病毒轉(zhuǎn)基因技術(shù)原理腺相關(guān)病毒

（優(yōu)選）病毒轉(zhuǎn)基因技術(shù)原理腺相關(guān)病毒目前一頁\總數(shù)四十一頁\編于十一點第一部分生物學(xué)特性血清型病毒結(jié)構(gòu)病毒復(fù)制對理化因素的抵抗力目前二頁\總數(shù)四十一頁\編于十一點血清型AAV是從腺病毒的污染物（1965年）、人群或非人靈長類動物等的組織中分離鑒定到的。共鑒定了11個AAV血清型以及108個AAV變株（variants）。通過簽名PCR（signaturePCR）技術(shù)，利用高度保守序列擴(kuò)增Cap基因的一小段可變區(qū)的DNA序列，以篩檢是否是新的AAV分離株，然后利用PCR技術(shù)獲得新的AAV分離株的Cap或（和）Rep基因的全長序列。在人類、非人靈長類動物、馬、豬、牛、綿羊、山羊和蛇等的不同組織器官，發(fā)現(xiàn)了大量的具有多樣性的AAV的基因組。但新分離的病毒株，尚未進(jìn)行血清學(xué)分型，通稱為變株。AAV不同血清型和變株的基因組結(jié)構(gòu)相對較為保守，與AAV-2型較為類似，不同血清型的衣殼蛋白結(jié)構(gòu)中表位的差異。50~80%AAV-2抗體在人群中檢測出。目前三頁\總數(shù)四十一頁\編于十一點轉(zhuǎn)導(dǎo)不同組織器官的AAV最優(yōu)血清型

組織最優(yōu)血清型肝臟AAV-8,AAV-9骨骼肌AAV-1,AAV-7,AAV-6,AAV-8,AAV-9中樞神經(jīng)系統(tǒng)AAV-5,AAV-1,AAV-4肺臟AAV-9心臟AAV-8腎臟AAV-2胰腺AAV-8眼睛（光受體細(xì)胞）AAV-5,AAV-4不同血清型在吸附細(xì)胞表面能力、病毒受體、胞內(nèi)交通和抗原性等方面具有明顯的區(qū)別，以及針對不同組織和細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率不一致，體現(xiàn)出不同的組織極性（tissuetropisms）目前四頁\總數(shù)四十一頁\編于十一點病毒結(jié)構(gòu)AAV-2

20–30nm，基因組為線性、單鏈的DNA分子。正鏈和負(fù)鏈的單鏈DNA分子，以同等效率包裝在病毒體衣殼中?；蚪M全長4679個核苷酸?；蚪M包括兩個ORF，三個啟動子（啟動子以在基因組中處的作圖位置標(biāo)示，分別為p5、p19和p40啟動子），以及兩末端為145個核苷酸的反向末端重復(fù)序列（invertedterminalrepeat，ITR）目前五頁\總數(shù)四十一頁\編于十一點ITRITR中的前125個核苷酸具有回文結(jié)構(gòu)，其中還存在兩個小的內(nèi)部回文結(jié)構(gòu)，可自身折疊后經(jīng)堿基配對、形成T字形的發(fā)夾結(jié)構(gòu)；剩余的20個核苷酸，保持非配對狀態(tài)，稱為D序列（Dsequence）。ITR中還具有Rep結(jié)合元件（Repbindingelements，RBEs)RBE和RBEˊ，以及一個末端解離位點TRS（terminalresolutionsite）等重要序列。ITR是在AAV生物學(xué)中重要的順式（cis）作用活性元件，在病毒復(fù)制中具有重要作用：在非容許條件下，ITR在病毒復(fù)制的負(fù)調(diào)控中起關(guān)鍵作用；在容許條件下，作為病毒基因組復(fù)制的起點和引物。ITR對病毒基因組的包裝、轉(zhuǎn)錄、以及位點特異性的整合，均是必需的。目前六頁\總數(shù)四十一頁\編于十一點左端的ORF（Rep基因）可編碼四個Rep蛋白，即Rep78，Rep68，Rep52和Rep40，均具有螺旋酶和ATP酶活性。較大的Rep蛋白如Rep78和Rep68，由P5啟動子指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄，分別由未剪輯和剪輯的轉(zhuǎn)錄物產(chǎn)生，具有鏈和位點特異的核酸內(nèi)切酶活性（切割點在TRS附近）以及位點特異的DNA結(jié)合活性（結(jié)合于RBE）。因此它們是重要的調(diào)節(jié)蛋白，以反式（trans）方式參與調(diào)節(jié)AAV復(fù)制周期的所有階段，如DNA復(fù)制、位點特異性整合、整合病毒基因組的拯救，調(diào)節(jié)病毒和細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)的啟動子等。較小的Rep蛋白如Rep52和Rep40，由P19啟動子指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄，分別由未剪輯和剪輯的轉(zhuǎn)錄物產(chǎn)生，參與單鏈DNA的聚集并包裝入病毒體的衣殼。目前七頁\總數(shù)四十一頁\編于十一點右端的ORF（Cap基因）由P40啟動子指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生兩個轉(zhuǎn)錄物，可編碼三個病毒衣殼蛋白，即VP1，VP2和VP3。這些衣殼蛋白利用共同的ORF，但轉(zhuǎn)錄起始位置不一致。一般而言，VP1、VP2和VP3的分子比是1：1：8/10。構(gòu)成這些病毒體的衣殼蛋白的比例的差異，最有可能會影響病毒的感染性，尤其是VP1含量低的情況下。缺乏VP1的病毒體沒有感染性。目前八頁\總數(shù)四十一頁\編于十一點病毒復(fù)制八個主要步驟：與細(xì)胞表面受體黏附或結(jié)合內(nèi)吞（endocytosis）在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)內(nèi)吞體運(yùn)輸釋放出內(nèi)吞體進(jìn)入胞核脫殼并釋放病毒基因組啟動雙鏈DNA的合成整合到細(xì)胞染色體或以附加子形式持久表達(dá)病毒基因目前九頁\總數(shù)四十一頁\編于十一點不同血清型的AAV感染的細(xì)胞類型不同，這取決于不同血清型的AAV靶向細(xì)胞表面的受體的差異。而且這也決定了不同血清型的病毒在細(xì)胞內(nèi)的不同的運(yùn)輸途徑AAV病毒的糖苷受體和輔助受體AAV血清型受體和輔助受體AAV-1α2–3/α2–6NlinkedSAAAV-2HSPG,FGFR1,HGFR,integrins,37/67kDaLamRAAV-3HSPG,37/67kDaLamRAAV-4α2–3OlinkedSAAAV-5α2–3NlinkedSA,PDGFRAAV-6HSPG,

α2–3/α2–6NlinkedSAAAV-7AAV-837/67kDaLamRAAV-9Galactose,37/67kDaLamR目前十頁\總數(shù)四十一頁\編于十一點AAV病毒基因組的復(fù)制模型左為RFm，右為RFd）

Rep蛋白目前十一頁\總數(shù)四十一頁\編于十一點AAV成功感染細(xì)胞后，依據(jù)是否有輔助病毒存在的情況下：裂解階段（lyticstage）和溶原性階段（lysogenicstage）

AAV的復(fù)制周期可以分為兩個階段溶原性階段（lysogenicstage）:在缺乏輔助病毒如AdV、HSV等感染的情況下，AAV幾乎不能復(fù)制，基因表達(dá)受到抑制，AAV基因組會整合到染色體q13.4的一個4kb大小的區(qū)域（命名為AAVS1），建立潛伏感染裂解階段（lyticstage）:在輔助病毒如AdV、HSV-1等共同感染的情況下，AAV可以經(jīng)歷核酸復(fù)制、病毒基因表達(dá)和病毒體產(chǎn)生等過程，最終形成產(chǎn)毒性感染受到羥基脲、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑或紫外線照射等處理，在缺乏輔助病毒的情況下，也可以刺激AAV的復(fù)制。AAV的復(fù)制在某些細(xì)胞也可以自發(fā)發(fā)生。目前十二頁\總數(shù)四十一頁\編于十一點染色體q13.4的AAVS1位點中最少33bp的序列，包含由8個核苷酸分開的RBE樣和TRS樣序列，對AAV的靶向整合是必須而且充分的條件。位點特異性的整合過程即使是在Rep78和Rep68蛋白理想表達(dá)的條件下，未必是完全是位點特異的，大約40-70%的整合發(fā)生在AAVS1位點溶原性階段（lysogenicstage）目前十三頁\總數(shù)四十一頁\編于十一點AdV能提供輔助功能的基因有E1a，E1b55K，E2a，E4orf6和VARNA（viralassociatedRNA）。

HSV-1能提供輔助AAV復(fù)制功能，至少涉及HSV-1的復(fù)制蛋白，包括helicase/primasecomplex(UL5,UL8,和UL52)和DNA結(jié)合蛋白ICP8（UL29）。裂解階段（lyticstage）目前十四頁\總數(shù)四十一頁\編于十一點對環(huán)境理化因素的抵抗力AAV對理化因素如溫度和pH的抵抗力強(qiáng)。對化學(xué)消毒劑如1％的次氯酸鈉、2％戊二醛、0.25％十二烷基硫酸鈉等敏感。目前十五頁\總數(shù)四十一頁\編于十一點第二部分致病性與免疫性

約80%的人群的血清抗AAV抗體陽性，這些抗體針對的血清型是AAV-1，2，3和AAV-5型。但針對AAV在人群自然感染史的認(rèn)識非常少，且未發(fā)現(xiàn)這些感染導(dǎo)致臨床典型的病理改變或疾病。目前十六頁\總數(shù)四十一頁\編于十一點蛋白表達(dá)型腺相關(guān)病毒載體

基因打靶型腺相關(guān)病毒載體rAAV的純化和定量三成分包裝系統(tǒng)

自我互補(bǔ)型AAV載體（self-complementaryAAVvector，scAAV）反式剪接型AAV載體（trans-splicingAAVvector,tsAAV）衣殼蛋白修飾型AAV載體第二節(jié)腺相關(guān)病毒載體

轉(zhuǎn)基因技術(shù)原理目前十七頁\總數(shù)四十一頁\編于十一點第一部分蛋白表達(dá)型腺相關(guān)病毒載體三成分包裝系統(tǒng)

:重組AAV病毒體（rAAV，ssAAV,Sigle-strandedAAV）的組裝，必須依賴于三種成分，即：轉(zhuǎn)移載體，由轉(zhuǎn)基因表達(dá)讀框以及兩側(cè)的野生型AAV的ITR區(qū)組成；AAV的cap和rep編碼序列；輔助病毒功能建立了各種各樣的方法和細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)以制備rAAV，并且這些方法和培養(yǎng)系統(tǒng)還在不斷完善之中目前最常使用的rAAV載體系統(tǒng)是二(或三)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293法(two/threeplasmidtransfectionofadherentHEK293cells)，包括rAAV轉(zhuǎn)移載體，rAAV輔助質(zhì)粒和(或)輔助病毒質(zhì)粒三部分目前十八頁\總數(shù)四十一頁\編于十一點三成分包裝系統(tǒng)

:rAAV轉(zhuǎn)移載體僅保留野生型AAV基因組中決定其復(fù)制、包裝和整合必須的順式作用元件——基因組兩端的ITR序列；全部去掉rep

和cap基因及其控制序列，用外源基因及其控制序列代替。實際包裝外源基因的上限僅為4.4kb。rAAV輔助質(zhì)粒是克隆的ITR缺失的野生型AAV的基因組，以反式方式提供rep

和cap基因編碼蛋白的功能。目的在于病毒包裝過程中，避免野生型AAV病毒的形成。AdV輔助病毒質(zhì)粒，包括其起輔助功能的基因E2a，E4orf6和VARNA。E1a和E1b55K可由HEK293細(xì)胞提供。第一部分蛋白表達(dá)型腺相關(guān)病毒載體目前十九頁\總數(shù)四十一頁\編于十一點三成分包裝系統(tǒng)優(yōu)點:三成分包裝系統(tǒng)不足:快速、有效，避免了輔助病毒的使用當(dāng)rAAV用于心臟、肝臟和骨骼肌等器官時，制備大量的rAAV耗時、耗力

采用大規(guī)模懸浮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)可克服這一障礙，并研制了三種替代的方法第一部分蛋白表達(dá)型腺相關(guān)病毒載體目前二十頁\總數(shù)四十一頁\編于十一點三成分包裝系統(tǒng)的大規(guī)模懸浮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù):細(xì)胞類型細(xì)胞系A(chǔ)AV功能輔助病毒功能rAAV載體哺乳動物細(xì)胞HEK293pRepCappAdpAAVHEK293pRepCap/AdpAAVHeLa/RepCap細(xì)胞提供Ad5Ad/rAAVHeLa/RepCap/rAAV細(xì)胞提供Ad5細(xì)胞提供A549/RepCap細(xì)胞提供Ad5Ad/rAAVA549/RepCap/rAAV細(xì)胞提供Ad5細(xì)胞提供HeLa/RepCap/rAAV細(xì)胞提供HSV-1細(xì)胞提供293/rAAVHSV-RepCapHSV載體提供細(xì)胞提供HEK293HSV-RepCapHSV載體提供HSV-rAAVBHK21HSV-RepCapHSV載體提供HSV-rAAV昆蟲細(xì)胞Sf9Bac-Rep+Bac-VPBac載體提供Bac-rAAVSf9Bac-RepCapBac載體提供Bac-rAAVSf9/RepCap細(xì)胞提供Bac載體提供Bac-rAAV采用重組桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)BEVS（baculovirusexpressionvectorsystem），提供三種成分并感染昆蟲細(xì)胞或利用包含cap和rep的穩(wěn)定包裝昆蟲細(xì)胞系；包含cap和rep的穩(wěn)定包裝哺乳動物細(xì)胞系，并通過感染AdV提供輔助功能；利用哺乳動物細(xì)胞系和重組HSV-1提供cap和rep，rAAV和輔助功能。第一部分蛋白表達(dá)型腺相關(guān)病毒載體目前二十一頁\總數(shù)四十一頁\編于十一點策略2constructedAdhelperplasmidsthatarecotransfectedontoE1a/E1b-expressing293cellsalongwithaplasmidthatexpressestherepandcapgenesandavectorplasmid60°C,30minForty-eighttoseventy-twohoursaftertransfectionAdisinactivatedbyheattreatment目前二十二頁\總數(shù)四十一頁\編于十一點目前二十三頁\總數(shù)四十一頁\編于十一點自我互補(bǔ)型AAV載體（self-complementaryAAVvector，scAAV）重組AAV（ssAAV）進(jìn)入細(xì)胞后，在啟動蛋白表達(dá)之前，重要的限速步驟是單鏈基因組需要轉(zhuǎn)換成為雙鏈基因組。McCarty等缺失了rAAV的一個ITR區(qū)的TRS（△trs），阻止其突變末端參與復(fù)制的啟動，最終形成一個呈現(xiàn)串聯(lián)的、單鏈的反向重復(fù)的基因組，其兩端是野生型的ITR，但中間一個是突變型的ITR。脫出衣殼后，將以中間突變的ITR為基礎(chǔ)折疊形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，形成自我互補(bǔ)的雙鏈，因此，在組織或體外實驗中可以快速和高效表達(dá)。這種類型的scAAV的包裝能力僅為ssAAV的一半，大約2.3kb。最近的進(jìn)展是利用scAAV表達(dá)小干擾RNA(siRNA，small-interferenceRNA)。第一部分蛋白表達(dá)型腺相關(guān)病毒載體目前二十四頁\總數(shù)四十一頁\編于十一點自我互補(bǔ)型AAV載體（self-complementaryAAVvector，scAAV）由于ssAAV和scAAV載體的包裝容量均有限，限制了在基因治療領(lǐng)域的應(yīng)用。第一部分蛋白表達(dá)型腺相關(guān)病毒載體目前二十五頁\總數(shù)四十一頁\編于十一點反式剪接型AAV載體（trans-splicingAAVvector,tsAAV）單鏈線性AAVDNA的自由末端以頭-尾相接的形式經(jīng)分子間內(nèi)重組形成的串聯(lián)的二聚體（concatemers），介導(dǎo)AAV在特定組織(如肌肉)中的非整合性長效表達(dá)。利用此原理，將一個較大的外源基因拆分成兩個部分，分別包括剪接供體位點SD（splicedonorsites）和剪接受體位點SA（spliceacceptorsites），建立兩個不同的rAAV載體或不同亞型的ITR雜交載體，即反式剪接型AAV載體；共感染靶細(xì)胞后，可以指導(dǎo)兩個外源基因片段形成首尾拼接的異二聚體、經(jīng)正確剪接后形成完整的基因而獲得表達(dá)。該型載體可克服包裝容量的限制，可達(dá)9kb，并成功在肺臟、肌肉和視網(wǎng)膜等表達(dá)。第一部分蛋白表達(dá)型腺相關(guān)病毒載體目前二十六頁\總數(shù)四十一頁\編于十一點自我互補(bǔ)型AAV載體（self-complementaryAAVvector，scAAV）總體而言，反式剪接型AAV載體較ssAAV低效。第一部分蛋白表達(dá)型腺相關(guān)病毒載體目前二十七頁\總數(shù)四十一頁\編于十一點衣殼蛋白修飾型AAV載體

交叉包裝型AAV載體（cross-packagingAAVvector）：利用同一AAV載體的基因組包裝入不同血清型的衣殼，便于直接比較不同的血清型以及在體內(nèi)的組織極性的差異，為了利用不同衣殼的組織極性而有目的改造。鑲嵌型載體（mosaicvectors）：將不同血清型的衣殼按照不同比例混合。嵌合型病毒體（chimericvirions）：將不同血清型的VP蛋白重新聯(lián)合形成。第一部分蛋白表達(dá)型腺相關(guān)病毒載體目前二十八頁\總數(shù)四十一頁\編于十一點衣殼蛋白修飾型AAV載體

免疫逃避載體：分子進(jìn)化方法如DNA洗牌（DNAshuffling）和易錯PCR（error-pronePCR）等技術(shù)構(gòu)成的突變衣殼蛋白庫，然后直接進(jìn)行定向篩選抵抗中和抗體、或具有特定受體親和性、或細(xì)胞嗜性的rAAV，或者經(jīng)位點導(dǎo)向的突變（site-directedmutagenesis）、特異肽端插入（peptideinsertion）和化學(xué)接合（chemicalconjugation）等方法細(xì)胞靶向特異性AAV載體(targetspecificAAVvector)：利用不同細(xì)胞表面的特定受體，對AAV衣殼蛋白進(jìn)行插入突變或缺失，導(dǎo)致配體改變組織特異性AAV載體（tissue-specificAAVvector：利用特定組織細(xì)胞表達(dá)的啟動子，以實現(xiàn)靶向特定組織如肌肉、肺臟和腫瘤等第一部分蛋白表達(dá)型腺相關(guān)病毒載體目前二十九頁\總數(shù)四十一頁\編于十一點第二部分基因打靶型腺相關(guān)病毒載體野生型AAV-2在Rep的作用下，定點整合于人19號染色體的AAVSl位點。重組AAV不含rep基因，定點整合的可能性極度下降?？梢酝ㄟ^高M(jìn)OI感染以及對細(xì)胞敏感的血清型的衣殼包裝，可能增加AAV的單鏈DNA入核并與細(xì)胞染色體發(fā)生重組的幾率?；虼虬行虯AV載體依賴于DNA的雙鏈斷裂(doublestrandbreak，DSB)，AAV可通過同源重組修復(fù)DNA雙鏈可介導(dǎo)包括插入、缺失、點突變等多種遺傳修飾的細(xì)胞內(nèi)的基因打靶。因此，基因打靶型AAV載體重點在于設(shè)計，載體序列與染色體靶基因序列的同源臂的匹配長度，將載體上待突變的基因放在中央。3~5%的感染細(xì)胞可以發(fā)生整合，顯著高于轉(zhuǎn)染或電穿孔方式獲得的基因打靶頻率，且在打靶中AAV介導(dǎo)的基因表達(dá)可以長期持續(xù)、并具有高度的保真性。目前三十頁\總數(shù)四十一頁\編于十一點rAAV載體應(yīng)用于基因校正、基因阻斷治療疾病或生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因家畜、用于農(nóng)業(yè)和研究的大型動物等具有無可比擬的優(yōu)勢，如：介導(dǎo)的基因打靶的效率高達(dá)1％、高于質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染或電轉(zhuǎn)化，宿主范圍廣泛，可利用的多種亞型等。主要缺陷是大約10％仍是隨機(jī)整合、具有潛在的致死或致癌效應(yīng)。研究顯示可采用成體干細(xì)胞并在體外篩選特異打靶克隆用于疾病治療。第二部分基因打靶型腺相關(guān)病毒載體目前三十一頁\總數(shù)四十一頁\編于十一點策略3細(xì)胞內(nèi)整合表達(dá)目前三十二頁\總數(shù)四十一頁\編于十一點

純化（三種方法）離子交換色譜法（IEXchromatography）：原理是依據(jù)在某一PH條件下，不同血清型的AAV的衣殼蛋白的電荷不同，因而，可以利用這一技術(shù)將不同的血清型的AAV分離純化.優(yōu)勢:具有快速、規(guī)模化、可重復(fù)性以及適用于不同血清型病毒純化的。缺點:在于需要摸索鹽和PH濃度，以利于AAV病毒顆粒結(jié)合于IEX離子柱，而且這些條件依據(jù)不同的血清型而有所變化；另外常需要多步驟才能獲得高純度的rAAV。第三部分純化和定量目前三十三頁\總數(shù)四十一頁\編于十一點

純化（三種方法）受體特異性的親和純化（Receptor-specificaffinitypurification）：Heparansulfateproteoglycan(HSPG)是AAV-2感染細(xì)胞的受體，因此肝素親和色譜分析法（Heparinaffinitychromatography）利用AAV-2和細(xì)胞特定受體結(jié)合這一特點，進(jìn)行AAV-2的純化，可獲得高滴度和高純度的純化產(chǎn)物并可以用于臨床試驗，這也是rAAV-2在臨床試驗中作為使用最廣的原因之一。依據(jù)同樣原理，mucin被作為親和配體以純化AAV-5。缺點是不同的血清型的受體不同，因此，適用范圍較窄。第三部分純化和定量目前三十四頁\總數(shù)四十一頁\編于十一點

純化（三種方法）AVB