基因與基因工程

（優(yōu)選）基因與基因工程目前一頁\總數(shù)六十一頁\編于十六點(diǎn)后人在分析孟德爾成功發(fā)現(xiàn)遺傳第一定律和第二定律的原因時，一致認(rèn)為選擇豌豆為實驗材料具有決定性的意義。那么豌豆具有什么樣的生物學(xué)特性呢？（2）豌豆的生物學(xué)特性

目前二頁\總數(shù)六十一頁\編于十六點(diǎn)a.不同的豌豆品系之間，通常存在著差異明顯、易于區(qū)別而又穩(wěn)定遺傳的相對性狀特征；（開紫花的豌豆植株）b.豌豆花的結(jié)構(gòu)比較特殊，具有雄配子的花藥和具有雌配子的胚珠是由花瓣包裹著。因此它是一種嚴(yán)格的自花授粉植物；（豌豆花的結(jié)構(gòu)）c.豌豆具有較大型的花器官（即生殖器官），便于去雄，進(jìn)行人工授粉實驗。（豌豆人工授粉）目前三頁\總數(shù)六十一頁\編于十六點(diǎn)（3）孟德爾的單因子豌豆雜交實驗

－－遺傳因子分離定律

1856年至1863年，孟德爾在奧古斯汀修道院的后花園進(jìn)行了長達(dá)8年的豌豆雜交實驗。他首先選擇了七對區(qū)別分明而又能穩(wěn)定遺傳的性狀作仔細(xì)的觀察。這七對性狀是：花著生的部位……腋生和頂生種子的形狀……圓形和皺形種子內(nèi)部顏色……黃色和綠色花朵的顏色……紫色和白色植株莖桿長度……長莖和短莖成熟豆莢外形……飽滿和節(jié)縮未成熟豆莢顏色……綠色和黃色目前四頁\總數(shù)六十一頁\編于十六點(diǎn)Table1.AsummaryofthesevenpairsofcontrastingtraitsandresultsofMendel’ssevenmonohybridcrossesofthegardenpea(Pisumsativum)目前五頁\總數(shù)六十一頁\編于十六點(diǎn)

（4）孟德爾雙因子豌豆雜交實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計

世代種子表型種子數(shù)量比例親代

綠圓×黃皺－－F1代

黃圓－－F2代

黃圓3159.84黃皺1013.16綠圓1083038綠皺321.0總數(shù)556目前六頁\總數(shù)六十一頁\編于十六點(diǎn)（5）遺傳因子的自由組合定律：根據(jù)上述實驗結(jié)果，孟德爾推想：由兩對等位因子雜交產(chǎn)生的雜種F1代植株，在形成配子過程中，兩對等位因子的分離是彼此獨(dú)立互不相關(guān)的，而在形成合子的過程中，不同因子之間又是自由組合的。這就是所謂的遺傳因子獨(dú)立分配律，或叫自由組合律，亦即是孟德爾第二定律。孟德爾還進(jìn)行了多因子豌豆雜交實驗，其結(jié)果雖然比較復(fù)雜，但它同樣遵循遺傳因子的獨(dú)立分離和自由組合的原則。目前七頁\總數(shù)六十一頁\編于十六點(diǎn)

（6）孟德爾遺傳因子被正式定名為基因

1909年，丹麥的一位生物學(xué)家約翰遜，根據(jù)希臘文“給予生命之義”創(chuàng)造了“基因”這個名詞，用來代替孟德爾的“遺傳因子”。但是需要指出，約翰遜當(dāng)時所說的基因，并不代表遺傳物質(zhì)實體，只是一種與細(xì)胞的任何可見的形態(tài)結(jié)果均無關(guān)系的抽象單位，也就是遺傳性狀符號！目前八頁\總數(shù)六十一頁\編于十六點(diǎn)2、摩爾根的基因論

（1）摩爾根生平簡介1866年9月25日，ThomasHantMorgan出生于美國肯塔基州的列克星敦市的一個富裕家庭。1880年，14歲的少年摩爾根考入肯塔基州立學(xué)院預(yù)科班學(xué)習(xí)，兩年后轉(zhuǎn)入本科。1886年，以全班第一名成績從肯塔基州立學(xué)院畢業(yè)，進(jìn)入約翰.霍普金斯大學(xué)從事實驗胚胎學(xué)研究；目前九頁\總數(shù)六十一頁\編于十六點(diǎn)1890年，在約翰.霍普金斯大學(xué)獲理學(xué)博士學(xué)位；1891～1903年，在布林莫爾女子學(xué)院任教，同時在其它一些研究機(jī)構(gòu)從事胚胎學(xué)方面的研究；1904～1928年，擔(dān)任哥倫比亞大學(xué)動物學(xué)教授，進(jìn)行遺傳學(xué)與進(jìn)化論領(lǐng)域的科學(xué)研究；1927～1931年，擔(dān)任美國科學(xué)院院長；1928年退休，同年發(fā)表名著“基因論”；1928～1945年，任加州大學(xué)生物學(xué)主任；1930年，擔(dān)任美國科學(xué)促進(jìn)聯(lián)合會主席；1933年，獲諾貝爾生理學(xué)及醫(yī)學(xué)獎；1945年12月4日，因動脈血管破裂在美國加州的帕薩迪納市逝世。目前十頁\總數(shù)六十一頁\編于十六點(diǎn)（2）果蠅的生物學(xué)特性

a.繁殖能力強(qiáng)，產(chǎn)卵數(shù)量多；b.繁殖速度快，世代時間短（9天左右）；c.染色體數(shù)目少，僅4對，且形態(tài)各異，易于辨認(rèn)；d.擁有大量的各種突變體；e.個體小，管理簡單，對飼料無特殊要求。

目前十一頁\總數(shù)六十一頁\編于十六點(diǎn)（3）果蠅的染色體組

性染色體――指與生物個體的性別決定有直接關(guān)聯(lián)的染色體。例如果蠅的X染色體和Y染色體。

常染色體――除了性染色體之外的，不直接參與生物個體性別決定的染色體叫常染色體。例如果蠅的第II對，第III對染色體，均為常染色體。果蠅有4對染色體，其中1對為性染色體，其余3對為常染色體。目前十二頁\總數(shù)六十一頁\編于十六點(diǎn)

（4）果蠅眼色基因的性連鎖遺傳1910年，摩爾根及其助手從紅嚴(yán)果蠅群體中發(fā)現(xiàn)了一只白眼的雄果蠅，他們將白眼雄果蠅同來自同一父母的姊妹紅眼雌果蠅交配，結(jié)果產(chǎn)生的F1代果蠅，無論是雄的還是雌的，無一例外都是紅眼的。這個結(jié)果說明：a.

果蠅紅眼是顯性性狀，白眼是隱性性狀；b.

親代白眼雄果蠅是隱性純合子；c.

親代紅眼雌果蠅是顯性純合子；摩爾根等人將上述所產(chǎn)生的F1代的紅眼雄果蠅同紅眼雌果蠅相互交配，產(chǎn)生的子二代（F2）果蠅中，紅眼同白眼的比例恰好為3:1。但有趣的是，所有的白眼果蠅都是雄性的，沒有一只是雌性。目前十三頁\總數(shù)六十一頁\編于十六點(diǎn)這說明：白眼性狀與性別有聯(lián)系，摩爾根等人推測控制果蠅的白眼隱性基因是位于X染色體上。摩爾根等人的工作，第一次將代表某一特定性狀的基因，同某一特定的染色體聯(lián)系起來了，從而建立了基因的遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)，建立了基因的染色體理論，使基因?qū)W說得到了普遍的承認(rèn)。目前十四頁\總數(shù)六十一頁\編于十六點(diǎn)（5）連鎖與交換定律

基因的連鎖與交換定律，是由美國著名的遺傳學(xué)及胚胎學(xué)家摩爾根與他的學(xué)生所建立的。由于該定律極大地完善并豐富了孟德爾遺傳學(xué)理論，因此后人將它與孟德爾第一遺傳定律、第二遺傳定律并列，稱之為遺傳學(xué)第三定律。目前十五頁\總數(shù)六十一頁\編于十六點(diǎn)（6）摩爾根的學(xué)術(shù)貢獻(xiàn)

摩爾根及其學(xué)術(shù)的工作，第一次將代表某一特定性狀的基因，同某一特定的染色體連系了起來，從而確證了基因的遺傳物質(zhì)基因，建立了基因的染色體理論，為基因工程的建立作了卓越的貢獻(xiàn)。摩爾根生活低調(diào)，衣著樸素，熱心科研，勤奮工作，知道38歲才與其女友結(jié)婚。為了不影響科研工作，摩爾根借故沒有出席諾貝爾獎的頒獎典禮。他總結(jié)自己為什么會在科學(xué)研究中作出諸多發(fā)現(xiàn)的原因時說“一靠勤奮，二靠實驗材料得當(dāng)，三靠愿意放棄沒有任何證據(jù)的假說，最后還得少開些遺傳學(xué)大會”。目前十六頁\總數(shù)六十一頁\編于十六點(diǎn)3.基因的載體是DNA

在孟德爾和摩爾根的基因論被科學(xué)工作者廣泛接受之后，關(guān)于基因的載體（或說是化學(xué)本質(zhì)）是DNA還是蛋白質(zhì)，一直存在著兩種不同的意見。

（1）1944年，O.Avery等人的肺炎鏈球菌毒性轉(zhuǎn)化實驗證明，基因的載體是DNA，而不是蛋白質(zhì)。S型肺炎鏈球菌――具莢膜，光滑，有毒。R型肺炎鏈球菌――無莢膜，粗糙，無毒。目前十七頁\總數(shù)六十一頁\編于十六點(diǎn)結(jié)論：使肺炎鏈球菌毒力性狀發(fā)生轉(zhuǎn)化的因子是DNA，而不是蛋白質(zhì)。這有力地證明基因的遺傳載體是DNA而不是蛋白質(zhì)。目前十八頁\總數(shù)六十一頁\編于十六點(diǎn)（2）1952年，A.DHersheyandM.Chase應(yīng)用放射性同位素雙標(biāo)記技術(shù)，證明菌體的遺傳物質(zhì)（基因的載體）也是DNA而不是蛋白質(zhì)。實驗現(xiàn)象：用放射性同位素32P和35S分別標(biāo)記噬菌體的內(nèi)部DNA和外部蛋白質(zhì)，然后感染寄主細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有32P標(biāo)記的DNA注入大腸桿菌細(xì)胞。結(jié)論：在噬菌體中，基因的載體也是DNA而不是蛋白質(zhì)。目前十九頁\總數(shù)六十一頁\編于十六點(diǎn)

DNA分子的半保留復(fù)制模型（3）1953年，J.Watson和F.Crick建立了DNA的雙螺旋模型；1958年，M.Meselson和F.W.Stahl在此基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)了DNA分子半保留復(fù)制機(jī)理。從而解決了基因的自我復(fù)制和代代相傳的問題。

至此，基因的分子本質(zhì)是DNA而不是蛋白質(zhì)已是不爭的事實！目前二十頁\總數(shù)六十一頁\編于十六點(diǎn)4.基因的編碼產(chǎn)物

基因是細(xì)胞中所有RNA及蛋白質(zhì)分子的“藍(lán)圖”，有些基因編碼的最終產(chǎn)物是RNA分子，例如rRNA基因、tRNA基因及其它小分子量的RNA基因等；而其它一些基因編碼的最終產(chǎn)物是蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)是通過mRNA中介合成的。

目前二十一頁\總數(shù)六十一頁\編于十六點(diǎn)5.遺傳密碼的破譯－－DNA的核苷酸順序與蛋白質(zhì)氨基酸順序關(guān)系

Beadle、Tatum和Ingram等人的工作，雖然確立了基因（DNA）與蛋白質(zhì)多肽鏈之間的關(guān)系，也就是說蛋白質(zhì)是由基因編碼的，但是，基因的DNA分子是由4種不同的核苷酸（A、T、G和C）排列組合而成的，而蛋白質(zhì)分子中的多肽鏈則是由20種氨基酸排列組合而成。那么基因DNA分子中的核苷酸堿基順序，同蛋白質(zhì)多肽鏈中的氨基酸順序之間存在著什么樣的關(guān)系呢？遺傳密碼的破譯正確地回答了這個問題。目前二十二頁\總數(shù)六十一頁\編于十六點(diǎn)（1）中心法則1958年，F(xiàn).Crick提出了解釋DNA，RNA及蛋白質(zhì)三者關(guān)系的所謂中心法則：

DNARNA蛋白質(zhì)根據(jù)中心法則DNA會自我復(fù)制，而RNA及蛋白質(zhì)二者都不能夠自我復(fù)制，因此生物體中能夠永久保存代代相傳下去的是DNA分子，或說是基因。目前二十三頁\總數(shù)六十一頁\編于十六點(diǎn)DNA在復(fù)制過程中雙鏈解開，以單鏈形式作為合成自己互補(bǔ)鏈（cDNA）的模板，其堿基配對原則是：

腺嘌呤（A）－胸腺嘧啶（T）鳥嘌呤（G）－胞嘧啶（C）在DNA到RNA的轉(zhuǎn)錄過程中，單鏈的cDNA則是作為指導(dǎo)RNA合成的模板。RNA可分成tRNA、rRNA、其它小分子RNA和mRNA，其中只有mRNA可轉(zhuǎn)譯成蛋白質(zhì)。轉(zhuǎn)錄過程中的堿基配對原則：

腺嘌呤（A）－尿嘧啶（U）鳥嘌呤（G）－胞嘧啶（C）目前二十四頁\總數(shù)六十一頁\編于十六點(diǎn)（2）遺傳密碼遺傳信息從DNA到RNA再到蛋白質(zhì)的過程，叫作基因的表達(dá)。它涉及遺傳信息的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯兩個步驟。

轉(zhuǎn)錄――根據(jù)堿基互補(bǔ)原則，遺傳信息從DNA的核苷酸序列形式轉(zhuǎn)換成RNA核苷酸序列形式的過程叫作轉(zhuǎn)錄，也叫RNA合成。轉(zhuǎn)譯――遺傳信息從mRNA的核苷酸序列形式，轉(zhuǎn)變成蛋白質(zhì)多肽鏈氨基酸序列形式的過程叫作轉(zhuǎn)譯，也叫蛋白質(zhì)合成。目前二十五頁\總數(shù)六十一頁\編于十六點(diǎn)

當(dāng)我們思考轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯這兩個過程時會發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)譯與轉(zhuǎn)錄不同，它不是簡單的核苷酸序列的轉(zhuǎn)換過程，而是將mRNA分子上的核苷酸語言翻譯成蛋白質(zhì)多肽鏈上氨基酸語言的負(fù)責(zé)過程，是涉及到兩種不同語言信號之間的更換問題。

因此，在從mRNA到蛋白質(zhì)多肽鏈的轉(zhuǎn)譯過程中，必定存在著一種特殊的遺傳密碼系統(tǒng)，才能夠?qū)NA分子上的核苷酸順序，同蛋白質(zhì)多肽鏈分子上的氨基酸順序聯(lián)系。這種遺傳密碼在1966年已經(jīng)完全破譯。目前二十六頁\總數(shù)六十一頁\編于十六點(diǎn)（3）通用遺傳密碼表

第一位字母（5’-

末端）第二位字母第三位字母（3’-末端）UUCAGUCAGPhePheLeuLeuSerSerSerSerTyrTyrStopStopCysCysStopTrpCLeuLeuLeuLeuProProProProHisHisGlnGlnArgArgArgArgUCAGAIleIleIleMetThrThrThrThrAsnAsnLysLysSerSerArgArgUCAGGValValValValAlaAlaAlaAlaAspAspGluGluGlyGlyGlyGlyUCAG注1.Met和Val的密碼子AUG和GUG，也叫起始密碼子，表中加方框表示。注2.UAA、UAG及UGA三個密碼子為終止密碼子，表中以“Stop”表示。目前二十七頁\總數(shù)六十一頁\編于十六點(diǎn)6.基因的結(jié)構(gòu)

按照細(xì)胞中是否存在真正有形的細(xì)胞核結(jié)構(gòu)，可把生物分成真核生物和原核生物兩大類。例如大腸桿菌細(xì)胞中的染色體并沒有被核膜包圍，因此沒有真正的有形的細(xì)胞核結(jié)構(gòu)，屬于原核生物。而諸如高等植物和動物，細(xì)胞中的染色體被核膜包圍成一種有形的細(xì)胞核結(jié)構(gòu)，屬于真核生物。與此相應(yīng)，也可把基因分成真核基因和原核基因兩大類，兩者在結(jié)構(gòu)上是有差別的。

目前二十八頁\總數(shù)六十一頁\編于十六點(diǎn)（1）基因的基本組成部分

不管是真核基因還是原核基因，都具有如下4個基本的組成部分：a.編碼區(qū)――包括起始密碼子，終止密碼子和氨基酸密碼子；b.非編碼區(qū)――5’-末端非轉(zhuǎn)譯區(qū)，3’-末端非轉(zhuǎn)譯區(qū)，真核基因

的間隔區(qū)；c.啟動區(qū)――RNA聚合酶結(jié)合部位，由此啟動基因的轉(zhuǎn)錄作用；d.終止區(qū)――具有終止轉(zhuǎn)錄作用的功能。目前二十九頁\總數(shù)六十一頁\編于十六點(diǎn)（2）原核蛋白質(zhì)編碼基因的結(jié)構(gòu)

基因轉(zhuǎn)錄區(qū)啟動子終止子轉(zhuǎn)錄ATGTAA5’-UTR3’-UTR轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)RNA起點(diǎn)核糖體結(jié)合位點(diǎn)目前三十頁\總數(shù)六十一頁\編于十六點(diǎn)（3）真核蛋白質(zhì)編碼基因的結(jié)構(gòu)

基因轉(zhuǎn)錄區(qū)啟動子終止子轉(zhuǎn)錄ATGTAA5’-UTR3’-UTR多聚核苷酸化位點(diǎn)RNA起點(diǎn)初級RNA轉(zhuǎn)錄本剪輯ATGTAA5’-UTR3’-UTR多聚核苷酸化位點(diǎn)RNA起點(diǎn)核糖體結(jié)合位點(diǎn)mRNA基因轉(zhuǎn)錄區(qū)啟動子終止子轉(zhuǎn)錄ATGTAA5’-UTR3’-UTR多聚核苷酸化位點(diǎn)RNA起點(diǎn)初級RNA轉(zhuǎn)錄本剪輯ATGTAA5’-UTR3’-UTRRNA起點(diǎn)mRNA外顯子內(nèi)含子目前三十一頁\總數(shù)六十一頁\編于十六點(diǎn)

二.基因工程原理1.基因工程誕生的基礎(chǔ)

（1）基因工程誕生的理論基礎(chǔ)a.在上世紀(jì)40年代確定了遺傳信息的攜帶者，即基因的分子載體是DNA而不是蛋白質(zhì)，從而明確了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)問題。

b.在上一世紀(jì)50年代揭示了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制機(jī)理，從而解決了基因的自我復(fù)制和遺傳傳遞的問題。

c.在上世紀(jì)50年代末期和60年代初期，科學(xué)工作者相繼提出了“中心法則”、“操縱子學(xué)說”，并成功地破譯了遺傳密碼，從而闡明了遺傳信息流向和表達(dá)的問題。

目前三十二頁\總數(shù)六十一頁\編于十六點(diǎn)小結(jié)：基因工程誕生的理論基礎(chǔ)是

（a）基因的分子載體是DNA而不是蛋白質(zhì)，

從而解決了遺傳物質(zhì)的基礎(chǔ)問題。

（b）DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制機(jī)理，

從而解決了基因的自我復(fù)制和遺傳傳遞問題。

（c）“中心法則”、“操縱子學(xué)說”和遺傳密碼的破譯，

從而解決了遺傳信息的流向和表達(dá)問題。目前三十三頁\總數(shù)六十一頁\編于十六點(diǎn)（2）基因工程誕生的技術(shù)基礎(chǔ)：（a）DNA分子體外切割與連接技術(shù)的建立；

（b）DNA分子核苷酸序列測定方法的發(fā)明；

（c）大腸桿菌遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的建立；

（d）瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)的建立與應(yīng)用；

（e）核酸雜交技術(shù)的建立，(DNA片段的分離和酶切圖譜的構(gòu)建等)(Southern和Northern雜交術(shù))。目前三十四頁\總數(shù)六十一頁\編于十六點(diǎn)2.基因工程（Geneengineering或geneticengineering）

定義：在體外試管中應(yīng)用DNA重組技術(shù)將外源核酸分子（基因）插入病毒、質(zhì)粒或其他載體分子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)重組體，并使之轉(zhuǎn)移到原本沒有這類分子（基因）的受體細(xì)胞內(nèi)，而能持續(xù)穩(wěn)定地繁殖與表達(dá)。這樣的過程叫做基因工程，有時也叫做遺傳工程。目前三十五頁\總數(shù)六十一頁\編于十六點(diǎn)

（1）基因克隆與DNA克隆a.在DNA克隆中插入載體的DNA片段，絕大多數(shù)是不含有基因編碼序列的，或者說是不含有完整的基因編碼序列的。b.拿人的基因組DNA為例，全長達(dá)3×109bP

，但其中基因的編碼序列不到2%。因此絕大多數(shù)DNA片段是不含有基因編碼序列的。b.基因克隆實質(zhì)上是指應(yīng)用類似于DNA克隆的技術(shù)，分離純化含目的基因的DNA片段的實驗操作過程。目前三十六頁\總數(shù)六十一頁\編于十六點(diǎn)

（2）“克隆”一詞的概念

在中文中“克隆”一詞兼具名詞、動詞和形容詞三種不同詞義?！翱寺　弊髅~使用時，是指從一個共同的祖先無性繁殖而來的一群遺傳同一的DNA分子、細(xì)胞或個體組成的特殊的生命群體；“克隆”作為動詞使用時，則是指從同一祖先經(jīng)過無性繁殖產(chǎn)生這類遺傳上同一的DNA分子、細(xì)胞或個體的過程；

在中文中“克隆”還可作為形容詞使用。例如克隆羊（Clonedsheep）。目前三十七頁\總數(shù)六十一頁\編于十六點(diǎn)（3）名詞“克隆”的三種層次：個體水平┈具有相同基因型的同一物種的兩個或多個個體。例如從同一個受精卵分裂而來的同卵雙生子（monozygotictwins），便是屬于同一克??；細(xì)胞水平┈從同一個祖細(xì)胞分裂而來的一群遺傳上同一的細(xì)胞群體。（在細(xì)胞學(xué)、胚胎學(xué)中使用）；分子水平┈在分子生物學(xué)中特指帶有一段插入DNA的載體分子/寄主細(xì)胞單位。例如大腸桿菌寄主細(xì)胞中的重組質(zhì)粒載體，叫做克隆。目前三十八頁\總數(shù)六十一頁\編于十六點(diǎn)（4）基因克隆步驟：

從所選用的實驗材料中分離、純化基因組DNA，經(jīng)適

當(dāng)限制酶消化切割，產(chǎn)生出DNA限制片段群體

↓（限制片斷切割）

在體外試管中將片段群體連接到載體分子上，形成重

組DNA分子（重組體）混合物

↓（體外重組）將此重組DNA分子混合物轉(zhuǎn)化到適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞，進(jìn)行復(fù)制與繁殖

↓（遺傳轉(zhuǎn)化）從大量的轉(zhuǎn)化細(xì)胞群體（即DNA文庫），篩選出獲得重組DNA分子（含目的基因）的轉(zhuǎn)化子克隆

↓（轉(zhuǎn)化子克隆的篩選）從這些轉(zhuǎn)化子克隆中，提取己經(jīng)得到擴(kuò)增的目的基因，供進(jìn)一步研究用

↓（目的基因分離）將目的基因亞克隆在表達(dá)載體上，導(dǎo)入受體細(xì)胞，使之在新的遺傳背景下實現(xiàn)功能表達(dá)，產(chǎn)生出人類需要的產(chǎn)品（目的基因的表達(dá)）。目前三十九頁\總數(shù)六十一頁\編于十六點(diǎn)3.核酸內(nèi)切限制酶-DNA分子的“剪刀”（1）定義：核酸內(nèi)切限制酶（Restrictionendonuclease），又叫做限制酶（Restrictionenzyme），是一類能夠識別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割雙鏈DNA分子的核酸內(nèi)切酶。因此有人形像地將核酸內(nèi)切限制酶形象地比作DNA分子的剪刀。自然界中存在著大量的核酸內(nèi)切限制酶，迄今已經(jīng)從各種不同的微生物中分離純化出三千多種的核酸內(nèi)切限制酶。它們總共能夠識別200種左右的不同的特異性識別序列。 目前四十頁\總數(shù)六十一頁\編于十六點(diǎn)（2）幾種常用限制酶的識別序列

BamHI5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’HindIII5’-AAGCTT-3’

3’-TTCGAA-5’

PstI5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’目前四十一頁\總數(shù)六十一頁\編于十六點(diǎn)（3）DNA分子的體外切割

a.體外切割――在體外的反應(yīng)體系中，在一定溫度下保溫（一般是37℃），核酸內(nèi)切限制酶便可以對雙鏈DNA分子進(jìn)行切割作用。這種反應(yīng)也叫作消化作用，或酶切消化作用。b.粘性末端――DNA分子在限制酶作用下形成的，具有互補(bǔ)堿基的單鏈末端結(jié)構(gòu)，它們之間可以通過互補(bǔ)堿基間的配對作用而重新連接起來。

目前四十二頁\總數(shù)六十一頁\編于十六點(diǎn)c.EcRI酶切（識別位點(diǎn)為GAATTC）后，

形成5，-P的單鏈粘性末端5’-GAGATCTTGAATTC

ATAAGTC-3’3’-CTCTAGAACTTAAG

TATTCAG-5’5’-GAGATCTTG-3，

3’-CTCTAGAACTTAA-P-5，＋

5，-P-AATTCATAAGTC-3’3，-GTATTCAG-5，目前四十三頁\總數(shù)六十一頁\編于十六點(diǎn)d.PstⅠ的識別位點(diǎn)及切割形成的

3，-OH單鏈粘性末端↓5‘-GGCCTTCTGCAGAATCGG-3'3'-CCGGAAGACGTCTTAGCC-5‘

↑

↓

5'-GGCCTTCTGC-A-0H-3'3‘-CCGGAAG

＋

GAATCGG-3'

3'-0H-ACGT

CTTAGCC-5‘

目前四十四頁\總數(shù)六十一頁\編于十六點(diǎn)（4）同裂酶、同尾酶和異裂酶a.同裂酶（Isoschizomers)具有同樣的識別位點(diǎn)，產(chǎn)生同樣的粘性末端，但是從不同的細(xì)分離出來的，因而具有不同名稱的一類核酸內(nèi)切限制酶。例如HpaⅡ和MspⅠ就是一對具有同樣識別序列：的同裂同裂酶形成同樣的粘性末端，重組后識別序列不變！b.同尾酶（Isocaudamers）一組來源不同、識別序列各異，但能夠切割形成相同粘性末端的核酸內(nèi)切限制酶。例如BanHⅠ、BaglⅡ和Sau3A，即是組同尾酶，目前四十五頁\總數(shù)六十一頁\編于十六點(diǎn)

（5）DNA連接酶（1）連接酶――能夠利用ATP分子中γ-磷酸集團(tuán)的能量，通過催化兩條并排的DNA鏈的5’-P-集團(tuán)和3’-OH集團(tuán)之間形成一個磷酸二酯鍵，而使兩個DNA片段共價連接起來的核酸酶。（2）連接條件：

a.

被連接的兩條DNA片段，一條鏈的3’-末端具有一個游離的-OH集團(tuán)；另一條的5’-末端存在一個磷酸集團(tuán)（P）。b.

在-OH和-P集團(tuán)之間形成磷酸二酯鍵是一種需要能量的過程（ATP）。c.最佳連接溫度：4～16℃。目前四十六頁\總數(shù)六十一頁\編于十六點(diǎn)4.基因克隆的載體（1）基因克隆載體的類型：

（a）質(zhì)粒載體；

（b）柯斯質(zhì)粒載體；

（c）λ噬菌體載體；

（d）單鏈?zhǔn)删w載體；

（e）噬菌粒載體；

（f）酵母人工染色體載體

（g）YAC后載體目前四十七頁\總數(shù)六十一頁\編于十六點(diǎn)（2）質(zhì)粒載體

（a）質(zhì)粒（Plasmid）的定義

一般指一類獨(dú)立于細(xì)菌染色體DNA（染色體外）的自主

復(fù)制的共價、閉合、環(huán)形雙鏈的DNA分子。（b）質(zhì)粒的一般特性

共價、閉合、環(huán)形雙鏈的DNA分子（covalentlyclosedcirculerDNA,cccDNA）除了酵母殺傷質(zhì)粒RNA外，所有的質(zhì)粒都是DNA。

質(zhì)粒DNA的復(fù)制必須依賴于寄主細(xì)胞提供核酸酶及其他蛋白質(zhì)分子。目前四十八頁\總數(shù)六十一頁\編于十六點(diǎn)

（3）質(zhì)粒DNA的分子構(gòu)型a.sc構(gòu)型……即cccDNA所呈現(xiàn)的超螺旋構(gòu)型，走在凝膠的最前面；b.OC構(gòu)型……即開環(huán)DNA（OCDNA）的構(gòu)型，其中一條DNA鏈保持完整的環(huán)形結(jié)構(gòu)，另一條鏈則出現(xiàn)一至數(shù)個缺口，走在凝膠的最后面；c.L構(gòu)型……發(fā)生雙鏈斷裂形成的線性DNA的構(gòu)型。通稱L型，走在凝膠的中間部位。目前四十九頁\總數(shù)六十一頁\編于十六點(diǎn)（4）質(zhì)粒載體必須具備的條件a.一般具有l(wèi)個復(fù)制區(qū)或復(fù)制因子；b.具有l(wèi)到2個抗生素抗性基因（供選擇重組子）；c.具有若干種核酸內(nèi)切限制酶的單個切點(diǎn)

（供外源DNA片段的插入）；d.較小的分子量和較高的拷貝數(shù)

（質(zhì)粒載體的克隆能力約5-6kb）。目前五十頁\總數(shù)六十一頁