質(zhì)譜法測(cè)定分子結(jié)構(gòu)二大分子

質(zhì)譜法測(cè)定分子結(jié)構(gòu)二大分子第1頁/共100頁2方法：ESI和MALDI兩種電離方法。對(duì)象：帶有官能團(tuán)的可溶解高分子。1988年，Tanaka，最早報(bào)道聚乙烯醇(PEG)，~22,000。1992年，Danis，MALDI，聚丙烯酸和聚苯乙烯磺酸，~30,000。

M.Karas&F.HillenkampMALDI，聚苯乙烯~70ku，PEG~40ku。1996年，C.Fenselau，聚苯乙烯~1500ku?！?.1高聚物質(zhì)譜分析第2頁/共100頁3一、質(zhì)譜方法分析高聚物的特點(diǎn)1、人工合成高聚物的復(fù)雜性合成高分子是混合物，分子量是一種分布。不同的引發(fā)和終止反應(yīng)所得的高分子有不同的端基。在隨機(jī)共聚物中，高分子鏈的組成呈現(xiàn)某種化學(xué)分布。在嵌段共聚物中存在著不同的嵌段長(zhǎng)度和順序。非線性高分子，如環(huán)狀、支鏈和樹枝狀高聚物。2、質(zhì)譜分析高聚物的特色樣品用量少、耗時(shí)短、速度快。儀器分辨率高．使單體分析和端基分析成為可能。直接測(cè)定絕對(duì)分子量，而不是相對(duì)分子量，精度高于光散射和膜滲透方法。測(cè)定分子量時(shí)，不需要標(biāo)準(zhǔn)品或Mark-Houwink常數(shù)。由分子量分布可獲得聚合反應(yīng)的鏈增長(zhǎng)常數(shù)。第3頁/共100頁4二、MALDI-TOF方法測(cè)定高聚物影響因素1、基質(zhì)基質(zhì)的作用：從激光脈沖中吸收能量。要求：基質(zhì)對(duì)激光光源必須有很強(qiáng)的吸收。使被測(cè)分子分離成單分子狀態(tài)。要求：基質(zhì)和被測(cè)高分子具有很好的相容性，同時(shí)不能有強(qiáng)的分于間的相互作用。使用不同種類的激光(IR，UV)電離，需要用不同類型的基質(zhì)。紫外激光解離的基質(zhì)蒽三酚和銀鹽的混合是分析聚苯乙烯的首選，但是這個(gè)混合物不穩(wěn)定，見表格。紅外激光解離的基質(zhì)YAG激光(3.27m，相當(dāng)于3050cm-1)激發(fā)C-H的伸縮振動(dòng)。應(yīng)用于UV-MALDI的基質(zhì)也可用于IR-MALDI。第4頁/共100頁5MatricesPolymersHydrophilic2,5-dihydroxybenzoicacidPolypropyleneglycol-Cyano-hydroxycinnamicacidPolyvinylacetateFerulicacidPolytetramethyleneglycolIndoleacrylicacidPolymethylmethacrylateDithranolPolystyrenealltrans-RetinoicacidPolybutadieneDiphenylbutadienePolydimethylsiloxaneHydrophobic紅外激光與紫外激光電離的比較：紅外激光有較強(qiáng)的穿透能力，一次紅外激光照射能夠解吸更多的樣品，因此在一個(gè)樣品點(diǎn)上獲得的質(zhì)譜圖較少，要經(jīng)常更換激光照射點(diǎn)。紅外激光的脈沖較長(zhǎng)。一般在10～20s，而通常的紫外激光的脈沖約在3～5s，這導(dǎo)致了IR-MALDI的分辨率較差。一般來講，紫外激光器更適于分析合成高分子，紅外激光器可用于一些鹵代高分予的分析?；|(zhì)的選?。簶O性相似原則！常見基質(zhì)的極性比較第5頁/共100頁6基質(zhì)Mr/cm-1(at337nm)PA(kJ/mol)2,5-DHB1540.79105-841~866854±14854±16-CHCA1890.79105-841933±9766±8芥子酸(SA)2241.10105-887894±13蒽三酚226-874±8IAA187-900±16HABA242-943766±8UV-MALDI基質(zhì)的理化性質(zhì)第6頁/共100頁72、鹽效應(yīng)高分子測(cè)定過程中的陽離子化不是質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)，而是金屬離子與高分子發(fā)生陽離子化反應(yīng)，形成加合的高分子正離子。一般用Na+、K+等作為加合離子。有時(shí)不需要特別加入這些金屬，亦可以得到加合的正離子，這是由于容器上的Na+或K+所致。具有雜原子的合成高分子，在加鈉鹽、鉀鹽后產(chǎn)生加合金屬陽離子的正離子。聚醚、聚酯、聚丙烯酸酯、聚酷胺等。沒有雜原子的非極性合成高分子，如聚苯乙烯、聚丁二烯、聚異戊二烯在加入銀鹽或銅鹽后能夠成功的離子化，這些金屬陽離于與高分子中的雙鍵發(fā)生了作用。沒有雜原子和雙鍵的合成高分子．如聚乙烯和聚丙烯目前仍較難被MAIDI分析，因?yàn)樗鼈兊慕饘訇栯x子結(jié)合能極低。第7頁/共100頁83、樣品制備簡(jiǎn)單混合法：在使用一個(gè)特定的樣品制備方法時(shí)，必須先選擇適用于基質(zhì)、樣品和陽離子化鹽的溶劑，最理想的情況是使用一種溶劑．這樣可以減少樣品在靶上結(jié)晶時(shí)分層的危險(xiǎn)。然而，鹽類幾乎不溶于用于非極性合成高分子的有機(jī)溶劑。一般來講，鹽可以先溶于一個(gè)中間溶劑．如丙醇中，然后再用用于基質(zhì)和樣品的溶劑稀釋。制備樣品時(shí)，應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)娜軇⒑线m的濃度及配比，才能獲得較好的結(jié)果。電噴霧法一個(gè)很有前途的樣品制備方法是電噴霧沉積法，比起傳統(tǒng)的干點(diǎn)甚或薄層法，電噴霧法的優(yōu)點(diǎn)在于它可以形成小而均勻的結(jié)晶體。電噴霧沉積法制得樣品的點(diǎn)點(diǎn)之間重復(fù)性好，并且信號(hào)強(qiáng)度較大，層式的電噴霧效果更好一些。壓片法對(duì)于不溶的高分子樣品，如聚氨酯和大的多環(huán)芳香化臺(tái)物，發(fā)展了一砷新的制樣方法—壓片法．即將樣品和基質(zhì)按一定比例混合后用球磨機(jī)研磨均勻，壓成薄片進(jìn)行MALDI-TOF-MS分析。第8頁/共100頁9三、MALDI-TOF方法測(cè)定高聚物的應(yīng)用1、分子量的測(cè)定及分子量的分布計(jì)算公式：當(dāng)分子量的分散度小于1.2時(shí)．可獲得符合Poisson分布的質(zhì)譜圖，與GPC的結(jié)果一致。Mn：數(shù)均分子量Mw：重均分子量PD：分布常數(shù)ni：第i個(gè)寡聚物的相對(duì)豐度Mi：第i個(gè)寡聚物的質(zhì)量PS2800的MALDI-TOF質(zhì)譜圖PEG2000的MALDI-TOF質(zhì)譜圖第9頁/共100頁10PEG3100的MALDI-TOF質(zhì)譜圖PS29ku的MALDI-TOF質(zhì)譜圖聚合物數(shù)均分子量Mn重均分子量Mw分子量分布PD測(cè)定方法PS4600046760473191.01MALDI-TOF42000435001.03GPCPS7000073914745181.01MALDI-TOF66000675001.03GPCPEG1260012426124921.01MALDI-TOF11843123201.04GPCPEG23020022115221051.01MALDI-TOF20240212281.06GPCMALDI-TOF-MS方法與GPC方法所測(cè)分予量的比較第10頁/共100頁112、末端基分析含有聯(lián)吡啶的共軛高分子結(jié)構(gòu)聚合物的MALDI-TOF質(zhì)譜(a)IAA為基質(zhì),(b)IAA為基質(zhì)。并加入細(xì)AgTFA第11頁/共100頁12高分子化合物3(n=5)，環(huán)狀寡聚物的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(左)和理論同位素分布(右)(a):[(C28H32N2S)5+H]+(b):[(C28H32N2S)5+Ag]+

選取2142.1u的單同位素峰來計(jì)算端基的質(zhì)量。重復(fù)單元的質(zhì)量是428.2,代入2142.1/428.2＝5，即428.25＝2141。這個(gè)峰的質(zhì)荷比等于5個(gè)重復(fù)單元加1個(gè)質(zhì)子比時(shí)帶上的氫原子的質(zhì)量，因此可以椎測(cè)這個(gè)系列的高分子為環(huán)狀高分子．沒有端基。第12頁/共100頁1335u+158u+H+237u6=1616u35u+140u+H+237u6=1598u17u+140u+H+237u6=1580un=6一種寡聚物的MALDI-TOF質(zhì)譜分析兩種單體：三嗪聚胺的MALDI-TOF的質(zhì)譜第13頁/共100頁143、高分子混合物分析用MALDI分析不同種類的高分子混合物的文章很少．也許是因?yàn)殡x子化效率的顯著不同和其他一些歧視固素。例如二兩種窄分布的標(biāo)準(zhǔn)品PS10200和和PMMA9200分別溶解在THF中，以幾種體積比混合，接著以IAA為基質(zhì)加甲酸鈉或以蒽三酚為基質(zhì)加三氟乙酸銀。在第一套實(shí)驗(yàn)方案中，PS和PMMA的體積比從0:1增加到199:1，基質(zhì)是IAA/Na，也就是對(duì)PMMA是最佳條件，試驗(yàn)結(jié)果十分令入驚奇，甚至PMMA是以05％的不純物存在干PS中，質(zhì)譜圖仍然是PMMA的[M＋Na]+峰為主要峰。在第二套實(shí)驗(yàn)中，PS和PMMA的體積比從1:0到1:9，基質(zhì)是蒽三酚/Ag．也就是PS的最優(yōu)化條件。在所有混合物實(shí)驗(yàn)中，PMMA是主要離子，而PS僅以相對(duì)干PMMA為10%的峰出現(xiàn)，質(zhì)譜圖上主要是PMMA的峰。當(dāng)然，這種有利于PMMA的歧視效應(yīng)也許可以用來檢測(cè)PS中中痕量的PMMA．但是從這些結(jié)果中也可看出，用MALDI分析高分子混合物還要走很遠(yuǎn)的一段路。第14頁/共100頁154、嵌段型高分子分析嵌段共聚物之中嵌段和組成分布對(duì)于聚合物的最終性能有重要的影響。MALDI-TOF-MS也可以成功地應(yīng)用于嵌段型高分子的研究。Dams等人用MALDI分析了-甲基苯乙烯和乙烯基吡啶的嵌段共聚物。Wilezek-Vera等MALDI-TOFMS與1HNMR相結(jié)合，對(duì)苯乙烯/-甲基苯乙烯嵌段共聚物進(jìn)行研究，測(cè)定了該共果物的組成分布和嵌段長(zhǎng)度，我們研究組研究了榮乙二醇和聚苯乙烯的嵌段共聚物。用MALDI/TOF測(cè)得的分子量和以GPC測(cè)定的結(jié)果參見表。從表中可以青出，對(duì)干這類窄分布的高分子化合物，MALDI/TOF所得結(jié)果與GPC法所得結(jié)果比較接近。但是MALDI/TOF法更加迅速、方便，具有顯著的優(yōu)越性。MnMwPD共聚物GPC357737561.05No.1MALDI/TOF320735601.11共聚物GPC571963481.11No.1MALDI/TOF614265281.06GPC法和MALD/TOFMS法測(cè)得的分子量比較第15頁/共100頁16§5.2藥物的質(zhì)譜分析一、生物活性物質(zhì)分析1、天然產(chǎn)物分析各種提取物的分析，HPLC/MS聯(lián)用分析RootsLeaves,Bark+Solvent

Filter

ConcentrateLC-MSnWherearetherebiologicallyactivecompounds?第16頁/共100頁17Methanolic根部提取物024681012141618202224262830Time(min)0102030405060708090100RelativeAbundance11.9411.088.703.172.0718.0213.4618.5414.0718.8316.9219.0015.1319.421.60水-甲醇梯度0.25mL/min,C-18Column20uL進(jìn)樣LC-UV(215nm)第17頁/共100頁18LC-MS,基峰離子流圖2468101214161820Time(min)05101520253035404550556065707580859095100RelativeAbundance9.494.814.5817.8811.896.7219.0819.553.1617.0114.3913.692.1415.408.1010.8720.026.257.975.093.5421.421.07Unknow水-甲醇梯度0.25mL/min,C-18Column20uL進(jìn)樣第18頁/共100頁19300350400450500550600m/z58010203040501000102030405060708090RelativeAbundance473.1493.7460.8386.5300.2487.1400.3RT:9.21-9.61AV:8NL:1.28E6RT:11.78-11.94AV:4NL:7.42E5?(M-H)(M-H)負(fù)離子ESI全掃描質(zhì)譜圖(FullScanMS)Δ+14uUnknown1第19頁/共100頁20120140160180200220240260280300320m/z1000102030405060708090480510152025303540RelativeAbundance293.1179.1149.2311.9219.1180.5169.0294.2327.9121.1195.3144.9211.7275.2225.8164.0255.9244.5281.5324.9293.3307.2193.3325.8219.2179.3294.3308.3131.5200.5159.9276.1265.4233.3334.5246.5155.0285.1m/z293310.9OOOHOHOOHOHOHOHNegativeIonESIDataDependantMS/MSSpectraUnknown1Δ+14um/z179第20頁/共100頁21300350400450500550600m/z58010203040501000102030405060708090RelativeAbundance473.1493.7460.8386.5300.2487.1400.3RT:9.21-9.61AV:8NL:1.28E6RT:11.78-11.94AV:4NL:7.42E5(M-H)(M-H)ProposedEchinacosideStructureatm/z487增加一個(gè)亞甲基第21頁/共100頁22RT:0.11-21.822468101214161820Time(min)05101520253035404550556065707580859095100RelativeAbundance9.494.814.5817.8811.896.7211.3919.0819.553.1617.0114.3913.692.1415.408.1010.876.257.975.093.5421.421.07ProposedEchinacosidesConfirmedEchinacosideOn-The-FlyAnalysis!第22頁/共100頁23大腦促眠素的發(fā)現(xiàn)與確證從貓腦袋中取出腦髓液，用液相色譜分離各組分，用電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜、氣質(zhì)聯(lián)用、薄層層析、紅外及核磁確定各組分的化學(xué)結(jié)構(gòu)，目的是找出與睡眠規(guī)律有關(guān)的物質(zhì)。在貓睡眠周期的不同時(shí)間點(diǎn)采取腦髓液樣品，測(cè)定各樣品的紫外吸收光譜，發(fā)現(xiàn)貓?jiān)谔幱诩磳⑷胨癄顟B(tài)時(shí)，腦髓液試樣有一個(gè)特別顯著的紫外吸收峰。電噴霧四極桿串聯(lián)質(zhì)譜分析各樣品的色譜峰中有顯著差異的組分，發(fā)現(xiàn)m/z282的離子。并證明是MH+離子，用快原子轟擊磁質(zhì)譜測(cè)得其分子式為C18H35NO。CID實(shí)驗(yàn)：m/z282的MS2和MS3。在低質(zhì)量范圍，m/z282的子離子譜顯示長(zhǎng)鏈烷烴的特征。質(zhì)量數(shù)為17和35的中性丟失是母離子m/z282電離產(chǎn)生子離子m/z265，m/z247時(shí)產(chǎn)生的。在以上質(zhì)譜分析的基礎(chǔ)上，綜合其它分析手段的表征結(jié)果，初步推測(cè)出這種催眠素的結(jié)構(gòu)為順-9,10-十八碳烯酰胺。該化合物的合成和結(jié)構(gòu)表征證實(shí)這一結(jié)構(gòu)推測(cè)是正確的。第23頁/共100頁24大腦促眠素的MS/MS質(zhì)譜確定大腦促眠素的化學(xué)結(jié)構(gòu)腦髓液中分離出的促眠素化學(xué)結(jié)構(gòu)第24頁/共100頁25結(jié)構(gòu)分析：確定代謝途徑，微量條件下進(jìn)行。定量分析：確定生物利用度等，在復(fù)雜本底的條件下測(cè)定。

OCH3NHClOSNHNHOOOH+OH?parent例：一種非胰島素依賴型糖尿病藥物的代謝分析(Noninsulindependentdiabetesdrug)

代謝物是有效的還是有害的?二、藥物代謝分析LC/MS/MS技術(shù)第25頁/共100頁2624681012141618202224Time(min)050100RelativeAbundance23.878.7210.6511.8913.0116.79Glyburide代謝物10xOn-lineLC-MSn第26頁/共100頁27100150200250300350400450500550m/z0102030405060708090100RelativeAbundance510512222199279241123391532176399369FullscanMSSpectrumofpeakat8.72minOn-lineData-DependantLC-MSnTriggerMass第27頁/共100頁28150200250300350400450500m/z0102030405060708090100RelativeAbundance369371395352492m/z510>MS2On-lineData-DependantLC-MS2第28頁/共100頁29100120140160180200220240260280300320340360m/z0102030405060708090100RelativeAbundance169171304306288m/z510>m/z369>MS3On-lineData-DependantLC-MS3第29頁/共100頁30m/z369OCH3NHClOSNH2OOH+m/z395OCH3NHClOSNHOOO+m/z352OCH3NHClOSOO+m/z304OCH3NHClONH2+m/z288OCH3NHClO+m/z169OOCH3Cl+m/z510OCH3NHClOSNHNHOOOH+OHm/z492+OCH3NHClOSNHNHOOOHMS1MS2MS3FragmentationScheme第30頁/共100頁31三、遠(yuǎn)電荷碎裂反應(yīng)(Charge-RemoteFragmentation)

遠(yuǎn)電荷碎裂：斷裂發(fā)生在遠(yuǎn)離電荷的位置，與質(zhì)譜解析一章中裂解均與電荷或自由基有關(guān)不同。主要原因是這種遠(yuǎn)電荷碎裂反應(yīng)發(fā)生在具有較長(zhǎng)的碳鏈化合物中，如長(zhǎng)鏈脂肪酸、膽汁酸、類固醇等。遠(yuǎn)電荷碎裂反應(yīng)在蛋白質(zhì)分析中有時(shí)也會(huì)發(fā)生。研究方法：高能、中能、低能碰撞誘導(dǎo)解離MS/MS質(zhì)譜。

高能碰撞：2~10kV，磁質(zhì)譜儀上，TOF/TOF等。低能碰撞:100V以內(nèi)，四極桿質(zhì)譜儀，離子阱質(zhì)譜儀。中能碰撞：100~1000V，扇形電場(chǎng)磁場(chǎng)/TOF聯(lián)用質(zhì)譜(特制質(zhì)譜)。第31頁/共100頁321、遠(yuǎn)電荷碎裂的主要反應(yīng)機(jī)理長(zhǎng)鏈飽和化合物1,4氫消除反應(yīng)(1)兩步均裂反應(yīng)(2)產(chǎn)生荷基異位離子末端不飽和離子

長(zhǎng)鏈不飽和化合物(a)近烯丙基鍵，記作"Ap斷裂，Proximalallylbond。遠(yuǎn)烯丙基-乙烯基鍵distalallyl–vinylbond,"Avd近烯丙基-乙烯基鍵，記作Avp斷裂，proximalallyl–vinylbond。X=O+

或OLi2+。第32頁/共100頁3313-羰基-十八烷酸，12-羰基-十八烷酸的遠(yuǎn)電荷碎裂譜圖第33頁/共100頁34十八烷酸CID-MIKES譜圖，[M-Ht2Li]+

(A)4,7-二烯十八烷酸,m/z293(B)6,9-二烯十八烷酸m/z293高能碰撞,6kV給出較多的信息，常用的遠(yuǎn)電荷碎裂的方法。第34頁/共100頁35長(zhǎng)鏈脂肪酸[M-H]+離子的ES-MS/MS譜圖(a)硬脂酸，m/z283;(b)油酸,m/z281;(c)亞油酸,m/z279.譜圖采自于AutoSpec-OATOF儀器。碰撞能量400eV，Xe用作碰撞氣體。中能碰撞，400eV特殊設(shè)計(jì)的儀器上實(shí)現(xiàn)，有較多的信息。第35頁/共100頁36低能CID譜，[M-Ht2Li]+，(4,7,10,13,16,19)-六烯二十二烷酸(docosahexaenoicacid,m/z341)。低能碰撞，400eV信息較少，特殊情況使用。第36頁/共100頁37§5.3糖類的質(zhì)譜分析糖：生命體的能源供給者，傳統(tǒng)的認(rèn)識(shí)。糖的生物活性：與蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、磷酸脂結(jié)合成“糖復(fù)合物”(glycoconjugate)，血漿、酶、激素及細(xì)胞外膜均有含糖蛋白。糖復(fù)合物參與細(xì)胞的識(shí)別、增生、分異；維持生物體的免疫系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和新陳代謝平衡。寡糖和多糖具有增強(qiáng)免疫力，抗輻射、抗腫瘤活性，成為藥物，中藥應(yīng)用，生物多糖，保健藥物，保健品。糖結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性：?jiǎn)翁堑慕M成為CnH2nOn(n=3~9)，其中n=5和6最為常見。每個(gè)單糖有多個(gè)手性碳原子。有鏈?zhǔn)浇Y(jié)構(gòu)和環(huán)式結(jié)構(gòu)。寡糖和多糖的糖鏈?zhǔn)怯珊嘣u基的環(huán)狀己糖或戊糖通過苷鍵連接而成。各羥基環(huán)上有順反異構(gòu)體，各單糖分子上有五個(gè)手性碳，連接的位置和構(gòu)型多種多樣。第37頁/共100頁38糖類分析的困難性：強(qiáng)極性，分離難，HPLC峰形不好。連接方式復(fù)雜，立體化學(xué)復(fù)雜。同系物多，糖苷鍵弱，復(fù)雜混合體系。電離效率不高、種類有限。16種單糖的常見結(jié)構(gòu)一、單糖及多糖的結(jié)構(gòu)1,核糖-D-呋喃核糖Rib2,阿戊糖-L-吡喃阿戊糖Ara3,戊醛糖-D-呋喃戊醛糖Xyl4,葡萄糖-D-吡喃葡萄糖Glc5,甘露糖-D-吡喃甘露糖Man6,半乳糖-D-吡喃半乳糖Gal7,海藻糖L-吡喃海藻糖Fuc8,乙酰氨基葡萄糖N-乙?；?(-D-吡喃葡萄糖酰胺)GlcNAc第38頁/共100頁399,葡萄糖醛酸GlcA10,鼠李糖L-吡喃鼠李糖Rha11,乙酰神經(jīng)氨糖酸NeuNAc12,胞壁酸2-氨基-3-氧-(1-羧乙基)-2-脫氧--D-葡萄糖Mur14,雞納糖6-脫氧--D-葡萄糖15,泰威糖Tyv16,D-果糖Fru一個(gè)典型的雙觸角氮連接多糖的結(jié)構(gòu)特征

觸角

核心區(qū)第39頁/共100頁40二、質(zhì)譜分析電離方式：FAB：傳統(tǒng)的電離方法，主要集中于低聚寡糖的分析。ESI：對(duì)于常規(guī)的ESI，天然多糖的電離不如肽和蛋白，納升噴霧可以改善電離效率，可以達(dá)到與肽和蛋白相當(dāng)?shù)某潭?。寡糖的親水性限制了ESI霧滴的表面活性，靈敏度低。納噴霧霧滴小，可以突破親水性的限制，靈敏度顯著升高。多糖的衍生化，減小親水性，可提高靈敏度，導(dǎo)致靈敏度提高的是表面活性的增加，而不是樣品的揮發(fā)性。MALDI：低聚物糖的電離效率基本與分子量無關(guān)。由于糖的不穩(wěn)定性，MALDI電離時(shí)會(huì)產(chǎn)生某些分解，尤其會(huì)產(chǎn)生亞穩(wěn)離子分解，可以用源后解離(PSD)技術(shù)測(cè)定亞穩(wěn)離子，但會(huì)使譜圖變得復(fù)雜。多糖碎片代號(hào)表示法非還原端用A,B,C表示。還原端用X,Y,Z表示。左上角標(biāo)表示，環(huán)中兩根斷裂鍵所連碳原子的編號(hào)(從環(huán)上氧原子開始計(jì)數(shù)，紅色數(shù)字)，右下角的數(shù)字表示殘基的序號(hào)。第40頁/共100頁41第41頁/共100頁42第42頁/共100頁43第43頁/共100頁44HumanGenomeProject§5.4核苷酸(Oligonucleotide)的質(zhì)譜分析UnderstandingTheGenomeToFightTheDiseaseY2KDrugDesign第44頁/共100頁45500600700800900100011001200m/z05101520253035404550556065707580859095100RelativeAbundance919.1915.41098.61102.9787.81107.3922.5784.5686.1790.6817.11147.9689.1851.6691.7956.7609.91070.71064.7905.3768.7617.31153.71061.7720.3959.3664.8901.71174.31040.0590.0549.1522.1NegativeIonESIOf18mer(200fg/uL)進(jìn)樣速度：3uL/min

乙腈-甲醇-丙酮(70:20:10,v/v/v,5%TEA)

毛細(xì)管溫度:100°COLIGO22#209-213RT:1.96-1.99AV:5NL:1.49E5T:-pFullms[450.00-1200.00]第45頁/共100頁46OLIGO22#217-225RT:2.03-2.09AV:8NL:1.63E5T:-pFullms[450.00-1200.00]650700750800850900950100010501100m/z0102030405060708090100RelativeAbundance1102.91098.6918.8915.4787.5784.5689.3686.4611.2-5-6-7-8NegativeIonChargeStatesof18mer第46頁/共100頁47#1RT:0.00P:-NL:3.85E5T:-pFullms[450.00-1200.00]48005000520054005600580060006200mass0102030405060708090100RelativeAbundance5520.05498.05541.05565.05745.04788.05972.05579.05385.05017.05221.04908.05116.06086.05762.06206.04821.0GATTCGTAGCTACGAATCReportedAvg.Mol.Wt:5500MonoisotopicMass:5497.7NegativeIonDeconvolutedSpectra第47頁/共100頁48NegativeIonMS2Spectraofthe-5and-7ChargeStatesOLIGO22#435-444RT:4.86-4.98AV:10NL:1.29E5T:-cFullms21098.00@35.00[305.00-2000.00]400600800100012001400160018002000m/z020406080100RelativeAbundance926.81071.51134.41068.51236.0817.91290.81167.9782.6610.11009.91347.11636.1850.3617.71388.0770.21480.01637.0481.21854.3506.1426.11997.7OLIGO22#495-507RT:5.62-5.79AV:13NL:2.65E5T:-cFullms2784.00@35.00[215.00-2000.00]400600800100012001400160018002000m/z020406080100RelativeAbundance765.3886.7875.8617.8923.21134.3610.3860.1673.61014.81135.1461.51347.1549.31636.11235.1426.21413.11485.3306.31782.01880.2GATTCGTAGCTACGAATCGATTCGTAGCTACGAATC第48頁/共100頁49§5.5蛋白質(zhì)分析一、氨基酸和小肽小肽斷裂碎片離子定義第49頁/共100頁50研究小肽的結(jié)構(gòu)：MS/MS分析例：一個(gè)五肽的分析具有保護(hù)基的五肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)：

BOC－Gly－Ala－D－Val－Leu－Ile－OBzBOC=t-Butyloxycarbony,Bzl=benzyl.離子類型MH+[MH-56]+[MH-100]+y4"y3"y2"y1"b4b3b2b1m/z662606562505434335222441328229158yn"=yn第50頁/共100頁51各離子的生成途徑[MH-56]+McLafferty重排[MH-100]+第51頁/共100頁52bn系列離子yn"系列離子,yn"=yn+2第52頁/共100頁53bn和yn"系列離子生成的另一種機(jī)理第53頁/共100頁54氨基酸名稱單同位素相對(duì)分子量羥胺正離子質(zhì)量氨基酸名稱單同位素相對(duì)分子量羥胺正離子質(zhì)量甘氨酸(glycine,Gly/G)57.0214630天冬氨酸(asparticacid,Asp/D)115.0269487丙氨酸(alanine,Ala/A)71.0371144谷氨酰胺(glutamine,Gln/Q)128.05858101絲氨酸(serine,Ser/S)87.0320360賴氨酸(lysine,Lys/K)128.09496101脯氨酸(proline,Pro/P)97.0527670谷氨酸(glutamicacid,Glu/E)129.04259102纈氨酸(valine,Val/V)99.0684172甲硫氨酸(methionine,Met/M)131.04049104蘇氨酸(threonine,Thr/T)101.0476874組氨酸(histidine,His/H)137.05891110半胱氨酸(cysteine,Cys/C)103.0091976苯丙氨酸(phenylalanine,Phe/F)147.06841120異亮氨酸(isoleucine,Ile/I)113.0840686精氨酸(arginine,Arg/R)156.10111129亮氨酸(leucine,Leu/L)113.0840686酪氨酸(tyrosine,Tyr/Y)163.06333136天冬酰氨(asparagine,Asn/N)114.0429388色氨酸(tryptophan,Trp/W)186.0793115920種氨基酸殘基（NH-HCR-C=O）和羥胺正離子的質(zhì)量第54頁/共100頁55500600700800900100011001200130014001500160017001800m/z0100%998.2942.7893.2848.6808.3616.2771.5738.0617.21060.5999.61131.11061.81211.81132.51137.51305.01413.71541.91696.3160001700018000m/z0100%16951.4去卷積deconvolution20fmole馬心肌紅蛋白(HorseHeartMyoglobin)ESI質(zhì)譜圖二、蛋白質(zhì)分析第55頁/共100頁56原始數(shù)據(jù)去卷積混合物：主要兩種betalactuglobulin第56頁/共100頁57人血紅蛋白MALDI-TOF質(zhì)譜圖第57頁/共100頁58雞蛋溶菌酶ESI質(zhì)譜圖第58頁/共100頁59m/z1=895m/z2=945肌紅蛋白ESI質(zhì)譜圖第59頁/共100頁60§5.6蛋白質(zhì)組學(xué)及應(yīng)用什么是蛋白質(zhì)組？由基因組，細(xì)胞或組織所表達(dá)的所有蛋白質(zhì)成分。

蛋白質(zhì)組的重要性

研究基因組功能的重要途徑。

藥物目標(biāo)-在分子水平研究健康和疾病的相關(guān)。蛋白質(zhì)組學(xué)是一門在整體水平上研究細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)組成及其活動(dòng)規(guī)律的新興學(xué)科。蛋白質(zhì)組學(xué)的終極目標(biāo)是測(cè)定生物物種的所有生命活動(dòng)中的所有蛋白質(zhì)。Why蛋白質(zhì)組學(xué)?mRNA表達(dá)水平不能預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)水平

蛋白質(zhì)的修飾和加工不能從基因序列直接推導(dǎo)蛋白質(zhì)組是動(dòng)態(tài)的并反映生物系統(tǒng)的狀態(tài)第60頁/共100頁61蛋白質(zhì)組學(xué)面臨的挑戰(zhàn)?蛋白質(zhì)沒有可進(jìn)行量的放大方法(如DNR的PCR方法)。?在生物處理過程中蛋白質(zhì)是高度動(dòng)態(tài)變化的。?物理化學(xué)性質(zhì)的多樣性。?動(dòng)態(tài)范圍的挑戰(zhàn)：相對(duì)含量超過106范圍(血清中可達(dá)1012)質(zhì)譜測(cè)量在蛋白質(zhì)組學(xué)中的作用?質(zhì)譜是肽(不是蛋白質(zhì))的一級(jí)序列分析的最普遍和最有效的工具。?質(zhì)譜是一種精確的定量工具，尤其是內(nèi)標(biāo)法定量(如對(duì)同位素比的測(cè)量)。?質(zhì)譜在確定蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí)不是很有效。?質(zhì)譜對(duì)已知肽和蛋白質(zhì)重復(fù)定量分析不是很有效。第61頁/共100頁62經(jīng)典的氨基酸序列分析方法N–端氨基酸單元的分析最常用的有下列兩種方法：桑格爾(SangerF)方法：利用肽鏈N–端游離氨基與2,4–二硝基氟苯(DNP)發(fā)生芳香親核取代反應(yīng)，而將肽鏈上的氨基酸逐個(gè)分解。埃德曼(Edman)方法：用異硫氰酸苯酯(PITC)和N–端的游離氨基反應(yīng)，將肽鏈上的氨基酸逐個(gè)分解。

C–端氨基酸單元的分析：通過羧肽酶催化水解用特定的酶催化使含某種氨基酸的肽鍵部位水解經(jīng)典分析方法的缺點(diǎn)工作量大、測(cè)序速度慢、樣品用量大。第62頁/共100頁63蛋白質(zhì)的二維分離第63頁/共100頁64

儀器 鑒定率肽質(zhì)量指紋譜 MALDI ~50%

(PeptideMassFingerprinter,PMF)多肽序列標(biāo)簽 LC/MS/MS ~80%

(PeptideSequenceTag,PST)從新測(cè)序

LC/MS/MS >

80%

(DeNovo)蛋白質(zhì)及混合物的定量分析：同位素編碼親和標(biāo)記(Isotope-CodedAffinityTags,ICAT)蛋白質(zhì)序列研究的三個(gè)層次第64頁/共100頁65蛋白質(zhì)組研究技術(shù)路線樣品(組織、細(xì)胞等)凝膠圖象分析蛋白質(zhì)鑒定二維數(shù)據(jù)庫(kù)酶解HPLC-MS、MS/MS數(shù)據(jù)庫(kù)檢索二維凝膠電泳酶解肽混合物MS、MS/MS肽指紋譜肽序列標(biāo)簽從新測(cè)序第65頁/共100頁66

一、肽質(zhì)量指紋譜(PeptideMassFingerprinter,PMF)PMF測(cè)定速度快。PMF靈敏。

PMF需要完整和準(zhǔn)確的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)。第66頁/共100頁67分離的酶解的蛋白質(zhì)96/384位樣品靶數(shù)據(jù)處理和數(shù)據(jù)庫(kù)檢索質(zhì)譜樣品的準(zhǔn)備MALDI質(zhì)譜分析蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)果PMF方法的一般流程第67頁/共100頁68

洗膠/去污

脫水

減少S-S鍵

洗滌/脫水1、In-gel酶切/消化Multiprobe(4x96WellPlat)

樣品體積0.5-100L

板上加熱和冷卻消化板加熱37oC

肽存儲(chǔ)在-4oC冷卻板

酶試劑存儲(chǔ)在-4oC冷卻板

修正-SH基

加入trypsin溶液5-12小時(shí)

肽提取2、質(zhì)譜分析樣品的制備

靈敏度：500fmolesBSAin-gel。

移液和消化時(shí)間8小時(shí)(1x96wellplat)。

最多可進(jìn)行4x96wellplat的同時(shí)消化?；灸芰Φ?8頁/共100頁693、質(zhì)譜測(cè)定設(shè)這檢索的條件，不同軟件有不同的參數(shù)和用法。MALDI-TOF質(zhì)譜測(cè)定4、數(shù)據(jù)庫(kù)檢索parmeters參數(shù)的選擇樣品-1樣品-2樣品-3ProgramusedMS-FitPeptIdentPeptIdentpIrangeNO3~73.7~7.7Proteinmassrange20~50kD15~45kD15~45kDSpeciesearchedMAMMALSMAMMALSMAMMALSDigestusedTrypsinTrypsinTrypsinPeptidemassaccuracy±2Da±0.5Da±0.5DaMethioniceisOxidizedOxidizedOxidizedCysteineisCarbamidomethylation(Cys-CAM)PepptidemassesareAverageMonoisotopicMonoisotopicMumberofpeptides555Numberofmissedcleavages111Numberofpeptideusedinsearch111715第69頁/共100頁70樣品1樣品2樣品3數(shù)據(jù)庫(kù)檢索結(jié)果：帶*號(hào)的峰為與數(shù)據(jù)庫(kù)中的峰相匹配的峰。樣品1：甘油醛-3-磷酸脫氫酶樣品2：遍在蛋白羧酸基末端水解同工酶樣品3：丙糖磷酸異構(gòu)酶第70頁/共100頁71PMF實(shí)驗(yàn)，同一點(diǎn)上經(jīng)常是蛋白質(zhì)的混合物SomeproteinsareidentifiedwithhighconfidenceSomeproteinsareidentifiedwithhighconfidenceSomeproteinsareidentifiedwithlowconfidenceRowdata第71頁/共100頁72AndtherearestillpeptidesunassignedtoaproteinFinalresult第72頁/共100頁73特有的搜索引擎第73頁/共100頁74二、多肽序列標(biāo)簽(PeptideSequenceTag,PST)和肽階梯序列(PeptideLadderSequencing)1、肽序列標(biāo)簽蛋白質(zhì)的常見氨基酸有20種，一般3個(gè)氨基酸的肽段碎片將有8000種可能的排列方式4個(gè)氨基酸將有160000種排列方式，因此即使對(duì)于不是很大的原核生物的蛋白質(zhì)組來說，一個(gè)短的序列片段也具有很高的特異性。肽序列標(biāo)簽：一個(gè)多肽的部分氨基酸序列和該肽的質(zhì)量以及該肽未測(cè)序部分的質(zhì)量。MannM.etal,Anal.Chem.,1994,66,4390forPSTMannM.etal,TrandsinBiochem.Sci.,1996,21,494.第74頁/共100頁75

例：馬心肌紅蛋白鑒定

馬心肌紅蛋白胰酶酶切產(chǎn)物的ESI-Q-TOF肽指紋譜第75頁/共100頁76馬心肌紅蛋白胰酶酶切肽段m/z908.4(雙電荷離子)的MS/MS譜圖肽序列標(biāo)簽：G—L—S—D—G—E—W—Q—Q—V—L—N—V—W—G—Ky10,1257.8y3,390.3C端N端W—Q—Q—V—L—N—V—WY3,390.3y10,1257.8檢索結(jié)果：第76頁/共100頁77N端Y—A—M—I—G—D—P—T—G—A—L—RC端y10,1000.5y7,715.4

例：m/z為691.43Da(M2+)，質(zhì)量數(shù)為1380.6Da。

MS/MS圖肽序列標(biāo)簽：檢索結(jié)果：來自乙醇脫氫酶715.4(DGI)1000.5第77頁/共100頁782、肽階梯序列(PeptideLadderSequencing)梯狀測(cè)序法(laddersequencing)：用化學(xué)探針或酶解使蛋白或肽從N端或C端逐一降解下氨基酸殘基，相互間差一個(gè)氨基酸殘基的系列肽，經(jīng)質(zhì)譜檢測(cè)，由相鄰峰的質(zhì)量差知道相應(yīng)氨基酸殘基，與Edman法相似。AA1-AA2-AA3-AA4-AA5--AAnPTC-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5--AanPC-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5--AAnPITC+5%PICATZ(AA1)+AA2-AA3-AA4-AA5--AAn

PC-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5--AAnAcid(TFA)

aftermcyclesFurthercycles(withoutseparation)PC-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5--AAnPC-AA2-AA3-AA4-AA5--AAn

PC-AA3-AA4-AA5--AAnPC-AA4-AA5--AAn

PC-AAm--AAn一步MALDI-MS階梯序列數(shù)據(jù)B.Chaitetal.,Science

262,89,1993.原理：第78頁/共100頁79血纖維蛋白肽:ProteinladderSequencing[Glu1]fibrinopeptideB第79頁/共100頁80傳統(tǒng)的低能量CADMS/MS質(zhì)譜圖第80頁/共100頁81MALDIPSD與高能CID的比較第81頁/共100頁82可選擇性的碎裂方式：光誘導(dǎo)解離(UV-193nm)

相當(dāng)于高能CID。多光子電離(IR-10.6μm)

相當(dāng)于低能CAD。表面解離(SID)相當(dāng)于低能CAD。電子捕獲解離(ECD)c和z類型碎片增強(qiáng)。注：這些方法在自動(dòng)化大批量實(shí)驗(yàn)中并不是常規(guī)的方法。

數(shù)據(jù)庫(kù)搜索為什么會(huì)失敗蛋白質(zhì)不在數(shù)據(jù)庫(kù)里或者不正確的搜索參數(shù)(酶特征，分類法等等)。在數(shù)據(jù)庫(kù)里蛋白質(zhì)表達(dá)不正確(DNA核苷酸序列，基因內(nèi)區(qū)序列等等預(yù)測(cè)失敗)。蛋白質(zhì)變性.-變性的氨基酸殘基-N端和C端的變化：蛋氨酸的形成，序列信號(hào)變化，C鏈縮短-可變的序列(同族以及選擇性結(jié)合的變體)-后修飾變化(糖基化，磷酸化等)-不希望的化學(xué)誘導(dǎo)修飾(在尿素中氨甲?；?搜索引擎不夠完善成熟。第82頁/共100頁83三、重新測(cè)序(Denovosequence)數(shù)據(jù)庫(kù)中沒有的蛋白質(zhì)分析樣品來源于非序列化基因組蛋白質(zhì)經(jīng)多重高度修飾在實(shí)際生物體中，非同尋常的酶活性處理古生物樣本，樣品處理時(shí)肽被修飾(污染)合成肽重新測(cè)序的原因

譜圖的預(yù)處理多電荷峰轉(zhuǎn)化成單電荷峰多同位素峰轉(zhuǎn)化成擔(dān)同位素峰簡(jiǎn)化譜圖提高信噪比第83頁/共100頁84譜圖處理譜圖分析第84頁/共100頁85

16O/18OC端標(biāo)記為了提高對(duì)串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)的解讀能力，尤其是對(duì)y和b型離子系列的辨別能力，用化學(xué)修飾方法使辨別更容易。

16O/18OC端標(biāo)記：在蛋白質(zhì)酶解時(shí)，酶解液中H218O和H216O各占50%，酶解后肽段羧基端上的羥基氧18O/16O的(M+2/M)同位素豐度比高于正常的峰強(qiáng)度，據(jù)此可以分辨出y系列離子。給出C-端離子的唯一特征碎片離子第85頁/共100頁86denovo序列解釋馬爾可夫鏈蒙特卡洛(MarkovchainMonteCarlo)denovo

序列產(chǎn)生算法貝葉斯規(guī)則(Bayesian)斷裂方式和譜圖匹配算法Beta牛乳糖m/z841.5的MS/MS譜第86頁/共100頁87m/z841.5MS/MS譜的測(cè)序結(jié)果第87頁/共100頁88同位素親和端:

ICAT試劑，重氫和正常氫的樣品。