第四章動(dòng)物細(xì)胞工程制藥

第四節(jié)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物

一、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的產(chǎn)生和發(fā)展轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(transgenicanimal）:通過基因工程技術(shù)將外源DNA導(dǎo)入動(dòng)物生殖細(xì)胞，干細(xì)胞，早期胚胎，并在受體動(dòng)物染色體上穩(wěn)定整合，并能夠穩(wěn)定傳給子代的技術(shù)，稱為轉(zhuǎn)基因技術(shù)。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)所獲得的動(dòng)物稱轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。目前一頁\總數(shù)七十四頁\編于十七點(diǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物20世紀(jì)70年代中期，基因重組技術(shù)與細(xì)胞工程技術(shù)結(jié)合，產(chǎn)生了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和轉(zhuǎn)基因植物。1974年,HJaenisch和MinZe首次報(bào)道向小鼠囊胚注射SV40DNA后，生產(chǎn)的小鼠部分組織中檢測到了SV40rDNA序列。1980年,Gordon等人通過向小鼠的單細(xì)胞胚胎原核注射純化的DNA---人胸苷激酶基因，獲得轉(zhuǎn)基因小鼠。這是一只得真正意義的第一只轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。目前二頁\總數(shù)七十四頁\編于十七點(diǎn)轉(zhuǎn)基因碩鼠1982年P(guān)almiter等人將大鼠的生長激素基因?qū)胄∈笫芫训男墼酥?獲得比普通小鼠生長速度快2~4倍，震驚了世界。轉(zhuǎn)基因“碩鼠”（右）目前三頁\總數(shù)七十四頁\編于十七點(diǎn)生物反應(yīng)器研發(fā)在此后幾年中，以改進(jìn)經(jīng)濟(jì)性狀為目的的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究成為熱點(diǎn)課題。但除轉(zhuǎn)基因魚外，多數(shù)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物并沒有達(dá)到預(yù)想的要求。目前四頁\總數(shù)七十四頁\編于十七點(diǎn)Gordon于1987年獲得了分泌組織纖溶酶原激活因子tPA的轉(zhuǎn)基因小鼠。以后的數(shù)年內(nèi)，轉(zhuǎn)基因羊、豬、牛的乳腺生物反應(yīng)器便相繼問世，利用此生產(chǎn)出了多種生物藥物：凝血因子Ⅸ、凝血因子XIII、抗胰蛋白酶、tPA、紅細(xì)胞生成素（EPO）等。動(dòng)物克隆技術(shù)、干細(xì)胞技術(shù)等與轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)相結(jié)合，加快了動(dòng)物生物反應(yīng)器的研究與應(yīng)用進(jìn)程。目前五頁\總數(shù)七十四頁\編于十七點(diǎn)乳汁中分泌人凝血因子IX的轉(zhuǎn)基因山羊美國轉(zhuǎn)基因豬，其體內(nèi)含有人類的基因，乳汁含有人體蛋白fatorⅧ。只需300～600只這樣的母豬就能滿足全世界對(duì)這種蛋白的需求。目前六頁\總數(shù)七十四頁\編于十七點(diǎn)美國麻省生物技術(shù)公司（GTC，Biotherapeutics）利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)開發(fā)、生產(chǎn)和商業(yè)化治療用蛋白質(zhì)。ATryn是GTC生物治療公司開發(fā)的一種人抗凝血酶重組蛋白，它是第一個(gè)在世界上得到認(rèn)可的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)的蛋白。2006年6月宣布，美國GTC公司用轉(zhuǎn)基因山羊生產(chǎn)的人抗凝血酶“ATryn”（α-antithrombin）獲得歐洲藥品評(píng)價(jià)局（EMEA）人用藥品委員會(huì)（CHMP）的批準(zhǔn)推薦。2009年2月，F(xiàn)DA首次批準(zhǔn)由轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)藥物-人抗凝血酶“ATryn”上市。

目前七頁\總數(shù)七十四頁\編于十七點(diǎn)二、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)的原理和方法（一）基本原理體外構(gòu)建的重組DNA分子通過顯微注射，病毒載體轉(zhuǎn)移，胚胎干細(xì)胞轉(zhuǎn)染等方法注入動(dòng)物的受精卵或床前的胚胎細(xì)胞，然后將此受精卵或胚胎細(xì)胞植入子宮，使其發(fā)育成攜帶外源基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物目前八頁\總數(shù)七十四頁\編于十七點(diǎn)目前九頁\總數(shù)七十四頁\編于十七點(diǎn)外源目的基因的制備外源目的基因有效導(dǎo)入生殖細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞選擇獲得攜有目的基因的細(xì)胞選擇合適的體外培養(yǎng)系統(tǒng)和宿主動(dòng)物轉(zhuǎn)基因細(xì)胞胚胎發(fā)育及鑒定篩選所得的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物品系目前十頁\總數(shù)七十四頁\編于十七點(diǎn)（二）外源目的基因轉(zhuǎn)入動(dòng)物的早期胚胎方法1.顯微注射法在光學(xué)顯微鏡下，利用顯微操作儀，直接把DNA注射到動(dòng)物早期胚胎、胚胎干細(xì)胞、體細(xì)胞或卵母細(xì)胞中，然后生產(chǎn)動(dòng)物個(gè)體的技術(shù)。目前十一頁\總數(shù)七十四頁\編于十七點(diǎn)microinjection經(jīng)過顯微注射DNA發(fā)育而成的動(dòng)物中，有少數(shù)整合了被注射的DNA分子，成為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。目前是創(chuàng)造轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的最有效，最成功的途徑目前十二頁\總數(shù)七十四頁\編于十七點(diǎn)基質(zhì)附著序列目前十三頁\總數(shù)七十四頁\編于十七點(diǎn)目前十四頁\總數(shù)七十四頁\編于十七點(diǎn)通過注射妊娠血清和人絨毛膜促進(jìn)腺激素的激素療法使小鼠超數(shù)排卵35個(gè)（一般情況下排卵5-10個(gè)）交配后，從輸卵管內(nèi)取出受精卵；轉(zhuǎn)基因樣品注射入受精卵中變大的雄性原核內(nèi)將25-40個(gè)注射了轉(zhuǎn)基因的受精卵移植入代孕小鼠體內(nèi)；受精卵發(fā)育成胚胎，并繁殖成轉(zhuǎn)基因小鼠子代；從小鼠子代體內(nèi)取出DNA樣品，進(jìn)行雜交，鑒定轉(zhuǎn)基因的整合與否及位子代小鼠間進(jìn)行再交配，繁殖，觀察轉(zhuǎn)基因是否遺傳及表達(dá)。

DNA顯微注射法的基本程序目前十五頁\總數(shù)七十四頁\編于十七點(diǎn)目前十六頁\總數(shù)七十四頁\編于十七點(diǎn)目前十七頁\總數(shù)七十四頁\編于十七點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：轉(zhuǎn)基因范圍廣轉(zhuǎn)移基因大，可達(dá)數(shù)百kb；且轉(zhuǎn)基因不含任何病毒基因組片段，絕對(duì)安全。非嵌合體已成功制備轉(zhuǎn)基因的鼠，兔，羊，豬缺點(diǎn)：整合機(jī)制不明確，無規(guī)律隨機(jī)整合，多拷貝整合導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因不表達(dá)整合位點(diǎn)隨機(jī)會(huì)造成轉(zhuǎn)動(dòng)物基因組的重排、突變、易位缺失等需顯微操作儀，技術(shù)性要求強(qiáng)。

成功率低目前十八頁\總數(shù)七十四頁\編于十七點(diǎn)2.反轉(zhuǎn)錄病毒感染法將目的基因重組到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體上，制成高滴度病毒顆粒，人為感染著床前或著床后的胚胎，（也可直接將胚胎與能釋放逆轉(zhuǎn)錄病毒的單層培養(yǎng)細(xì)胞共同培養(yǎng)以達(dá)到感染目的）獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法．在培育轉(zhuǎn)基因禽類研究中有廣泛應(yīng)用，是目前制備轉(zhuǎn)基因雞最有效和最成功的方法，主要集中在雞的良種培育及抗病毒感染研究方面。

目前十九頁\總數(shù)七十四頁\編于十七點(diǎn)目前二十頁\總數(shù)七十四頁\編于十七點(diǎn)如果在第一次卵裂之前外源DNA整合到胚胎基因組中，可獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在第一次卵裂之后整合，會(huì)產(chǎn)生嵌合體，其第二代可能出現(xiàn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。

目前二十一頁\總數(shù)七十四頁\編于十七點(diǎn)（1）反轉(zhuǎn)錄病毒基因反式作用序列順式作用序列目前二十二頁\總數(shù)七十四頁\編于十七點(diǎn)（2）反轉(zhuǎn)錄病毒感染法的載體的構(gòu)建復(fù)制型缺陷重組病毒載體的構(gòu)建：只能產(chǎn)生病毒RNA不編碼結(jié)構(gòu)蛋白提取病毒未整合的環(huán)狀形式DNA；將環(huán)狀DNA克隆到適當(dāng)?shù)妮d體中；選擇適當(dāng)?shù)拿笇⒉《窘Y(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)切除；將外源目的基因克隆到載體中目前二十三頁\總數(shù)七十四頁\編于十七點(diǎn)（3）包裝細(xì)胞

在受體細(xì)胞中的重組病毒由于沒有包裝信號(hào)，能生產(chǎn)病病毒RNA和所有蛋白質(zhì)，但不能包裝成病毒顆粒；病毒包裝細(xì)胞：染色體整合除序列的整個(gè)病毒基因組，為重組蛋白載體轉(zhuǎn)錄的RNA提供包裝蛋白病毒載體轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞后，載體上的包裝信號(hào)將使包裝蛋白把載體包裝成為侵染生的病毒顆粒。目前二十四頁\總數(shù)七十四頁\編于十七點(diǎn)（4）通過物理方法將重組DNA分子轉(zhuǎn)入包裝細(xì)胞利用反轉(zhuǎn)錄病毒DNA的LTR區(qū)域具有轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子的特點(diǎn)，外源基因隨病毒RNA轉(zhuǎn)錄，并在載體上序列的作用下，重組病毒轉(zhuǎn)錄的RNA和包裝細(xì)胞提供的包裝蛋白就可以組裝成有感染性的病毒顆粒病毒收獲后感染早期胚胎或直接感染受精卵?；驑?gòu)建好的DNA注射入囊胚腔中和重組病毒及輔助病毒共培養(yǎng)進(jìn)行轉(zhuǎn)染目前二十五頁\總數(shù)七十四頁\編于十七點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：同時(shí)感染大量胚胎整合率高，轉(zhuǎn)基因整合后能穩(wěn)定地遺傳單拷貝整合型不需復(fù)雜設(shè)備缺點(diǎn)：外源基因難植入生殖系統(tǒng)，成功率低載量較小，一般只有8kb，不能插入大片段，缺少鄰近的調(diào)控元件而影響轉(zhuǎn)基因表達(dá)；目前二十六頁\總數(shù)七十四頁\編于十七點(diǎn)3.胚胎干細(xì)胞方法胚胎干細(xì)胞（embryonicstemcell，ES）是從早期胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（ICM）分離出來的，能在體外培養(yǎng)的一種高度未分化的多能干細(xì)胞。含正常二倍體染色體的具有發(fā)育全能性的細(xì)胞?？梢栽隗w外進(jìn)行人工培養(yǎng)，擴(kuò)增，并能以克隆的形式保存。目前二十七頁\總數(shù)七十四頁\編于十七點(diǎn)胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法在小鼠上應(yīng)用比較成熟，在大動(dòng)物上應(yīng)用較晚。豬的胚胎干細(xì)胞克隆系，牛的胚胎干細(xì)胞。目前二十八頁\總數(shù)七十四頁\編于十七點(diǎn)ES細(xì)胞成為個(gè)體1.將ES細(xì)胞注入到動(dòng)物的早期胚胎內(nèi)，可產(chǎn)生嵌合體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。目前二十九頁\總數(shù)七十四頁\編于十七點(diǎn)2.通過核移植將ES導(dǎo)入去核的卵母細(xì)胞，在子宮種植發(fā)育成個(gè)體目前三十頁\總數(shù)七十四頁\編于十七點(diǎn)胚胎干細(xì)胞轉(zhuǎn)基因過程目前三十一頁\總數(shù)七十四頁\編于十七點(diǎn)1.ES細(xì)胞的建立與維持動(dòng)物的準(zhǔn)備：受精后3.5天的母鼠分離鼠胚。胚胎的分離和初培養(yǎng)：3.5天孕鼠鼠斷頸處死解剖小鼠取出胚胎體外培養(yǎng)胚胎4-6天后，離散ICM。ICM的離散與ES的分離：分離ICM酶解細(xì)胞團(tuán)培養(yǎng)離散細(xì)胞ES細(xì)胞集落ES細(xì)胞的擴(kuò)增：離散ES細(xì)胞置四孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)ES細(xì)胞的常規(guī)培養(yǎng)：ES細(xì)胞由四孔板轉(zhuǎn)至培養(yǎng)皿進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)目前三十二頁\總數(shù)七十四頁\編于十七點(diǎn)2.ES細(xì)胞的基因組操作

將外源基因移入到ES細(xì)胞基因組后，既能高效穩(wěn)定表達(dá)，又不影響ES細(xì)胞的各種功能。這就要求目的基因必須要定點(diǎn)參入，并且參入整合后，對(duì)原有基因結(jié)構(gòu)及功能沒有影響或影響最小。目前三十三頁\總數(shù)七十四頁\編于十七點(diǎn)與整合位點(diǎn)兩端區(qū)域同源的兩段DNA序列（HB1和HB2）轉(zhuǎn)入的目的基因（TG）編碼抗G418的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（neor）兩個(gè)不的胸苷激酶基因（HSV-tk1和HSV-tk2）定點(diǎn)參入目前三十四頁\總數(shù)七十四頁\編于十七點(diǎn)3.轉(zhuǎn)基因ES細(xì)胞的篩選——正負(fù)選擇法

正選擇法篩選出轉(zhuǎn)基因整合型ES細(xì)胞：重組DNA導(dǎo)入ES細(xì)胞，在含有G418的培養(yǎng)基中，沒有整合外源基因的細(xì)胞將全部死亡，只有整合了外源基因的細(xì)胞才可以存活下來。負(fù)選擇法篩選出特異整合型ES細(xì)胞：如果非特異性整合發(fā)生，則兩個(gè)tk基因或其中一個(gè)基因很大可能與TG和neor一起整合，這時(shí)用GCV篩選，tk基因表達(dá)的胸苷激酶能反GCV轉(zhuǎn)化成有毒的化合物，使細(xì)胞死亡。目前三十五頁\總數(shù)七十四頁\編于十七點(diǎn)目前三十六頁\總數(shù)七十四頁\編于十七點(diǎn)4.轉(zhuǎn)基因ES細(xì)胞的檢測目前三十七頁\總數(shù)七十四頁\編于十七點(diǎn)5.移植將胚胎移植到假孕的代孕母鼠子宮內(nèi)，繁育轉(zhuǎn)基因小鼠。目前三十八頁\總數(shù)七十四頁\編于十七點(diǎn)（6）獲得純合的轉(zhuǎn)基因鼠目前三十九頁\總數(shù)七十四頁\編于十七點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：整合率高同源重組實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)整合，而非隨機(jī)整合缺點(diǎn)：不容易建立胚胎干細(xì)胞系長期培養(yǎng)，導(dǎo)入外源基因的胚胎干細(xì)胞會(huì)由于細(xì)胞分化使生產(chǎn)的動(dòng)物成為嵌合體第一代是嵌合體，獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的周期較長目前四十頁\總數(shù)七十四頁\編于十七點(diǎn)4.精子載體導(dǎo)入法

將外源DNA與破壞細(xì)胞膜的精子一起孵育，精子可捕獲外源DNA，并通過受精過程將外源DNA導(dǎo)入受精卵。目前四十一頁\總數(shù)七十四頁\編于十七點(diǎn)意大利Lavitrano等1989年首次報(bào)道利用精子作為載體獲得了轉(zhuǎn)基因小鼠。改進(jìn)的方法是精子頭部纖維注射此法不僅可免去復(fù)雜而昂貴的設(shè)備，且可省去不少繁雜的操作和條件準(zhǔn)備。但該法有些結(jié)果不穩(wěn)定，不能重復(fù),外源DNA分子可能會(huì)受到受精液中內(nèi)切酶的作用而影響整合后的功能需在繼續(xù)改進(jìn)目前四十二頁\總數(shù)七十四頁\編于十七點(diǎn)5.基因打靶(genetargeting)包括基因敲除(Knock-out)：靶基因被滅活.無功能的外源基因轉(zhuǎn)入細(xì)胞與基因組中同源序列進(jìn)行同源重組，把具有功能的同源序列置換出來，造成功能基因的缺失或失活.基因敲入(Knock-in):引入不存在的新基因.將外源有功能的基因轉(zhuǎn)入基因組中不存在或已失活的細(xì)胞中與其基因組中同源序列進(jìn)行同源重組，在細(xì)胞內(nèi)獲得表達(dá)，基因替代：基因修正(generepairment)目前四十三頁\總數(shù)七十四頁\編于十七點(diǎn)基因打靶的必備條件胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)能在體外培養(yǎng)，保留發(fā)育的全能性打靶載體Neo（新霉素）陽性篩選標(biāo)志HSV-tk陰性篩選標(biāo)志：單純皰疹病毒(herpessimplexvirus)胸腺嘧啶激酶(thymidinekinase)目前四十四頁\總數(shù)七十四頁\編于十七點(diǎn)目前四十五頁\總數(shù)七十四頁\編于十七點(diǎn)基因敲除的技術(shù)路線如下：（1）構(gòu)建重組基因載體﹔（2）打靶載體導(dǎo)入ES細(xì)胞：重組置換（3）基因敲除ES細(xì)胞注射入胚泡（4）胚泡植入假孕小鼠的子宮中（5）嵌合體的雜交育種目前四十六頁\總數(shù)七十四頁\編于十七點(diǎn)目前四十七頁\總數(shù)七十四頁\編于十七點(diǎn)目前四十八頁\總數(shù)七十四頁\編于十七點(diǎn)O型載體，序列插入型載體，這類載體與靶基因組同源重組配對(duì)，經(jīng)過一次交換，前者插入后者，它發(fā)生單交換而將載體序列插入靶基因內(nèi)，致使染色體DNA部分重復(fù)，可能破壞內(nèi)在正?；蚨l(fā)生突變，也可代替原來缺陷基因，糾正遺傳特征，使靶基因特異失活。

Ω型載體，也稱序列取代載體，外來載體DNA和靶細(xì)胞染色體DNA同源配對(duì)，經(jīng)過兩次交換，前者取代后者，此類載體可與靶序列發(fā)生雙交換，以外源序列取代靶序列，其基因組大小并無改變?；虼虬休d體目前四十九頁\總數(shù)七十四頁\編于十七點(diǎn)目前五十頁\總數(shù)七十四頁\編于十七點(diǎn)6.YAC(YeastArtificialChromosome)

人工酵母染色體法transferlargegene/clustergene(100kb):YAC具有自主復(fù)制序列、克隆位點(diǎn)和可在細(xì)菌和酵母菌中選擇的標(biāo)記基因；還具有酵母菌染色體一些特點(diǎn)；可接受100－1000kb的外源DNA片段avoidDNAdamage:YAC已成為人類基因組計(jì)劃和圖位克隆基因的重要工具；目前五十一頁\總數(shù)七十四頁\編于十七點(diǎn)方法顯微注射核移植胚胎干細(xì)胞逆轉(zhuǎn)錄病毒基因敲除精子介導(dǎo)優(yōu)點(diǎn)外源基因整合效率較高，不需要載體，目的基因的長度可達(dá)100Kb轉(zhuǎn)基因效率高；預(yù)測基因表達(dá)水平；可以使用定點(diǎn)整合技術(shù)外源DNA的整合率高；

整合在生殖細(xì)胞中的比例也很高。

可在整合點(diǎn)整合轉(zhuǎn)移基因的單個(gè)拷貝；該方法簡單、方便缺點(diǎn)精密儀器，技術(shù)操作較難，易造成宿主動(dòng)物基因組的插入突變供體細(xì)胞易衰老ES細(xì)胞株不易建立，長期培養(yǎng)后出現(xiàn)分化現(xiàn)象；生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物都是嵌合體

插入的基因有大小限度；嵌合性很高；外源DNA在動(dòng)物各種組織中的分布不均

應(yīng)用具有一定局限性有些結(jié)果不能重復(fù)

目前五十二頁\總數(shù)七十四頁\編于十七點(diǎn)三、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物反應(yīng)器動(dòng)物生物反應(yīng)器（bioreactor）:目的片段在器官或組織中表達(dá)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)１克藥物蛋白質(zhì)，用細(xì)胞基因工程需800-5000美元，而利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物只需美元。一種新藥從研制到上市通常需要10-15年，而轉(zhuǎn)基因動(dòng)物—乳腺生物反應(yīng)器，生產(chǎn)周期僅為５年左右。目前五十三頁\總數(shù)七十四頁\編于十七點(diǎn)幾乎任何有生命的器官、組織或其中一部分都可經(jīng)過人為馴化為生物反應(yīng)器,從生產(chǎn)的角度考慮，生物反應(yīng)器選擇的組織和器官要方便產(chǎn)物的獲得，例如，乳腺、膀胱、血液等，由此發(fā)展了乳腺生物反應(yīng)器,血液生物反應(yīng)器和膀胱生物反應(yīng)器等。其中，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器的研究最為引人注目。目前五十四頁\總數(shù)七十四頁\編于十七點(diǎn)（一）動(dòng)物乳腺反應(yīng)器乳腺生物反應(yīng)器的研制，就是通過基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，將外源基因?qū)雱?dòng)物體內(nèi)，通過乳腺特異啟動(dòng)子的控制，獲得乳腺生產(chǎn)外源蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。藥用蛋白基因表達(dá)細(xì)胞株細(xì)胞核供體動(dòng)物受精卵無核受精卵組裝的核細(xì)胞胚胎藥用蛋白乳汁雌性轉(zhuǎn)基因動(dòng)物動(dòng)物幼崽假孕動(dòng)物受體動(dòng)物目前五十五頁\總數(shù)七十四頁\編于十七點(diǎn)商業(yè)要求：1g/L乳腺是外分泌器官，乳汁不進(jìn)入體內(nèi)循環(huán)，不會(huì)影響到轉(zhuǎn)基因動(dòng)物本身的生理反應(yīng)，從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的乳汁中獲取的目的基因產(chǎn)物，不但產(chǎn)量高、易提純，而且表達(dá)的蛋白經(jīng)過了充分的修飾加工，具有穩(wěn)定的生物活性，因此又被稱為動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器2006年8月，歐洲藥品估計(jì)局（EMEA）批準(zhǔn)了哺乳動(dòng)物細(xì)胞乳腺生物反應(yīng)器（改名為乳腺生物反應(yīng)器）

目前五十六頁\總數(shù)七十四頁\編于十七點(diǎn)1、動(dòng)物乳腺是一個(gè)封閉的系統(tǒng)：表達(dá)的蛋白絕大部分不會(huì)回到血液循環(huán),避免大量表達(dá)的外源蛋白對(duì)動(dòng)物健康的危害。2、乳腺組織是一種有效的蛋白質(zhì)合成器。奶牛一年生產(chǎn)乳蛋白250-300kg,山羊生產(chǎn)乳蛋白25-30kg,家兔生產(chǎn)乳蛋白也可達(dá)到3-5kg。3、乳腺組織可以對(duì)人體蛋白質(zhì)進(jìn)行正確的修飾和后加工，生物學(xué)活性接近天然產(chǎn)品。4、動(dòng)物乳腺表達(dá)的外源基因可以遺傳，獲得生產(chǎn)有價(jià)值蛋白質(zhì)的動(dòng)物個(gè)體后,可以常規(guī)繁殖生產(chǎn)群體。目前五十七頁\總數(shù)七十四頁\編于十七點(diǎn)80年代，在鼠的乳腺組織高效表達(dá)了人AAT，開創(chuàng)了此研究的先河全世界有20-30家公司致力于開發(fā)動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器重組蛋白藥物，可進(jìn)行商業(yè)生產(chǎn)的有近30種,包括人AAT、EPO、乳鐵蛋白、BSA、血紅蛋白，Ⅸ、Ⅷ和抗凝血酶Ⅲ、血纖維蛋白原、tPA等十余種稀有藥品，臨床試驗(yàn)的有l(wèi)0余種，研發(fā)階段的有上百種．2006年6月，由美國Genzyme公司研制成功的第一個(gè)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)的重組人抗凝血酶III（商品名：ATryn）已經(jīng)獲準(zhǔn)上市目前五十八頁\總數(shù)七十四頁\編于十七點(diǎn)目前五十九頁\總數(shù)七十四頁\編于十七點(diǎn)目前六十頁\總數(shù)七十四頁\編于十七點(diǎn)AAT轉(zhuǎn)基因羊，其乳汁中含有a-抗胰蛋白酶(AAT)，可治療遺傳性肺氣腫病。每升羊奶售6000美元。英國PPL公司與德國拜耳公司生產(chǎn)

目前六十一頁\總數(shù)七十四頁\編于十七點(diǎn)目前六十二頁\總數(shù)七十四頁\編于十七點(diǎn)我國乳腺反應(yīng)器的研制1996年研制成功的能在乳腺中表達(dá)人凝血因子、EPO的轉(zhuǎn)基因羊1998年獲得了能表達(dá)人BSA的轉(zhuǎn)基因奶牛2000年獲得了我國首例轉(zhuǎn)有人AAT的轉(zhuǎn)基因羊2005年研制的人乳鐵蛋白和人乳清BSA轉(zhuǎn)基因奶牛均獲得高效表達(dá)，含量分別達(dá)到3.4g/L和1.5g/L，標(biāo)志了我國首次獲得可商業(yè)化生產(chǎn)的動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器重組人類蛋白目前六十三頁\總數(shù)七十四頁\編于十七點(diǎn)乳腺產(chǎn)品的缺點(diǎn)post-translationalmodificationshumanproteinC不能正確的形成亞基humanantithrombinIII未能完全的糖基化目前六十四頁\總數(shù)七十四頁\編于十七點(diǎn)轉(zhuǎn)基因高等哺乳動(dòng)物乳液蛋白糖基化仍有別于人，可能導(dǎo)致抗原性的變化。歐盟人用醫(yī)學(xué)制品委員會(huì)（CHMP）曾對(duì)ATryn上市提出過反對(duì)意見，理由是臨床例數(shù)太少。另外，美國Genzyme公司重組人酸性α-葡萄糖酶（商品名Myozyme），原本在轉(zhuǎn)基因兔奶中生產(chǎn)，最終換為CHO細(xì)胞生產(chǎn)并獲得FDA批準(zhǔn)上市目前六十五頁\總數(shù)七十四頁\編于十七點(diǎn)（二）血液血液生物反應(yīng)器比較適合生產(chǎn)人血紅蛋白、抗體和生產(chǎn)非生物學(xué)活性狀態(tài)的融合蛋白而有活性的蛋白或多肽(如激素、細(xì)胞分裂素、組織血纖維溶酶因子等)由于進(jìn)入了動(dòng)物血液循環(huán)系統(tǒng)而影響動(dòng)物的健康。到目前為止，已有多種通過轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)的具有生物學(xué)功能的人血紅蛋白問世。目前六十六頁\總數(shù)七十四頁\編于十七點(diǎn)大家畜的血液容量較大,利用動(dòng)物血液生產(chǎn)某些蛋白質(zhì)或多肽等藥物己取得了一定進(jìn)展。外源基因編碼產(chǎn)物可直接從血清中分離出來,