以上，而逆轉(zhuǎn)錄病毒載體約占所用全部載體的1/3。非病毒載體以脂質(zhì)體居多，而裸質(zhì)粒DNA的應(yīng)用有逐漸上升的趨勢(shì)。目前所用的載體尚不盡人意，有些是存在著安全性問(wèn)題，有些則為效率不高等缺點(diǎn)。下面將討論幾類常用載體的構(gòu)建極其優(yōu)點(diǎn)。（一）逆轉(zhuǎn)錄病毒載體?逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒（retrovirus）屬RNA病毒，通過(guò)其本身逆轉(zhuǎn)錄酶的作用，形成雙鏈DNA原病毒，然后整合于宿主細(xì)胞染色體中，詳細(xì)的基因結(jié)構(gòu)及生活史見第十三章。構(gòu)建載體時(shí)以DNA原病毒為基礎(chǔ)，將野生型病毒的3類結(jié)構(gòu)基因gag，pol和env刪除，以供外源基因的插入，但是要保存病毒的包裝序列（寸）和雙側(cè)的長(zhǎng)末端重復(fù)（LTR），LTR含有啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、整合信號(hào)及polyA信號(hào)等多種元件。插入的基因一般為兩種或兩種以上，一種為標(biāo)記基因（markergene）供陽(yáng)性篩選，常用的為原核細(xì)胞的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II（NPTII,neoR基因），該酶能破壞抗生素G418（新霉素的衍生物）的活性。哺乳動(dòng)物細(xì)胞在含G418的培養(yǎng)液中不能生長(zhǎng)，若含有neoR基因能產(chǎn)生NPTII，即能在含有G418的培養(yǎng)液中生長(zhǎng)，故便于篩選轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的細(xì)胞。另一種為供治療用的基因，治療基因和標(biāo)記基因可識(shí)別受控于不同啟動(dòng)子，其中一種受逆轉(zhuǎn)錄病毒的LTR調(diào)控，另一種常需連接另外的啟動(dòng)子序列，或者連接一種稱為內(nèi)核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列（IRES），使轉(zhuǎn)錄成一條多順反子mRNA，在翻譯過(guò)程中IRES具有內(nèi)啟動(dòng)作用，能啟動(dòng)蛋白質(zhì)的合成，所以同一分子mRNA能合成2種或2種以上不同的蛋白質(zhì)。如何包裝成含有外源基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒供治療用的呢？因?yàn)檩d體本身的3類結(jié)構(gòu)基因已被刪除，因此包裝所需的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，需要靠一種所謂的包裝細(xì)胞，如PA317,提供，這種細(xì)胞含有一種缺失包裝信號(hào)的逆轉(zhuǎn)錄病毒，只能產(chǎn)生包裝所需的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，但本身的病毒RNA因缺失包裝信號(hào)，所以不會(huì)被包裝成病毒顆粒，這對(duì)治療的安全性很重要，可避免產(chǎn)生有復(fù)制潛能的逆轉(zhuǎn)錄病毒（RCR）。將上述所構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞PA317，可產(chǎn)生供治療用的含有治療基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒，見圖21-8,這種病毒能高效感染細(xì)胞，使治療基因能夠整合全細(xì)胞的染色體中，從而能長(zhǎng)期表達(dá)基因產(chǎn)物，以達(dá)到治療目的。?逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的優(yōu)缺點(diǎn)最大的優(yōu)點(diǎn)為能準(zhǔn)確整合于宿主細(xì)胞的染色體中，所攜帶的外源目的基因及有關(guān)序列不會(huì)發(fā)生重排，因而能長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)。感染細(xì)胞范圍較廣，感染率比較高，由于結(jié)構(gòu)基因均被刪除，因此免疫原性較低。對(duì)感染細(xì)胞無(wú)毒性作用?？筛郊硬煌恼{(diào)控元件來(lái)提高外源基因的表達(dá)效率，并對(duì)之進(jìn)行調(diào)控。局限性：逆轉(zhuǎn)錄病毒只能在核膜尚未形成時(shí)，才能進(jìn)入核內(nèi)，因此它只能將外源基因轉(zhuǎn)移至增殖分裂的細(xì)胞，而對(duì)靜止細(xì)胞轉(zhuǎn)錄效果不佳。由于該病毒基因本身不大，故能容納外源基因的大小有限，應(yīng)小于8kb。逆轉(zhuǎn)錄病毒穩(wěn)定性較差，難耐受體外的操作，在純化或濃縮過(guò)程常使其感染性降低。病毒顆粒能迅速被補(bǔ)體破壞。因?yàn)槭请S機(jī)整合，所以具有插入突變的危險(xiǎn)，特別是病毒制劑中污染著RCR。（二）其他病毒載體?腺病毒感染人的腺病毒（adenovirus）有50余種血清型，能感染多種組織器官，產(chǎn)生類似感冒或類似流感癥狀，目前多數(shù)采用無(wú)致病性的5型及2型腺病毒作為載體。構(gòu)建載體時(shí)ITR及包裝信號(hào)應(yīng)保存，其余的部分有些可刪除，供外源基因的插入，插入片段的大小可達(dá)8kb。腺病毒載體較穩(wěn)定，能耐受純化濃縮等操作，可獲得高滴度的病毒顆粒，感染宿主細(xì)胞范圍較廣，感染效率高，既能感染分裂相細(xì)胞，也能感染非分裂相細(xì)胞，但腺病毒不整合于宿主細(xì)胞染色體，故只能短暫表達(dá)外源基因，最大的缺點(diǎn)為引起機(jī)體的免疫反應(yīng)和毒副作用。?腺相關(guān)病毒屬微小病毒科，不致病，為單鏈DNA約4.7kb，腺相關(guān)病毒（adeno-associatedvirus），作為載體最大的優(yōu)點(diǎn)能感染分裂相和非分裂相細(xì)胞，并整合于宿主細(xì)胞染色體，能長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)，無(wú)不良反應(yīng)，適合于一些遺傳性疾病如甲型和乙型血友病的基因治療。但腺相關(guān)病毒載體的制備因需要輔助病毒的參與，有污染的可能性。?其他慢病毒（如HIV）、I型單純性皰疹病毒、痘病毒和桿狀病毒等都被研究發(fā)展作為轉(zhuǎn)移基因的載體。（三）脂質(zhì)體上述病毒載體最大的特點(diǎn)是能高效轉(zhuǎn)移外源目的基因，但是也存在著許多的局限性，特別是免疫原性強(qiáng)和可能造成細(xì)胞突變危險(xiǎn)。因此發(fā)展非病毒載體倍受基因治療研究者的注意。借助物理、化學(xué)方法或直接將外源基因?qū)胨拗骷?xì)胞內(nèi)。脂質(zhì)體(liposome)主要是由天然磷脂和膽固醇類衍生物組成類似生物膜的脂質(zhì)雙分子層包圍水相形成的閉合囊泡。脂質(zhì)體有兩類：一類為陽(yáng)離子脂質(zhì)體，表面帶正電荷，由于DNA帶負(fù)電，因此借正電荷的作用，可以濃集和縮合DNA，形成脂質(zhì)體DNA復(fù)合物(lipoplex)可攜帶的基因不受DNA大小的限制，見圖21-9。目前基因治療所用的脂質(zhì)體都是陽(yáng)離子脂質(zhì)體。另一類為帶負(fù)電脂質(zhì)體，表面帶負(fù)電，DNA或其他藥物被包埋在內(nèi)部水相中。由于脂質(zhì)體具有類似生物膜的性質(zhì)，因此當(dāng)脂質(zhì)體DNA復(fù)合物與細(xì)胞膜接觸后，通過(guò)胞吞作用(endocytosis)而進(jìn)入胞內(nèi)。脂質(zhì)體載體除上述介導(dǎo)外源基因轉(zhuǎn)移不受大小限制外，最大的優(yōu)點(diǎn)為無(wú)生物源性，無(wú)毒性，更安全可靠。但是轉(zhuǎn)染效率很低，而且是短暫表達(dá)。裸DNA裸DNA(nakedDNA)，即將外源基因構(gòu)建于真核表達(dá)質(zhì)粒，借助物理的或機(jī)械方法直接將其導(dǎo)入宿主組織細(xì)胞內(nèi)。橫紋肌和心肌攝取裸DNA的效率較高。若外源基因表達(dá)產(chǎn)物可激發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)，以防治某些疾病，可稱為DNA疫苗(DNAvaccine)，是一種非常有希望的新型疫苗。直接注射裸DNA轉(zhuǎn)染效率不高，常借助一些物理方法?；驑?genegun)，通過(guò)高壓放電產(chǎn)生強(qiáng)烈的沖擊波(shockwave)，作用于被金包埋的DNA微粒，使DNA微粒加速運(yùn)動(dòng)，即顆粒轟擊(particlebombardment)而穿透組織細(xì)胞，此法不但可用于體外轉(zhuǎn)移基因，而且已用于臨床將表達(dá)IL-12質(zhì)粒導(dǎo)入淺表腫瘤組織。矩形波電穿孔儀(squareelectroporator)這種儀器能產(chǎn)生低電壓的矩形波，使細(xì)胞穿孔，讓DNA進(jìn)入，因?yàn)楫a(chǎn)生的僅是使細(xì)胞穿孔的矩形波，可避免一般電穿孔儀產(chǎn)生的高電壓造成細(xì)胞損傷的缺點(diǎn)，電壓的范圍為5-500V，加壓間隔為100毫秒-1秒。這種儀器可用于體外基因轉(zhuǎn)移，也可用于體內(nèi)組織器官的基因轉(zhuǎn)移，據(jù)報(bào)道對(duì)肌肉組織的轉(zhuǎn)移效率比直接注射DNA高2個(gè)數(shù)量級(jí)以上，是一種很有前景的基因轉(zhuǎn)移方法。o基因治療的臨床試驗(yàn)?zāi)壳芭R床基因治療試驗(yàn)的方案已達(dá)9百多個(gè)，受治療的患者已有數(shù)千例表21-3可見當(dāng)前臨床基因治療(genetherapy)或廣義地稱基因轉(zhuǎn)移(genetransfer)試驗(yàn)，有三種類型，即治療性、基因標(biāo)記及非治療性試驗(yàn)。后者將腺病毒載體注射于健康自愿者的體內(nèi)，觀察機(jī)體對(duì)腺病毒載體的反應(yīng)。這些方案的臨床試驗(yàn)期(trialphases)極大多數(shù)為I期臨床試驗(yàn)，III期者僅僅4個(gè)方案。說(shuō)明基因治療臨床試驗(yàn)尚處于未成熟階段。基因標(biāo)記目前常用的基因標(biāo)記方法是將含neoR基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在體外轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，然后回輸全病人體內(nèi)，可以很方便地跟蹤這種標(biāo)記細(xì)胞的命運(yùn)，用來(lái)研究許多其他方法不能回答的體細(xì)胞移植的生物學(xué)問(wèn)題。美國(guó)第一個(gè)被批準(zhǔn)基因標(biāo)記的臨床研究計(jì)劃是NIH的Rosenberg等的腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(tumorinfiltratinglymphocytes,TIL)基因標(biāo)記實(shí)驗(yàn)。他將惡性黑色素瘤組織或轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)制成單細(xì)胞懸液，在IL-2的作用下淋巴細(xì)胞可成倍增殖而腫瘤細(xì)胞及其他類型細(xì)胞則死亡。這種TIL能特異殺傷腫瘤細(xì)胞。先在體外將含有neoR基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)TIL，該載體能整合至TIL的基因組，故子代的TIL也含有neoR基因，能在含抗生素G418的培養(yǎng)液中生長(zhǎng)，便于篩選；也可用PCR檢測(cè)neoR基因是否存在，以跟蹤回輸體內(nèi)的TIL的去處。將這種基因修飾過(guò)的TIL注射于黑色素瘤患者，可以研究TIL在體內(nèi)各組織器官、血循環(huán)細(xì)胞、淋巴結(jié)、腫瘤組織的分布情況；特別感興趣的是觀察TIL是否能靶向腫瘤組織；同時(shí)也可以研究TIL在體內(nèi)存活期的長(zhǎng)短；以及了解這種體外基因修飾過(guò)的TIL是否會(huì)自主生長(zhǎng)和惡變？注射后對(duì)人體是否有害？這些問(wèn)題的闡明可為基因治療打基礎(chǔ)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因修飾過(guò)的TIL在體外不會(huì)自主增殖，說(shuō)明沒有惡變。在注射后的頭3周，用PCR可測(cè)出外周血存在著含有neoR基因的單核細(xì)胞，有的長(zhǎng)至60d尚可測(cè)出。在注射后3d活檢的腫瘤組織也可測(cè)出有基因修飾過(guò)的TIL的存在。有人對(duì)其他細(xì)胞如骨髓細(xì)胞、肝細(xì)胞和細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞等進(jìn)行標(biāo)記研究。單基因疾病遺傳性單基因疾病(monogenicdiseases)是基因治療的理想侯選對(duì)象，設(shè)計(jì)治療方案時(shí)應(yīng)考慮下列幾點(diǎn)因素：⑴對(duì)造成該疾病有關(guān)的基因應(yīng)有較詳細(xì)的了解，并能在實(shí)驗(yàn)室克隆適合真核細(xì)胞表達(dá)的有關(guān)基因的cDNA序列，供轉(zhuǎn)導(dǎo)用。⑵經(jīng)有功能基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的體細(xì)胞，只要產(chǎn)生較少量原來(lái)缺少的基因產(chǎn)物就能矯正疾病。例如腺苷脫氨酶(ADA)缺乏的嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷(SCID)，由于淋巴細(xì)胞缺乏ADA酶，造成腺苷及dATP的堆積，可破壞免疫功能，患兒很少活至成年。若淋巴細(xì)胞ADA恢復(fù)至正常水平的5%?10%即能維持免疫系統(tǒng)的功能，對(duì)病人癥狀就有改善，這是第一個(gè)基因臨床治療的方案。血友病B，是由于凝血因子IX缺乏所致。現(xiàn)知只要因子IX水平達(dá)到正常的10%?20%就能緩解嚴(yán)重的血友病。對(duì)血友病A而言，只要因子伽達(dá)正常水平的5%就能緩解癥狀，血友病已開始基因治療臨床試驗(yàn)。⑶即使導(dǎo)入基因過(guò)度表達(dá)，對(duì)機(jī)體應(yīng)無(wú)不良作用。⑷有些遺傳疾病是某些特殊細(xì)胞基因缺損造成的，但那有關(guān)的細(xì)胞不易取出供體外基因工程操作用。例如Parkinson癥是腦黑質(zhì)細(xì)胞(substantianigra)的酪氨酸羥化酶缺乏，不能產(chǎn)生多巴胺(dopamine)，給病人注射多巴胺可減輕癥狀。動(dòng)物模型試驗(yàn)表明，將酪胺酸羥化酶基因轉(zhuǎn)導(dǎo)成纖維細(xì)胞，再移植全腦內(nèi)，可以減輕動(dòng)物模型的異常行為。⑸現(xiàn)在采用的以正常有功能的同源基因來(lái)增補(bǔ)體內(nèi)的缺乏基因，因此要求增補(bǔ)的基因在病人壽命期間能穩(wěn)定表達(dá)，或重復(fù)治療，所以應(yīng)考慮構(gòu)建能長(zhǎng)期持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)外源基因的載體，并考慮將外源基因轉(zhuǎn)導(dǎo)干細(xì)胞，如造血干細(xì)胞以望回輸體內(nèi)后其子代細(xì)胞也含有外源基因。目前應(yīng)用基因治療的單基因疾病已有二十多種。惡性腫瘤惡性腫瘤屬?gòu)?fù)雜基因疾病(complexgeneticdiseases)，可能涉及多種基因的異常，發(fā)病過(guò)程是多步驟的，至今雖有不少有關(guān)的基因被鑒定，但腫瘤發(fā)病的分子機(jī)制尚未清楚，因此治療時(shí)應(yīng)選擇何種靶基因不明確，多數(shù)是根據(jù)不同的環(huán)節(jié)，設(shè)計(jì)不同的治療策略，目前臨床惡性腫瘤的基因治療策略有十余種之多。見表21-4。?免疫基因治療(immunogenetheray)分體外轉(zhuǎn)導(dǎo)和體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)二種。體外轉(zhuǎn)導(dǎo)將一些能刺激免疫反應(yīng)的細(xì)胞因子基因，如IL-2、IL-12、IFN-y等轉(zhuǎn)導(dǎo)腫瘤細(xì)胞作為基因工程“瘤苗”，給腫瘤患者注射，宗旨為提高腫瘤細(xì)胞的免疫原性，有利于被機(jī)體免疫系統(tǒng)識(shí)別及排斥；由于轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞因子基因