第四章 抗生素的提取和純化

第四章抗生素的提取和純化第1頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三4.1概述生物合成藥物的分離純化，目的在于從發(fā)酵液或培養(yǎng)液中分離純化具有一定純度、符合藥典或其他法定標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的各種藥物，又稱發(fā)酵液的后處理或下游加工過程。這是個(gè)非常繁復(fù)的過程.生物合成藥物的一般分離純化方法第2頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三4.2發(fā)酵液的預(yù)處理發(fā)酵(培養(yǎng))液的預(yù)處理根據(jù)所要獲得的目標(biāo)物質(zhì)性質(zhì)的不同，預(yù)處理方法也不同，比如對(duì)酸、堿和熱的穩(wěn)定性，是蛋白質(zhì)還是非蛋白質(zhì)等。以下為以抗生素為目標(biāo)產(chǎn)物的發(fā)酵液的處理。雜質(zhì)：①可溶性膠體物體，其中主要是雜蛋白、多糖和核酸②含有高價(jià)金屬離子的無機(jī)鹽這些雜質(zhì)不僅使發(fā)酵液粘度增大，降低液固分離速度，還會(huì)影響到后續(xù)的提取與純化工作和產(chǎn)品質(zhì)量。因此應(yīng)通過預(yù)處理的方法，盡可能的去除這些雜質(zhì)。第3頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三4.2發(fā)酵液的預(yù)處理和固液分離微生物細(xì)胞的破碎由微生物產(chǎn)生的產(chǎn)物，大都處于細(xì)胞內(nèi)部，要分離和提取這些產(chǎn)物，則首先需要收集菌體，進(jìn)行細(xì)胞破碎。破碎細(xì)胞的方法：①機(jī)械法有高壓勻漿法、高速珠磨法及超聲波法。②非機(jī)械法有化學(xué)滲透法、酶解法、凍結(jié)一融化法、干燥法等。第4頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三4.2發(fā)酵液的預(yù)處理①調(diào)整pH值改變發(fā)酵液的膠體狀態(tài)，使產(chǎn)物轉(zhuǎn)入液相。②高價(jià)金屬離子的去除：如加入草酸調(diào)pH的同時(shí)可以去除Ca2+

，加入三聚磷酸鈉可以去除Mg2+,黃血鹽可以去除Fe3+。③雜蛋白質(zhì)的去除方法主要有：等電點(diǎn)沉淀法（蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低）、變性沉淀法（常用加熱法）、加各種沉淀劑沉淀（三氯乙酸、水楊酸、鞣酸或者Cu2+、Zn2+、Fe3+

）、加絮凝劑(殼聚糖、海藻酸鈉、聚丙烯酰銨等)。

第5頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三4.2發(fā)酵液的預(yù)處理④多糖的去除方法：可用酶將其轉(zhuǎn)化為單糖，降低粘度，提高過濾速度⑤發(fā)酵液中有色物質(zhì)的去除，常用吸附法（離子交換樹脂、離子交換纖維、活性炭）。第6頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三4.3發(fā)酵(培養(yǎng))液的固液分離常見方法有過濾和離心。常見的過濾設(shè)備有真空鼓式過濾機(jī)和板框壓濾機(jī)，常見的離心設(shè)備有管式離心機(jī)、碟片式離心機(jī)、傾析式離心機(jī)、第7頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三4.4抗生素的提取提取的目的是從發(fā)酵液中制取高純度的符合藥典規(guī)定的抗生素成品。由于多數(shù)抗生素不很穩(wěn)定，且發(fā)酵易被污染，故整個(gè)過程要求：時(shí)間短、強(qiáng)度低、pH宜選擇合適的范圍、勤清洗消毒。常用的提取方法：溶媒萃取法、離子交換法、吸附法、沉淀法第8頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三4.4.1溶媒萃取法一、溶媒萃取法是用一種溶劑將物質(zhì)從另一種溶液中提取出來的方法，這兩種溶劑不能互溶或只部分互溶，能形成便于分離的兩相。有機(jī)相水相第9頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三分配系數(shù)K0當(dāng)體系達(dá)到平衡時(shí)，溶質(zhì)在兩相中的濃度比:K0=C1/C2分配定律須符合下列條件:1.必須是稀溶液;2.溶質(zhì)對(duì)溶劑的互溶沒有影響;3.溶質(zhì)在兩相中必須為同一種分子類型，即不發(fā)生締合或離解。第10頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三二、萃取方式單級(jí)萃取只有一個(gè)混合器和一個(gè)分離器的萃取。混合器分離器sLFR第11頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三二、萃取方式多級(jí)錯(cuò)流萃取是由數(shù)個(gè)萃取器串聯(lián)組成，料液經(jīng)萃取后的萃余液依次流人下一萃取器用新鮮萃取劑繼續(xù)萃取第12頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三二、萃取方式多級(jí)逆流萃取由多個(gè)萃取器串聯(lián)組成，其特點(diǎn)是料液與萃取劑分別由兩端加入，溶劑與料液互成逆流接觸，故稱多級(jí)逆流萃取。此法收率最高，溶劑用量最小，工業(yè)普遍采用。第13頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三三、乳化現(xiàn)象和去乳化

乳化現(xiàn)象有機(jī)相乳化層水相2）乳狀液及其類型乳狀液——一種液體以細(xì)小液滴分散在另一種互不相溶的液體中所構(gòu)成的分散體系，也稱乳濁液。類型——油包水（W/O）型和水包油（O/W）型兩大類第14頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三三、乳化與去乳化乳狀液的消除方法：⑴加熱升高溫度⑵加入電解質(zhì)，利用電解質(zhì)來中和乳狀液分散相所帶的電荷而促使其聚沉。(3)吸附過濾，由于乳狀液中的溶劑相與水相對(duì)吸附介質(zhì)的潤濕性不同，其中水分被吸附也可引起去乳化作用。(4)加入去乳化劑，最主要的破乳化方法。第15頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三四、影響溶媒萃取的

主要因素(1)pH值正確選擇pH值要考慮會(huì)影響弱酸或弱堿性產(chǎn)物的分配系數(shù)，及對(duì)產(chǎn)物的穩(wěn)定性的影響。(2)溫度隨溫度的升高，使萃取效果降低；產(chǎn)物一般在高溫下不穩(wěn)定，因此萃取一般應(yīng)在低溫下進(jìn)行。(3)鹽析作用氯化鈉、硫酸鐵等鹽析劑的影響有三個(gè)方面:①導(dǎo)致游離水分減少，降低了產(chǎn)物在水中的溶解度;②鹽析劑能降低有機(jī)溶劑在水中的溶解度;③鹽析劑能使萃余相密度增大，有助于相分離。但鹽析劑用量要適當(dāng)，過多會(huì)使雜質(zhì)轉(zhuǎn)入有機(jī)溶劑相中。(4)溶劑的選擇應(yīng)有以下特性:①K０要大，對(duì)雜質(zhì)的分離因素要大于1;②溶劑與料液的互溶度要小;③化學(xué)穩(wěn)定性高，揮發(fā)性小，安全低毒;④回收處理方便，價(jià)廉易得。第16頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三4.4.2離子交換法離子交換法是利用某些生物藥物能在溶液中形成帶電粒子，與合成離子交換樹脂之間結(jié)合力的差異來進(jìn)行分離的方法。帶電粒子與離子支換樹脂間的作用力是靜電力，它們的結(jié)合是可逆的。一、離子交換法的基本概念

二、離子交換的機(jī)理與速度三、樹脂和操作條件的選擇四、大網(wǎng)格離子交換樹脂第17頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三離子交換過程離子交換：R—A++B+=R—B++A+洗脫：R—B++C+=R—C++B+再生：R-—C++A+=R—A++C+第18頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三一、離子交換法的基本概念離子交換樹脂是一種具有網(wǎng)狀立體結(jié)構(gòu)的高分子多元酸或多元堿的聚合物。離子交換樹脂的分類（1）強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂以磺酸基作為活性基團(tuán)，在pH1－14范圍內(nèi)均能進(jìn)行離子交換反應(yīng)。典型反應(yīng)：（2）弱酸性陽離子交換樹脂這類樹脂的活性基團(tuán)主要有羧酸基和酚羥基等，交換能力隨溶液的pH升高而遞增。對(duì)于羧酸型樹脂只有在pH＞7的溶液中才能正常進(jìn)行，而對(duì)于酚羥基型樹脂，溶液的pH值應(yīng)大于9。典型交換反應(yīng)為：第19頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三一、離子交換法的基本概念（3）強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂活性基團(tuán)有兩種：一種含三甲氨基稱為強(qiáng)堿I型，另一種含二甲基–β–羥基–乙基氨基稱為強(qiáng)堿II型。使用的pH值沒有限制，其典型的交換反應(yīng)如下：

（4）弱堿性陰離子交換樹脂活性基團(tuán)有伯胺、仲胺、和叔胺以及吡啶等。其交換能力隨pH值的變化而變化，pH值愈低交換能力愈大。其典型的交換反應(yīng)如下：

第20頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三

二、離子交換樹脂的理化性質(zhì)外觀珠球形顆粒度（粒度）顆粒度是指樹脂顆粒在溶脹狀態(tài)下的直徑大小,粒度小其交換速度快，但流體阻力增加，粒度過大會(huì)使交換速度降低。膨脹性確定樹脂裝填量時(shí)應(yīng)考慮到其膨脹性能。密度干樹脂的密度稱真密度，而膨脹樹脂酌密皮稱視密度，由視密度可以估計(jì)樹脂的裝填量和離子交換柱所承受的壓力。交聯(lián)度

指離子交換樹脂中交聯(lián)劑（二乙烯苯簡稱DVB）含量的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。一般來說交聯(lián)度大，機(jī)械強(qiáng)度高，樹脂的孔度小，大分子的物質(zhì)就不易被交換。交換容量

表征樹脂交換能力的重要參數(shù)。所謂交換容量是指一定量樹脂所能交換離子的毫克當(dāng)量數(shù)（meq），其表示方法有質(zhì)量交換容量（meq/g干樹脂）和體積交換容量（meq/ml濕樹脂）兩種。第21頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三三、離子交換的機(jī)理與速度交換機(jī)理

:A離子自溶液擴(kuò)散到樹脂表面(膜擴(kuò)散)A離子自樹脂表面再擴(kuò)散到樹脂內(nèi)部的活性中心(粒子擴(kuò)散)A離子與樹脂活性中心RB上的B離子進(jìn)行交換反應(yīng)B離子自活性中心擴(kuò)散到樹脂表面B離子再從樹脂表面擴(kuò)散到溶液中。影響交換速度的因素：（1）樹脂的粒度與交聯(lián)度減少樹脂的粒度，有利于交換速度的提高。（2）離子的大小與化合價(jià)離子的水合半徑增大，交換速度下降。（3）溶液的濃度交換體系如果是稀溶液（0.001mol／L離子價(jià)數(shù)），交換速度隨離于濃度的上升而增大，但達(dá)到一定濃度（0.01mol／L離子價(jià)數(shù)）后，交換速度不再隨濃度上升而增大。（4）攪拌速度與溫度攪拌能影響膜擴(kuò)散速度，加快攪速會(huì)使交換速度增加。溫度升高，交換速度增大，溫度從25℃上升至50℃，交換速度約提高1倍。第22頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三四、樹脂和操作條件的選擇樹脂的選擇對(duì)強(qiáng)堿性產(chǎn)物宜選用弱酸性樹脂。對(duì)弱堿性產(chǎn)物宜選用強(qiáng)酸性樹脂；同理，弱酸產(chǎn)物宜用強(qiáng)堿性樹脂，強(qiáng)酸性產(chǎn)物宜用弱堿性樹脂。對(duì)樹脂的選擇還應(yīng)要求對(duì)產(chǎn)物與主要雜質(zhì)的吸附力有足夠的差異。離子交換操作條件的選擇（1）交換（吸附）：選取交換過程的pH值。合適的pH值應(yīng)在產(chǎn)物穩(wěn)定的范圍內(nèi)，并能使產(chǎn)物離子化和樹脂活性功能基解離。（2）洗脫（解吸）選擇合適的洗滌劑如水、稀酸、鹽或其他絡(luò)合劑來洗凈交換廢液及夾帶的雜質(zhì)。（3）樹脂的再生第23頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三4.4.3吸附法

吸附法是利用一些吸附劑，在適宜的pH條件下，使發(fā)酵液中所需的產(chǎn)物被吸附劑吸附，然后再用適當(dāng)?shù)南疵搫a(chǎn)物解吸，以達(dá)到濃縮和提純的日的。吸附法的基本概念影響吸附過程的因素幾種常用的吸附劑大網(wǎng)格聚合物吸附劑及其應(yīng)用第24頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三一、吸附法的基本概念

吸附作用：固體內(nèi)部的分子（或原子）受到鄰近分子的作用力是對(duì)稱的，故分子處干平衡狀態(tài)。界面上的分子，受力是不對(duì)稱的，處于不平衡狀態(tài)。，因此能從外界（液相）吸附分子、原子或離子，從而達(dá)到分離的過程稱為吸附作用。吸附的類型:（l）物理吸附

這是吸附劑和吸附物通過分子間引力所產(chǎn)生的吸附作用。（2）化學(xué)吸附由吸附劑和吸附物之間生成化學(xué)鍵，發(fā)生了化學(xué)反應(yīng)所產(chǎn)生的吸附作用。

（3）離子交換吸附

第25頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三二、影響吸附過程的因素

吸附劑的性質(zhì)：（l）表面積：空隙度越高，比表面積越大，吸附容量就越大。（2）顆粒和孔徑分布：顆粒度越小，吸附速度就越快。（3）對(duì)極性化合物應(yīng)選用極性吸附劑，對(duì)非極性化合物應(yīng)選用非極性吸附劑。吸附物的性質(zhì)：（l）溶解度：吸附物在介質(zhì)中的溶解度愈小，則愈易被吸附。溶劑和溫度的影響：溫度會(huì)影響吸附物的溶解度，其溶解度隨溫度升高而增大的則不利于吸附，反之則有利于吸附。pH值和其他組分的影響：控制某些化合物pH的解離度，使溶液中的化合物呈分子狀態(tài)

第26頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三三、幾種常用的吸附劑

有機(jī)吸附劑如活性炭、纖維素，聚酰胺，大孔樹脂等。無機(jī)吸附劑如白土、氧化鋁、硅藻土等。第27頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三4.4.4沉淀法

利用某些沉淀劑使所需產(chǎn)物在溶液中生成難溶性的無定形固體而沉降析出，此法有時(shí)也可用于雜質(zhì)的去除。一、鹽析沉淀法二、有機(jī)溶劑沉淀法三、等電點(diǎn)沉淀法四、其他沉淀方法第28頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三一、

鹽析沉淀法

鹽析法的基本原理鹽析法主要適用于酶、蛋白質(zhì)等生物大分子物質(zhì)。在高濃度中性鹽存在下，它們在水溶液中的溶解度降低而產(chǎn)生沉淀，稱為鹽析法。機(jī)理：高濃度的中性鹽中存在著大量帶電荷的鹽離子，可中和酶和蛋白質(zhì)等生物大分子表面的電荷，使雙電層受損，破壞了分子外圍的水化層。大量鹽離子自身的水合作用降低了自由水的濃度，削弱了水化層。鹽析劑的種類與用量幾種鹽析效果排序?yàn)椋篗gSO4,(NH4)２SO4,NaH2PO4。一般含有多價(jià)陰離子的中性鹽的鹽析效果較好。工業(yè)生產(chǎn)上用得最多的鹽析劑是(NH4)２SO4。第29頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三二、有機(jī)溶劑沉淀法概念：在水溶液中加入一定量親水性有機(jī)溶劑，降低溶質(zhì)的溶解度，使其沉淀析出的方法。常用于蛋白質(zhì)、酶、核酸、多糖等物質(zhì)的分離。機(jī)理：與蛋白質(zhì)或酶在有機(jī)溶劑作用下，其空問結(jié)構(gòu)發(fā)生某種程度的變形，使疏水基團(tuán)盡露于表面，并與有機(jī)溶劑的疏水基團(tuán)結(jié)合形成疏水層而沉淀。影響沉淀的因素（1）溶劑的種類和用量常用甲醇、乙醇、異丙醇和丙酮等，乙醇是最常用。（2）沉淀的溫度和pH值①有機(jī)溶劑與水混合產(chǎn)生的溶解熱，易使蛋白質(zhì)變性，沉淀過程應(yīng)注意冷卻降溫，且低溫也有利于沉淀。②沉淀pH值應(yīng)首先滿足蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的條件。（3）溶液中的鹽類和金屬離子少量中性鹽的存在，由于鹽溶作用會(huì)增大蛋白質(zhì)的溶解度，所以用有機(jī)溶劑沉淀時(shí)應(yīng)減少無機(jī)鹽第30頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三

三、等電點(diǎn)法主要用于兩性電解質(zhì)產(chǎn)物，它們在等電點(diǎn)時(shí)的凈電荷為零，分子間排斥電位降低，因而吸引力增大，相互聚集起來產(chǎn)生沉淀。四、其他沉淀方法：形成難溶性鹽或復(fù)合物的沉淀法加高分子聚合物沉淀第31頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三4.5抗生素的精制色譜分離法脫色和去熱原質(zhì)結(jié)晶和重結(jié)晶膜分離法成品干燥第32頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三4.5.1色譜分離法

（Chromatography）

一、概述定義——也稱色譜層析、色譜、色層；是利用混合物中各組分理化性質(zhì)的差異，使其在相對(duì)運(yùn)動(dòng)著的兩相間經(jīng)反復(fù)多次分配，以不同速度移動(dòng)，從而獲得分離的方法。。特點(diǎn)——分離精度高、適用范圍廣、設(shè)備簡單、操作方便；處理量小、間歇操作等發(fā)展史——1903年一位俄國植物學(xué)家首次提出。1931年首次應(yīng)用于制備；1938年適用范圍擴(kuò)展至無色物質(zhì)；……

第33頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三石油醚CaCO3顆粒植物葉石油醚提取物石油醚CaCO3顆粒1903年俄國植物學(xué)家Tswett實(shí)驗(yàn)示意圖葉綠素葉黃素胡蘿卜素石油醚第34頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三二、色譜法分類分離機(jī)理吸附層析——物質(zhì)吸附力差異分配層析——物質(zhì)分配系數(shù)差異凝膠層析——物質(zhì)分子量差異第35頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三吸附層析的種類物理吸附層析離子交換層析親和層析疏水作用層析金屬螯合層析有機(jī)染料層析第36頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三2.按兩相所處的狀態(tài)分；①液相色譜以液體作為流動(dòng)相，可分為液－固色譜及液－液色譜；②氣相色譜以氣體作為流動(dòng)相，可分為氣－固色譜及氣－液色譜。3.按操作形式分①柱色譜將固定相裝在柱內(nèi)，使混合物溶液沿一個(gè)方向移動(dòng)而得以分離；②紙色譜用濾紙作為固定相載體，混合物溶液點(diǎn)樣后，用流動(dòng)相展開，以達(dá)到分離鑒定的目的；③薄層色譜在玻璃板（或其他材料）上涂布固體粉末薄層為固定相，點(diǎn)樣后用流動(dòng)相展開，以達(dá)到分離鑒定的目的。色譜法分類第37頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三三、柱層析系統(tǒng)

工藝流程圖第38頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三4.5.2結(jié)晶與重結(jié)晶21．9．1結(jié)晶的基本原理

結(jié)晶是指溶質(zhì)自動(dòng)從過飽和溶液中析出形成新相的過程。同時(shí)由于表面分子化學(xué)鍵力的變化使分子有規(guī)律地排列在一定的晶格中，形成固體。21．9．2結(jié)晶過程的步驟(1)過飽和溶液的形成(2)晶核的形成(3)晶體的成長影響晶體大小的因素主要有溶液的過飽和度、溫度、攪拌速度等。21．9．3重結(jié)晶重結(jié)晶就是將晶體用合適的溶劑溶解后再次進(jìn)行結(jié)晶，以提高純度。重結(jié)晶的關(guān)鍵是選擇合適的溶劑。第39頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三二、結(jié)晶的過程過飽和溶液的形成→晶核形成→晶體生長

第40頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三4.5.3膜過濾

膜分離是利用天然或人工合成的半透性高分子薄膜，以外界能量或化學(xué)位差為推動(dòng)力，對(duì)多組分混合物進(jìn)行分離、提純和富集的方法。膜過濾就是其中的一種，它是利用流體壓力差作為椎動(dòng)力的篩分分離方法。膜過濾的類型及其特點(diǎn)：見下頁表第41頁，共4