間接免疫熒光法測(cè)

間接免疫熒光法測(cè)第1頁(yè)/共34頁(yè)間接免疫熒光法

檢測(cè)抗核抗體（ANA）制作人：XXX20XX-XX-XX第2頁(yè)/共34頁(yè)抗核抗體【自身抗體】：指抗自身組織、器官、細(xì)胞及其成分的抗體【ANA】：指抗細(xì)胞核成分（DNA，RNA，蛋白質(zhì)和酶）的抗體。ANA存在一個(gè)譜ANA新概念：抗核酸（Nucleicacid）和核蛋白（Nucleoprotein）抗體的總稱某些核抗原成分在核仁和胞漿內(nèi)比核質(zhì)內(nèi)更豐富第3頁(yè)/共34頁(yè)ANA檢測(cè)的意義有助于疾病的診斷如抗Sm是SLE標(biāo)記抗體；

抗ScL-70是SD的標(biāo)記抗體；抗Jo-1是PM/DM的標(biāo)記抗體；觀察疾病活動(dòng)度和治療反應(yīng)研究發(fā)病機(jī)理第4頁(yè)/共34頁(yè)【ANA分類】抗DNA（dsDNA,ssDNA)抗組蛋白（Histone)抗非組蛋白（Nonhistone,ExtractableNuclearAntigen,ENA）抗核仁（Nucleolus）第5頁(yè)/共34頁(yè)幾種ENA的由來(lái)及同義詞Sm：病人名：SmithRNP:u1RNP或nRNPNuclearRibonucleoproteinSSA:ROSjogren’ssyndromeASSB:La,Ha,Sjogren’ssyndromeBJo-1:病人JohnScL-70:Scleroderma第6頁(yè)/共34頁(yè)【ANA由來(lái)】中性粒細(xì)胞DNP(DNA-Histone)+抗DNP+補(bǔ)體均質(zhì)體LE細(xì)胞LE細(xì)胞：并非SLE特有，PM、SD、RA、SS等結(jié)締組織病，藥物過(guò)敏，慢活肝等亦可陽(yáng)性?？笵NP取代LE細(xì)胞的檢測(cè)+第7頁(yè)/共34頁(yè)ANA的篩選：間接免疫熒光法++抗原抗體（血清）抗原—抗體第二抗體第8頁(yè)/共34頁(yè)ANA的篩選：間接免疫熒光法第9頁(yè)/共34頁(yè)實(shí)驗(yàn)原理：生物薄膜載片上的IgA、IgG、IgM類特異性抗體可以與抗核抗原反應(yīng)；隨后，結(jié)合抗體可與標(biāo)記熒光的二抗進(jìn)行反應(yīng)，并可在熒光顯微鏡下觀察。第10頁(yè)/共34頁(yè)抗原人特異性抗體FITC標(biāo)記的抗人抗體FITC

FITC載片實(shí)驗(yàn)原理：第11頁(yè)/共34頁(yè)生物薄片馬賽克TM技術(shù)第12頁(yè)/共34頁(yè)【實(shí)驗(yàn)步驟】第13頁(yè)/共34頁(yè)實(shí)驗(yàn)步驟一：準(zhǔn)備檢查加樣板是否反應(yīng)區(qū)親水而周邊疏水？如果不是，可用濕紙巾擦拭，必要時(shí)可使用家用洗滌劑，再用水徹底沖洗。需要消毒時(shí)，可于3％的SekuseptExtra（漢高公司）中浸泡1小時(shí)。只有當(dāng)載片平衡到室溫后方可打開袋子。不要觸及生物薄片。按照要求用記號(hào)筆對(duì)玻片進(jìn)行標(biāo)記。第14頁(yè)/共34頁(yè)實(shí)驗(yàn)步驟二：樣品準(zhǔn)備1:100稀釋血清標(biāo)本。每次實(shí)驗(yàn)均需加入陽(yáng)性和陰性對(duì)照。對(duì)照血清使用前必須混勻。第15頁(yè)/共34頁(yè)實(shí)驗(yàn)步驟三：加樣在加樣板的每個(gè)反應(yīng)區(qū)加入稀釋血清，避免產(chǎn)生氣泡。滴加完所有待測(cè)標(biāo)本后才開始溫育。使用聚苯乙烯加樣板。加樣體積:25μl/反應(yīng)區(qū)(5x5mm)12345樣品1樣品2樣品3陽(yáng)性對(duì)照陰性對(duì)照第16頁(yè)/共34頁(yè)實(shí)驗(yàn)步驟四：孵育將載片蓋在加樣板對(duì)應(yīng)的凹槽里，反應(yīng)即開始。確保每個(gè)標(biāo)本均能夠與生物薄片相接觸，而標(biāo)本之間不相互接觸。室溫（18-25℃）溫育30分鐘。第17頁(yè)/共34頁(yè)實(shí)驗(yàn)步驟五：沖洗

用燒杯盛PBS-Tween緩沖液，流水沖洗載片，然后立即放入裝有PBS-Tween緩沖液的小杯中浸洗至少5分鐘。第18頁(yè)/共34頁(yè)實(shí)驗(yàn)步驟六：加樣

將20μl熒光標(biāo)記的抗人球蛋白（熒光二抗）加入潔凈加樣板的每個(gè)反應(yīng)區(qū)。完全加完所有的二抗后，方可繼續(xù)溫育（最多可加50個(gè)載片）。建議使用連續(xù)加樣器。加樣前應(yīng)使用加樣器混勻。為節(jié)約時(shí)間，可在第一步溫育的同時(shí)滴加酶結(jié)合物至另一個(gè)加樣板的反應(yīng)區(qū)中。第19頁(yè)/共34頁(yè)實(shí)驗(yàn)步驟七：孵育

從PBS-Tween清洗緩沖液中取出一張載片，5秒鐘內(nèi)用吸水紙擦一下背面和邊緣后，立即將載片覆有生物薄片的一面朝下，蓋在加樣板的凹槽里。注意：為防止破壞基質(zhì)，不要擦拭反應(yīng)區(qū)的間隙。檢查生物薄片是否與液滴接觸良好，然后繼續(xù)下一張。從現(xiàn)在開始，注意避免陽(yáng)光直射載片。室溫溫育30分鐘。第20頁(yè)/共34頁(yè)實(shí)驗(yàn)步驟八：沖洗用燒杯盛PBS-Tween緩沖液，流水沖洗載片，然后立即放入裝有PBS-Tween緩沖液的小杯中浸洗至少5分鐘?？稍诿?50ml磷酸鹽緩沖液中加10滴(150μl)伊文氏藍(lán)進(jìn)行復(fù)染。第21頁(yè)/共34頁(yè)實(shí)驗(yàn)步驟九：封片

在蓋玻片上滴加甘油/PBS。封片體積:10μl/反應(yīng)區(qū)(5x5mm)從PBS-Tween清洗緩沖液中取出一張載片，用紙擦干背面和四邊，注意不要擦拭反應(yīng)區(qū)間隙。將載片的生物薄片朝下置于準(zhǔn)備好的蓋玻片上，立即檢查蓋玻片是否放入載片的凹槽里，如有必要，需調(diào)整位置，正確放置。然后再進(jìn)行下一個(gè)載片的操作。第22頁(yè)/共34頁(yè)實(shí)驗(yàn)步驟十：結(jié)果判斷熒光顯微鏡下觀察熒光。第23頁(yè)/共34頁(yè)結(jié)果判讀：熒光顯微鏡下觀察

細(xì)胞核發(fā)黃綠色熒光為陽(yáng)性染色細(xì)胞，不發(fā)熒光為陰性。抗原片中出現(xiàn)陽(yáng)性染色細(xì)胞為ANA陽(yáng)性，否則為陰性。陽(yáng)性待檢血清可作進(jìn)一步稀釋后測(cè)定效價(jià)。第24頁(yè)/共34頁(yè)【均質(zhì)型】

細(xì)胞核呈均勻一致的熒光

第25頁(yè)/共34頁(yè)【核仁型】

核仁部分呈現(xiàn)熒光第26頁(yè)/共34頁(yè)【斑點(diǎn)型】(顆粒型)

細(xì)胞核內(nèi)呈現(xiàn)斑點(diǎn)狀熒光第27頁(yè)/共34頁(yè)【胞漿型】第28頁(yè)/共34頁(yè)【著絲點(diǎn)型】第29頁(yè)/共34頁(yè)

混合型：存在兩種以上的類型

混合型：存在兩種以上的類型第30頁(yè)/共34頁(yè)ANA結(jié)果判斷1：100陰性陰性，標(biāo)本中未檢測(cè)到抗核抗體1：100陽(yáng)性微量對(duì)于核均質(zhì)性、著絲點(diǎn)、核點(diǎn)型等熒光模式，提示某種風(fēng)濕性疾病或其他疾病1：320陽(yáng)性陽(yáng)性提示某種風(fēng)濕病或其他疾病滴度定義：與相同稀釋倍數(shù)的陰性血清相比，能觀察到特異性熒光反應(yīng)的最高稀釋度第31頁(yè)/共34頁(yè)【臨床意義】總的ANA檢測(cè)在臨床診斷與鑒別診斷中是一個(gè)極為重要的篩選試驗(yàn)。絕大多數(shù)自身免疫性疾病均可呈陽(yáng)性。ANA陽(yáng)性者進(jìn)一步檢測(cè)各亞類ANA抗體對(duì)明確診斷、臨床分型、病情觀察、預(yù)后及治療評(píng)價(jià)有重要意義。未經(jīng)治療的、活動(dòng)性SLE的陽(yáng)性率為80%－100%。藥物性狼瘡100%、全身硬皮病、混合性結(jié)綈組織病、狼瘡性肝炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化等。干燥綜合癥（SS）、類風(fēng)關(guān)、橋本甲狀腺炎等。第32頁(yè)/共34頁(yè)活動(dòng)性SLE

（95-100%）非活動(dòng)性SLE

（80-100%）藥物誘導(dǎo)的紅斑狼瘡 （100%）混合結(jié)締組織病 （100%）類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 （20-40%）其他風(fēng)濕性疾病