碩士研究課現(xiàn)代分子生物學(xué)海藻多糖降解酶胡忠

海藻多糖降解酶的研究胡忠2009-10-26目前一頁\總數(shù)七十六頁\編于二十點(diǎn)主要內(nèi)容一、海藻多糖二、海藻多糖降解酶三、本課題組的相關(guān)研究目前二頁\總數(shù)七十六頁\編于二十點(diǎn)海帶

裙帶菜

龍須菜

紫菜一、海藻多糖1、來源目前三頁\總數(shù)七十六頁\編于二十點(diǎn)

8000多種海藻：藍(lán)藻、綠藻、紅藻和褐藻。海藻膠是海藻細(xì)胞壁內(nèi)的主要填充物質(zhì)，約占細(xì)胞干重的20%－30%。瓊膠卡拉膠褐藻膠世界產(chǎn)量(萬噸)1-2約33-4中國產(chǎn)量(萬噸)0.3-0.41.2約2目前四頁\總數(shù)七十六頁\編于二十點(diǎn)近年來，各國的科學(xué)家大力開展從海洋開發(fā)新藥物的研究計(jì)劃。因此，對(duì)海藻、海藻多糖及其多糖類代謝產(chǎn)物進(jìn)行了大規(guī)模的化學(xué)分離、結(jié)構(gòu)確定及生物活性篩選研究。至今，已經(jīng)從海藻中分離到了具有抗菌、抗腫瘤等活性的多糖類代謝產(chǎn)物，海藻寡糖的生理作用也不斷被揭示，引起了人們更大的興趣。目前五頁\總數(shù)七十六頁\編于二十點(diǎn)2、特性一類多組分混合物，由不同的單糖基通過糖苷鍵相連而成，是海藻細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)所含的各種高分子碳水化合物的總稱。一般為水溶性，大多含有硫酸基，多具高黏度或凝固能力種類很多，根據(jù)其來源不同，分為紅藻多糖、綠藻多糖、褐藻多糖等，其中褐藻多糖的種類和數(shù)量最多。目前六頁\總數(shù)七十六頁\編于二十點(diǎn)三大海藻多糖：

瓊膠(agar)、卡拉膠(carrageenan)、褐藻膠(algin)

褐藻膠：來自海帶、羊棲菜等褐藻?？ɡz：角叉菜、杉藻、江籬等紅藻；有13種類型，主要有κ-卡拉膠、-卡拉膠、ι-卡拉膠等。瓊膠：江籬、石花菜等紅藻，由瓊膠糖和硫瓊膠兩部分組成。目前七頁\總數(shù)七十六頁\編于二十點(diǎn)3、海藻多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)

褐藻膠是由多聚D-甘露糖醛酸(M)n和多聚L-古羅糖醛酸(G)n以不同規(guī)則的排列順序分布于分子鏈中，兩者中間以交替的MG或多聚交替(MG)n相連接3.1褐藻膠目前八頁\總數(shù)七十六頁\編于二十點(diǎn)瓊脂糖結(jié)構(gòu)

瓊脂糖(Agarose)和硫瓊膠(Agaropectin)的混合物。瓊脂糖是以(1,3)-β-D-半乳糖基-(1,4)-3,6-內(nèi)醚(或不內(nèi)醚化)-α-L-半乳糖為重復(fù)二糖的多糖。

硫瓊膠，又稱硫酸脂瓊膠、瓊脂果膠，是帶有硫酸脂（鹽）、葡萄糖醛酸和丙酮酸的復(fù)雜多糖。3.2瓊膠目前九頁\總數(shù)七十六頁\編于二十點(diǎn)卡拉膠以(1,3)-β-D-半乳糖基-(1,4)-3,6-內(nèi)醚(或不內(nèi)醚化)-α-D-半乳糖為重復(fù)二糖的多糖。根據(jù)硫酸根數(shù)量和位置分為不同類型3.3卡拉膠目前十頁\總數(shù)七十六頁\編于二十點(diǎn)瓊脂糖和卡拉膠的二糖組成比較卡拉膠和瓊膠均來自于紅藻，結(jié)構(gòu)非常相似瓊膠中的瓊脂糖不含有硫酸根，不帶電，應(yīng)用于核酸電泳；瓊膠中的硫瓊膠含有硫酸根如何去除硫瓊膠是瓊脂糖制備中的關(guān)鍵?？傮w上：卡拉膠中的硫酸基明顯多于瓊膠目前十一頁\總數(shù)七十六頁\編于二十點(diǎn)agarplate瓊脂糖agarose核酸電泳4.1瓊膠瓊膠可用作增稠劑、凝固劑、懸浮劑、乳化劑、穩(wěn)定劑、保鮮劑、粘合劑和生物培養(yǎng)基。4、海藻多糖的應(yīng)用目前十二頁\總數(shù)七十六頁\編于二十點(diǎn)4.2卡拉膠具有形成親水膠體，凝膠、增稠、乳化、威膜、穩(wěn)定分散等特性，因而被廣泛應(yīng)用于乳制品、冰淇淋、果汁飲料、面包、水凝膠（水果凍）、肉食品、調(diào)味品、罐頭食品等方面。4.3褐藻膠廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、紡織、印染、造紙、日用化工等產(chǎn)品，作為增稠劑、乳化劑、穩(wěn)定劑、粘合劑、上漿劑等使用。目前十三頁\總數(shù)七十六頁\編于二十點(diǎn)5、海藻低聚糖褐藻膠被廣泛應(yīng)用于各種工業(yè)生產(chǎn)中，褐藻膠或其分級(jí)產(chǎn)物經(jīng)特定的方式改性后，有特殊的生理活性，如：治療缺血性心腦血管疾病的海洋新藥－－藻酸雙酯鈉(PSS)，已創(chuàng)產(chǎn)值近20億元，產(chǎn)生了巨大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益，治療缺血性心腦血管疾病的甘糖酯等。（管華詩）5.1褐藻膠低聚糖目前十四頁\總數(shù)七十六頁\編于二十點(diǎn)5.3卡拉膠低聚糖

抗腫瘤；對(duì)放射性損傷的保護(hù)作用；抑制血管生長；抗氧化；抗菌等皮膚保濕、增白天然防腐劑益生元5.2瓊膠低聚糖

作為淀粉老化抑制劑、高甜度甜味劑的充填劑及分散劑、抗氧化劑；功能性食品基料等食品添加劑；在藥物方面的應(yīng)用：抑制癌細(xì)胞的發(fā)生、抗病毒等。目前十五頁\總數(shù)七十六頁\編于二十點(diǎn)？如何制備海藻低聚糖目前十六頁\總數(shù)七十六頁\編于二十點(diǎn)兩種方法：酸法：降解海藻多糖反應(yīng)劇烈、工藝條件難以控制，酸解法制備低聚褐藻膠已不能適應(yīng)市場(chǎng)的需要。酶法：降解具有高效性和專一性的特點(diǎn)，而且降解條件溫和，水解產(chǎn)物不易被破壞，利于產(chǎn)物分析和回收，因而逐漸代替了傳統(tǒng)的酸解法。目前十七頁\總數(shù)七十六頁\編于二十點(diǎn)二、海藻多糖降解酶1、分類褐藻膠裂合酶、卡拉膠酶、瓊膠酶2、來源海洋中的一些軟體動(dòng)物鮑、海膽、螺等目前十八頁\總數(shù)七十六頁\編于二十點(diǎn)微生物來源相關(guān)細(xì)菌可來自：海洋植物體表、動(dòng)物腸道、海水及海洋沉積物卡拉膠酶：海洋細(xì)菌噬纖維菌屬、假單胞菌屬等褐藻膠裂合酶：固氮菌屬和假單胞菌屬等海洋細(xì)菌以及真菌等

瓊膠酶：噬纖維菌屬、假單胞菌屬、鏈霉菌屬、弧菌屬、別單胞菌屬等目前十九頁\總數(shù)七十六頁\編于二十點(diǎn)3、海藻多糖降解酶的作用機(jī)制3.1褐藻膠裂合酶(alginatelyase)專一作用于多聚D2甘露糖醛酸(M)n的甘露糖醛酸酶；專一作用于多聚L2古羅糖醛酸(G)n的古羅糖醛酸酶(占多數(shù))；某些海洋細(xì)菌甚至可以同時(shí)產(chǎn)生具有降解多聚D2甘露糖醛酸(M)n和多聚L2古羅糖醛酸(G)n的酶系。1998年，Ertesvag等人從維涅蘭德固氮菌(Azotobactervinelandii)中得到一種褐藻膠酶，該酶可以降解MM和MG鍵的多糖，但不能降解GM和GG鍵。目前二十頁\總數(shù)七十六頁\編于二十點(diǎn)poly(G)poly(M)

MG褐藻膠裂合酶催化β-消去反應(yīng)，斷裂褐藻膠分子鏈，在新的非還原端產(chǎn)生具有不飽和雙鍵的糖醛酸，此單元在230~240nm有強(qiáng)烈的紫外吸收。因此，酶活力的測(cè)定可在此范圍內(nèi)的波長內(nèi)測(cè)定。poly(G)MM

GG褐藻膠裂合酶的作用機(jī)制目前二十一頁\總數(shù)七十六頁\編于二十點(diǎn)與三糖GGG的綁定與三糖MMG的綁定Sphingomonassp.A1的褐藻膠裂合酶A1-II′與底物作用的結(jié)構(gòu)模型Oguraetal.2008,J.Mol.Biol.380,373–385目前二十二頁\總數(shù)七十六頁\編于二十點(diǎn)催化部位氨基酸殘基與三糖GGG之間的作用，藍(lán)色代表G單元，綠色代表與底物有氫鍵作用(黑色虛線)的氨基酸殘基。催化部位氨基酸殘基與三糖MMG之間的作用，藍(lán)色代表G單元，紅色代表M單元目前二十三頁\總數(shù)七十六頁\編于二十點(diǎn)3.2卡拉膠酶(carrageenase)

根據(jù)卡拉膠酶的底物專一性不同可將卡拉膠酶分為：-卡拉膠酶、-卡拉膠酶和-卡拉膠酶目前二十四頁\總數(shù)七十六頁\編于二十點(diǎn)

ι-卡拉膠酶裂解部位ι-卡拉膠酶的晶體結(jié)構(gòu)MichelG.etal.2001,JBiolChem.276(43):40202-9目前二十五頁\總數(shù)七十六頁\編于二十點(diǎn)ι-卡拉膠酶的催化部位及其與底物結(jié)合示意圖催化部位的關(guān)鍵氨基酸目前二十六頁\總數(shù)七十六頁\編于二十點(diǎn)瓊脂糖-瓊膠酶3.3瓊膠酶(agarase)目前二十七頁\總數(shù)七十六頁\編于二十點(diǎn)β-瓊膠酶α-瓊膠酶Reportedagarasesβ－瓊膠酶

α－瓊膠酶

瓊寡糖agarooligosaccharides新瓊寡糖neoagarooligosaccharides目前二十八頁\總數(shù)七十六頁\編于二十點(diǎn)Pseudoalteromonasatlantica菌的β－瓊膠酶酶系目前二十九頁\總數(shù)七十六頁\編于二十點(diǎn)

瓊膠酶降解瓊膠機(jī)制Allouch在研究ZobelliagalactanivoransDsij所分泌的β-瓊膠酶降解瓊膠糖的瓊膠酶-瓊膠寡糖復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)時(shí)發(fā)現(xiàn)，在瓊膠酶蛋白質(zhì)體上結(jié)合了兩條寡糖鏈，一條在其催化活性部位處，蛋白體結(jié)合了寡糖鏈上四個(gè)糖單體，另一條接合在與催化活性部位相對(duì)應(yīng)平行的部位上，蛋白體上結(jié)合另一條寡糖鏈上的8個(gè)糖單體；由此推斷，這種含有兩個(gè)平行的糖鏈接合位點(diǎn)的瓊膠酶意味著該酶可能在催化降解瓊膠糖之前能解開瓊膠糖的雙螺旋結(jié)構(gòu)。目前三十頁\總數(shù)七十六頁\編于二十點(diǎn)4、海藻多糖降解酶的生化性質(zhì)目前三十一頁\總數(shù)七十六頁\編于二十點(diǎn)5、海藻多糖降解酶的應(yīng)用如：制備原生質(zhì)體（4）其他應(yīng)用（1）制備海藻低聚糖，為新藥、新功能食品的開發(fā)提供新的手段（2）作為海藻遺傳工程酶（3）研究海藻多糖結(jié)構(gòu)如：瓊膠酶可用于DNA膠回收目前三十二頁\總數(shù)七十六頁\編于二十點(diǎn)6、海藻多糖降解酶的研究概況20世紀(jì)90年代前：少數(shù)的研究，少量酶得到純化90年代后：許多酶得到純化，廣泛應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建基因工程菌近幾年：更注重研究酶的空間結(jié)構(gòu)、酶降解海藻多糖的機(jī)理，以期提供在分子水平上改造酶的可能性。目前有關(guān)海藻多糖降解酶三維結(jié)構(gòu)的報(bào)道還比較少。目前三十三頁\總數(shù)七十六頁\編于二十點(diǎn)海藻多糖降解酶的基因克隆及結(jié)構(gòu)研究代表了這一領(lǐng)域最新、最重要的進(jìn)展。通過將海藻多糖降解酶的基因克隆到適于工業(yè)化生產(chǎn)的宿主細(xì)胞，可使海藻多糖降解酶的發(fā)酵產(chǎn)率發(fā)生量的飛躍。此外，對(duì)海藻多糖降解酶結(jié)構(gòu)的詳細(xì)了解使得設(shè)計(jì)適合工業(yè)化應(yīng)用的酶種成為可能。目前三十四頁\總數(shù)七十六頁\編于二十點(diǎn)

歐美最早開展海藻多糖降解酶研究，進(jìn)入20世紀(jì)90年代日本廣泛開展這方面研究，到目前為止，日本在國際上發(fā)表的相關(guān)論文最多，法國其次。中國在近幾年才開始注重海藻多糖水解酶的研究，目前在國際上發(fā)表的相關(guān)論文還較少。目前三十五頁\總數(shù)七十六頁\編于二十點(diǎn)目前三十六頁\總數(shù)七十六頁\編于二十點(diǎn)三、本課題組的相關(guān)研究1、產(chǎn)瓊膠酶菌株目前已經(jīng)篩選得到多株產(chǎn)瓊膠酶以及褐藻膠裂解酶的海洋細(xì)菌，其中有五株細(xì)菌高產(chǎn)瓊膠酶，分別命名為HZ105、ZC1、X3、LA1、LA2。

目前三十七頁\總數(shù)七十六頁\編于二十點(diǎn)2216E平板碘液活性染色HZ105Agarivoranssp.HZ105目前三十八頁\總數(shù)七十六頁\編于二十點(diǎn)2216E平板碘液染色ZC1目前三十九頁\總數(shù)七十六頁\編于二十點(diǎn)X3碘液染色2216E平板目前四十頁\總數(shù)七十六頁\編于二十點(diǎn)以瓊膠為唯一碳源Vibriosp.LA1Agarivoranssp.LA2目前四十一頁\總數(shù)七十六頁\編于二十點(diǎn)菌株ZC1的16SrRNA基因，相似性最高的只有95.5％Bar,0.02substitutionspernucleotideposition.目前四十二頁\總數(shù)七十六頁\編于二十點(diǎn)菌株形態(tài)生理生化碳源利用脂肪酸組成G＋Cmol％菌株鑒定16SrRNA基因序列分析代謝類型菌落形態(tài)醌類物質(zhì)目前四十三頁\總數(shù)七十六頁\編于二十點(diǎn)

菌株HZ105瓊膠酶的分離、純化將菌株HZ105胞外粗酶液進(jìn)行PAGE電泳凝膠后的盧哥氏碘液活性染色表明HZ105產(chǎn)生三種胞外瓊膠酶，分別為瓊膠酶a、b、c。1：胞外粗酶液的碘液活性染色2：胞外粗酶液的PAGE2、瓊膠酶的分離純化目前四十四頁\總數(shù)七十六頁\編于二十點(diǎn)1－2：瓊膠酶b（1）、c（2）的活性染色3－4：瓊膠酶b（3）、c（4）的非變性電泳5－6：瓊膠酶b（5）、c（6）的變性電泳M：蛋白標(biāo)準(zhǔn)純化后瓊膠酶的SDS將PAGE電泳凝膠中的瓊膠酶條帶回收，SDS表明瓊膠酶a,b,c的分子量分別為105kDa、58kDa、54kDa。b

c目前四十五頁\總數(shù)七十六頁\編于二十點(diǎn)瓊膠酶b、c的質(zhì)譜(LCMS/MS)鑒定結(jié)果：瓊膠酶b與來自菌株Vibriosp.JT0107的一個(gè)β-瓊膠酶最為匹配目前四十六頁\總數(shù)七十六頁\編于二十點(diǎn)瓊膠酶c與來自菌株Agarivoranssp.JAMB-A11的一個(gè)β-瓊膠酶最為匹配目前四十七頁\總數(shù)七十六頁\編于二十點(diǎn)方案1：采取隨機(jī)切割產(chǎn)瓊膠酶細(xì)菌總DNA的策略，回收1-10kb的DNA片段與酶切的質(zhì)粒載體連接構(gòu)建重組質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中。

重組子的篩選策略方案2：比較已報(bào)道的瓊膠酶基因已得到保守區(qū)域，并以此設(shè)計(jì)引物通過合適的PCR得到瓊膠酶基因。3、瓊膠酶基因的研究目前四十八頁\總數(shù)七十六頁\編于二十點(diǎn)02468101214161820475257626772反應(yīng)溫度（℃）酶活力（U/mL）菌株X3所產(chǎn)瓊膠酶的最適反應(yīng)溫度較高3.1部分基因組文庫克隆瓊膠酶基因菌株X3目前四十九頁\總數(shù)七十六頁\編于二十點(diǎn)部分基因組文庫線路圖：p-BluescriptSKBamHI酶切菌株基因組DNASau3AI酶切同尾酶目的片斷轉(zhuǎn)化篩選3000bp目前五十頁\總數(shù)七十六頁\編于二十點(diǎn)■部分基因組文庫克隆菌株X3的瓊膠酶基因

大約20000個(gè)陽性克隆子，出現(xiàn)20個(gè)左右的凹陷的瓊膠水解圈；陽性克隆子經(jīng)驗(yàn)證，分別有2種插入片段：插入片段1：1260bp，其中含有一個(gè)612bp的ORF，推測(cè)其編碼瓊膠酶目前五十一頁\總數(shù)七十六頁\編于二十點(diǎn)插入片段2：3656bp，其中含有一個(gè)長1590bp的ORF，Blastp比對(duì)，推測(cè)是瓊膠酶。目前五十二頁\總數(shù)七十六頁\編于二十點(diǎn)1590bpORF的Blastp比對(duì)結(jié)果目前五十三頁\總數(shù)七十六頁\編于二十點(diǎn)重組菌DH5α-X3a染色前用盧戈氏碘液染色后的重組菌DH5α-X3a

1590bp的ORF與pET-32a構(gòu)建重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，重組菌表現(xiàn)瓊膠酶活性目前五十四頁\總數(shù)七十六頁\編于二十點(diǎn)3.2利用序列同源性克隆基因根據(jù)已報(bào)道的瓊膠酶基因序列的同源性or保守區(qū)域，設(shè)計(jì)引物通過PCR得到瓊膠酶基因。Agarivoranssp.HZ105目前五十五頁\總數(shù)七十六頁\編于二十點(diǎn)以下菌株的瓊膠酶基因序列存在較大相似性Agarivoranssp.JA-1,Agarivoranssp.JAMB-A11，Agarivoranssp.QM38,Vibriosp.PO-303,Vibriosp.JT0107Agarivoranssp.HZ105是否也具有類似的瓊膠酶基因？根據(jù)所報(bào)道的上述菌株的瓊膠酶基因序列設(shè)計(jì)引物Agarivoranssp.HZ1054個(gè)瓊膠酶基因HZ1,HZ2,HZ3,HZ4目前五十六頁\總數(shù)七十六頁\編于二十點(diǎn)瓊膠酶基因HZ12988bpBlastnHighestidentify：98%Highestidentify：99%瓊膠酶基因HZ1氨基酸序列BlastpHZ1目前五十七頁\總數(shù)七十六頁\編于二十點(diǎn)NCBIconserveddomaindatabase（CDD）沒有搜索到保守區(qū)序列瓊膠酶基因HZ1氨基酸序列InterProScan數(shù)據(jù)庫搜索：蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域和功能位點(diǎn)表明該序列編碼的瓊膠酶的功能結(jié)構(gòu)域與以往報(bào)道的瓊膠酶有所不同，可能存在著新的結(jié)構(gòu)功能特性。目前五十八頁\總數(shù)七十六頁\編于二十點(diǎn)瓊膠酶基因HZ1在大腸桿菌的重組表達(dá)pET-32a碘液染色LB瓊脂平板目前五十九頁\總數(shù)七十六頁\編于二十點(diǎn)BlastnresultofagarasegeneHZ2(2868bp)HZ2目前六十頁\總數(shù)七十六頁\編于二十點(diǎn)BlastpresultofagaraseHZ2糖基轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝目前六十一頁\總數(shù)七十六頁\編于二十點(diǎn)BlastnresultofagarasegeneHZ31437bpBlastpresultofagaraseHZ3NoputativeconserveddomainshavebeendetectedHZ3目前六十二頁\總數(shù)七十六頁\編于二十點(diǎn)瓊膠酶基因HZ3在大腸桿菌的重組表達(dá)pET-32a碘液染色LB瓊脂平板目前六十三頁\總數(shù)七十六頁\編于二十點(diǎn)BlastnresultofagarasegeneHZ41362bpBlastpresultofagaraseHZ4HZ4目前六十四頁\總數(shù)七十六頁\編于二十點(diǎn)agaraseHZ4的保守區(qū)糖水解酶16家族-瓊膠酶亞家族的催化區(qū)PutativeconserveddomainshavebeendetectedRicin-typebeta-trefoil;

Carbohydrate-bindingdomain

糖基綁定？重組表達(dá)，驗(yàn)證糖基綁定作用目前六十五頁\總數(shù)七十六頁\編于二十點(diǎn)瓊膠酶基因HZ4在大腸桿菌的重組表達(dá)pET-32a碘液染色LB瓊脂平板目前六十六頁\總數(shù)七十六頁\編于二十點(diǎn)各個(gè)瓊膠酶及其可能的降解瓊脂糖的產(chǎn)物：

HZ1：菌株HZ105agaD01：A.QM38agaE11：A.JA-1agaA11：A.JAMB-A11產(chǎn)生2、4、6糖，最終2糖

agaA：V.JT0107產(chǎn)生2、4糖

agaB：V.PO-303

HZ3：菌株HZ105agaD03：A.QM38agaC：V.PO-3038、10、12、14糖agaB：P.CY24

HZ4：菌株HZ105agaA：P.CY24主要產(chǎn)物8、10糖agaD：V.PO-303

HZ2：菌株HZ105agaD02：A.QM38agaB：V.JT01072糖agaE：V.PO-303菌株HZ105的瓊膠酶HZ1和HZ2可能錨定在膜上，主要負(fù)責(zé)將高聚合度的瓊膠寡糖降解為二糖。菌株HZ105的瓊膠酶HZ3和HZ4可能主要被分泌到胞外，主要負(fù)責(zé)將瓊脂糖降解為高聚合度的瓊膠寡糖。有糖基綁定模塊可能攻擊固態(tài)瓊膠目前六十七頁\總數(shù)七十六頁\編于二十點(diǎn)染色體HZ12988bpH