第十章 白細胞檢驗的基本方法

第十章白細胞檢驗的基本方法第1頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三第一節(jié)白細胞功能檢驗一、墨汁吞噬試驗

二、白細胞吞噬功能試驗

三、血清溶菌酶活性試驗四、硝基四氮唑藍還原試驗

五、白細胞趨化性試驗六、吞噬細胞吞噬功能試驗第一節(jié)第2頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三

一、墨汁吞噬試驗【原理】血液中中性粒細胞及單核細胞對細菌、異物等具有吞噬作用。在一定量的肝素抗凝血中，加人一定量的墨汁，經(jīng)37℃溫育4小時，涂片染色鏡下觀察吞噬細胞對墨汁的吞噬情況，并計算吞噬率及吞噬指數(shù)?！緟⒖贾怠砍墒熘行粤＜毎淌陕?4％±15％，吞噬指數(shù)126±60；成熟單核細胞吞噬率95％±15％，吞噬指數(shù)313±86。下一頁第一節(jié)第3頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三第一節(jié)

【臨床評價】粒細胞的吞噬功能僅限于成熟階段，單核細胞幼稚型和成熟型都具有吞噬能力。急性單核細胞白血病M5a為弱陽性，M5b吞噬指數(shù)明顯增高。急性粒細胞白血?。∕2）、急性淋巴細胞白血病和急性早幼粒細胞白血病的原始及幼稚細胞多無吞噬能力，吞噬試驗為陰性。急性粒-單核細胞白血病呈陽性反應(yīng)，對鑒別有一定價值。慢性粒細胞白血病的成熟中性粒細胞吞噬能力明顯減低。

上一頁下一頁第4頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三M5骨髓象的墨汁吞噬試驗返回第一節(jié)第5頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三二、白細胞吞噬功能試驗【原理】分離白細胞懸液，將待測的吞噬細胞與某種可被吞噬而又易于查見計數(shù)的顆粒物質(zhì)如葡萄球菌混合，溫育一定時間后，細菌可被中性粒細胞吞噬，可在鏡下觀察中性粒細胞吞噬細菌的情況，根據(jù)吞噬率和吞噬指數(shù)即可反映吞噬細胞的吞噬功能。下一頁第一節(jié)第6頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三【參考值】1.吞噬率（％）=吞噬細菌的細胞數(shù)／200個（中性粒細胞）X100％；正常人為628％±114％2.吞噬指數(shù)＝200各中性粒細胞吞噬細胞總數(shù)／200個（中性粒細胞）；正常人為1.06±0.05上一頁下一頁第一節(jié)第7頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三【臨床評價】吞噬細胞分大吞噬細胞和吞噬細胞兩大類。前者包括組織中的巨噬細胞和血循環(huán)中的大單核細胞，后者主要是中性粒細胞。本試驗可了解中性粒細胞的吞噬功能。如吞噬率和吞噬指數(shù)增高，反映中性粒細胞吞噬異物功能的增強，常見于細菌性感染。對疑有中性粒細胞吞噬功能低下者，有幫助確診的價值。上一頁第一節(jié)返回第8頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三三、血清溶菌酶活性試驗【原理】溶菌酶能水解革蘭氏陽性球菌的細胞壁乙酰氨基多糖成分，使細胞失去細胞壁而破裂。以對溶菌酶較敏感的微球菌懸液為作用底物，根據(jù)微球菌的溶解程度來檢測血清或尿中溶菌酶的活性。【參考值】血清（5－15）mg／L尿（0－2）mg／L（比濁法）下一頁第一節(jié)第9頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三

【臨床評價】

l.血清溶菌酶含量增高可見于部分急性髓細胞白血病。①急性單核細胞白血病

②急性粒-單核細胞白血病

③急性粒細胞白血病

2．血清溶菌酶含量減低急性淋巴細胞白血病多數(shù)減低，少數(shù)正常。慢性粒細胞白血病血清溶菌酶含量正常，但急變時下降。上一頁第一節(jié)返回第10頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三四、硝基四氮唑藍還原試驗【原理】硝基四氮唑藍（NBT）是一種染料，其水溶性呈淡黃色。當(dāng)被吞入或摻入中性白細胞后，有產(chǎn)生過氧化物酶的作用，可接受葡萄糖中間代謝產(chǎn)物葡萄糖-6-磷酸在已糖磷酸旁路代謝中NADPH氧化脫下的氫，而被還原成非水溶性的藍黑色甲顆粒，呈點狀或片狀沉著在胞漿內(nèi)有酶活性的部位，可在顯微鏡下觀察并計數(shù)陽性細胞百分比。【參考值】正常成人的陽性細胞數(shù)在10％以下。若有10％以上中性粒細胞能還原NBT，即為NBT還原試驗陽性；低于10％則為陰性。下一頁第一節(jié)第11頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三【臨床評價】1.用于中性粒細胞吞噬殺菌功能異常的過篩鑒別和輔助診斷兒童慢性肉芽腫，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥，髓過氧化物酶缺乏癥和Job綜合征，NBT還原試驗陽性。

上一頁第一節(jié)2.用于細菌感染的鑒別3.器官移植后發(fā)熱的鑒別4.無丙種球蛋白血癥、鐮狀細胞病、惡性營養(yǎng)不良等NBT還原陽性細胞比例可降低。5．新生兒、小兒成骨不全癥、心肌梗死急性期、淋巴肉瘤、NBT還原陽性細胞比例可增高。返回第12頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三五、白細胞趨化性試驗【原理】在微孔濾膜的一側(cè)放入粒細胞，另一側(cè)放入趨化因子（細菌毒素、補體C3a、淋巴因子等），檢測離體粒細胞潛過濾膜到達趨化因子這一側(cè)定向移動的能力?！緟⒖贾怠口吇笖?shù)3.0－3.5下一頁第一節(jié)第13頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三

【臨床評價】趨化性是粒細胞到達炎癥局部所必需的。本試驗是觀察粒細胞向感染灶運動能力的一項重要檢測方法。趨化功能異?？梢娪赪iskot-Aldrich綜合征、幼年型牙周炎、糖尿病、燒傷、新生兒、慢性皮膚粘膜白色念珠菌病、高IgE綜合征、先天性魚鱗病、膜糖蛋白（相對分子質(zhì)量11000）缺陷癥、肌動蛋白功能不全癥、Chediak-Hisashi綜合征。上一頁第一節(jié)下一頁第14頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三Chediak-Hisashi綜合征血象骨髓象返回第一節(jié)第15頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三六、吞噬細胞吞噬功能試驗【原理】活體巨噬細胞、單核細胞在體內(nèi)外均有吞噬細菌、異物的功能，在體外將細胞與異體細胞或細菌混合孵育后，染色觀測其吞噬異體細胞或細菌的數(shù)量，可了解其吞噬功能。利用中藥斑螫在人的前臂皮膚上發(fā)皰，造成非感染性炎癥，誘使單核細胞游出血管大量聚集于皰液內(nèi)，抽取皰液則成為天然提純的吞噬細胞懸液。以雞紅細胞為靶細胞，在體外370C條件下觀察吞噬細胞對雞紅細胞的吞噬消化活性，取試管內(nèi)的細胞進行涂片染色和鏡檢并計算吞噬百分率和吞噬指數(shù)。

下一頁第一節(jié)第16頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三【參考值】吞噬百分率（62.77±1.38）％吞噬指數(shù)1.058±0.049【臨床評價】l.吞噬細胞吞噬功能低下主要見于各種惡性腫瘤，吞噬率常低于45％，手術(shù)切除好轉(zhuǎn)后可以上升，故可作為腫瘤病人化療、放療、免疫治療療效的參考指標(biāo)。2.一些免疫功能低下的病人，吞噬率降低，可作為預(yù)測感染發(fā)生的概率。并觀測療效、判斷預(yù)后的指標(biāo)。上一頁返回第一節(jié)第17頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三第二節(jié)白細胞代謝及其產(chǎn)物檢驗

一、末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶檢測

（一）酶標(biāo)免疫細胞化學(xué)顯示法

（二）同位素檢測法二、N-堿性磷酸酶檢測

三、酸性α-醋酸酯酶檢測第二節(jié)第18頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三【原理】末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶（TdT）是一種DNA聚合酶，它不需要模板的指導(dǎo)，就可以催化細胞的脫氧核苷酸，使其轉(zhuǎn)移到低聚核苷酸或多聚核苷酸的3’-OH端，合成單鏈DNA。兔抗牛TdT抗體能和人細胞的TdT產(chǎn)生交叉反應(yīng)，可采用免疫熒光技術(shù)或酶標(biāo)免疫細胞化學(xué)技術(shù)，用辣根過氧化物酶-抗酶復(fù)合物在細胞涂片上定位，顯示細胞內(nèi)的TdT?！窘Y(jié)果】陽性反應(yīng)為棕黃色顆粒，定位在細胞核上。TdT為早期T淋巴細胞的標(biāo)志，在正常情況下不成熟的胸腺淋巴細胞出現(xiàn)陽性反應(yīng)，正常人外周血細胞中極少或無活性。下一頁第二節(jié)第19頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三【臨床評價】95％以上急性淋巴細胞白血病和大約30％慢性粒細胞白血病急淋變患者外用血細胞有明顯的TdT活力，病情緩解后陽性率逐漸減弱。在急性淋巴細胞白血病中，由于細胞表面標(biāo)志不同,TdT活性也有變化，T-ALL，早B前體-ALL細胞的陽性率很高，B-ALL細胞陰性。當(dāng)外周血中此酶活性升高，就預(yù)示著血細胞的惡性變。因此TdT的測定對急性白血病的鑒別和治療都有一定意義。返回上一頁第二節(jié)第20頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三【原理】以3H或14C標(biāo)記的脫氧核苷三磷酸等的dXTP為基質(zhì)，用低聚脫氧核苷（dA）等人工同聚物作為引物，由于酶反應(yīng)與引物重合，使基質(zhì)不溶于三氯醋酸，可用玻璃纖維盤將其吸附，從未被放射性核素標(biāo)記的反應(yīng)基質(zhì)中分離出反應(yīng)的生成物，計測放射活性。除去不加引物所測定的內(nèi)源性反應(yīng)所引起的活性之后，可測算酶的活性。【參考值】正常人骨髓細胞的活性為dGTP摻入l×108個細胞的量為（0－0.09）mmol／L。下一頁第二節(jié)第21頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三

【臨床評價】1．急性淋巴細胞白血?。˙-ALL除外）可檢出較高的TdT活性，慢性粒細胞性白血病急性變時，約有1／3的病例在原始細胞中能檢出高活性的TdT。2．惡性淋巴瘤中，原始淋巴細胞性淋巴瘤的淋巴結(jié)細胞中能檢出高的TdT活性。3．此酶檢查在研究造血細胞的分化與白血病的關(guān)系、白血病細胞的起源、白血病的治療藥物選擇上都有較重要的價值。上一頁第二節(jié)返回第22頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三

【原理】用P-硝基酚磷酸鹽作為細胞堿性磷酸酶總活性檢測的基質(zhì)，在反應(yīng)中生成P-硝基酚，測量400nm時的吸光密度，借以檢測出細胞A-Pase的總活性。此外，可通過CASP作為基質(zhì)來測定N-堿性磷酸酶的活性。通過酶反應(yīng)，生成半胱胺，這是用二硝基苯置換5-硫-硝基酚酸；檢測412nm的吸光密度，借以檢測N-APase的總活性。在基質(zhì)液中加人用N-丁醇：水（1：3）的混合液提取粗酶液，室溫下放置60分鐘，記錄酶反應(yīng)，求出酶反應(yīng)的速度。一般情況下，N-APase的P-NPP與CASP的水解速度之比（VP-NPP／VCASP）在1.1－2.0的范圍內(nèi)，平均為1．8。因此，N-APase的活性可用VP-NPP-1.8VCASP求出，再從VP-NPP計算N-APase的百分率。下一頁第二節(jié)第23頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三【參考值】正常人的粒細胞、淋巴細胞中不能檢出N-APase的活性?！九R床評價】在AML及CML慢性期、CML急性變的原粒細胞中，均不能檢出N-APase。但在ALL和CML急淋變時，原始淋巴細胞能檢出N-APase，且不僅在非T-ALL、非B-ALL的幼稚細胞，就是在T-ALL及具有B細胞標(biāo)記物的原始細胞中亦可檢出。因此，認(rèn)為此酶是從未成熟的白血病性原始淋巴細胞向T細胞、B細胞分化過程中，未成熟的淋巴系統(tǒng)的細胞標(biāo)志酶。此外，在鼻咽癌、喉癌等被認(rèn)為是病毒感染的腫瘤細胞中，以及與EB病毒有關(guān)的傳染性單核細胞增多癥、Burkitt淋巴瘤等，均可檢出此酶。上一頁第二節(jié)下一頁第24頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三T細胞白血病的血象返回第25頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三【原理】血細胞中的酸性α-醋酸酯酶（ANAE），在弱酸性（pH5.8）條件下能將基質(zhì)液中的α-醋酸萘酯水解，產(chǎn)生α-萘酚。產(chǎn)生的α-萘酯酚再與六偶氮副品紅偶聯(lián)形成不溶性暗紅色偶氮副品紅萘酚沉淀，定位于胞質(zhì)內(nèi)酶活性處，呈現(xiàn)單一的或散在的紅色點塊狀或顆粒狀。上一頁下一頁第二節(jié)第26頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三【結(jié)果】酸性α-醋酸酯酶（ANAE）主要分布在T細胞和單核細胞內(nèi)；粒細胞、B細胞、紅系細胞、巨核細胞和血小板中含量較少。T細胞為ANAE陽性細胞，胞質(zhì)內(nèi)有大小不等、數(shù)量不一的紫紅色顆?；虬邏K；B細胞為ANAE陰性細胞，胞質(zhì)呈黃綠色，胞質(zhì)內(nèi)無紅色斑塊；單核細胞為ANAE陽性，其胞質(zhì)內(nèi)有細小紅褐色顆粒斑塊。上一頁下一頁第二節(jié)第27頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三酸性磷酸酶染色上一頁下一頁第28頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三【臨床評價】l.有助于區(qū)分T細胞和B細胞ANAE染色在T細胞胞質(zhì)中呈現(xiàn)點狀顆?；虼髩K局限陽性反應(yīng)中細胞大多數(shù)為陰性反應(yīng)，偶見稀疏彌散細小顆粒。2.鑒別急性白血病類型急性T細胞白血病細胞為點狀或塊狀陽性，局限分布；急性粒細胞白血病細胞ANAE染色大部分呈陰性或弱陽性反應(yīng)，顆粒增多的早幼粒白血病細胞陽性反應(yīng)較強，為彌散性分布；急單呈強陽性反應(yīng)，胞質(zhì)為均勻一致的彌散樣淡紅色或深紅色，無點狀顆粒。上一頁第二節(jié)返回第29頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三第三節(jié)白細胞動力學(xué)檢驗

一、氚標(biāo)記脫氧胸苷測定

二、潑尼松刺激試驗

三、腎上腺素激發(fā)試驗

四、二異丙酯氟磷酸鹽標(biāo)記測定

五、流式細胞儀檢測DNA合成及含量六、粒細胞抗體檢測第三節(jié)第30頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三（一）熒光免疫法檢測【原理】受檢血清中的抗體和粒細胞結(jié)合后，加標(biāo)記熒光物質(zhì)的羊抗人IgG血清，可使粒細胞膜顯示熒光，然后在熒光顯微鏡下觀察陽性比率和熒光強度?！窘Y(jié)果】陽性反應(yīng)表示受檢血清中存在粒細胞抗體。【臨床評價】本法敏感性較好，特異性強，臨床上常作為確診免疫性粒細胞減少癥的方法。下一頁第三節(jié)第31頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三（二）化學(xué)發(fā)光法檢測【原理】用化學(xué)發(fā)光技術(shù)測定單個核細胞與抗體被覆的粒細胞相互作用產(chǎn)生的代謝反應(yīng)，間接測定抗粒細胞抗體?！窘Y(jié)果】用發(fā)光儀測定增強的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，用發(fā)光指數(shù)表示結(jié)果?！九R床評價】本法比間接熒光免疫法更靈敏，可用于確診免疫性粒細胞減少癥。上一頁下一頁第三節(jié)第32頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三（三）流式細胞技術(shù)檢測【原理】采用正常人“O”型抗凝血分離出單核細胞和粒細胞，經(jīng)1％多聚甲醛固定，二者再等量混合制成細胞懸液，加受檢血清孵育，再加結(jié)合異硫氰酸熒光素（FITC）和抗人F（ab）2IgG，采用流式細胞分析儀進行分析來檢測同種反應(yīng)性粒細胞抗體?！窘Y(jié)果】熒光強度與粒細胞抗體量呈線性關(guān)系，根據(jù)熒光強度的大小即可得出粒細胞抗體的量?！九R床評價】本法不但可對粒細胞抗體作半定量測定，還可以對抗體類型進行分析，以確定是否存在免疫復(fù)合物。上一頁返回第三節(jié)第33頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三

【原理】分離的粒細胞并在培養(yǎng)過程中加入PHA或特異性抗原刺激后，進人有絲分裂期，此時加入3H-TdR，可被細胞攝入?yún)⑴cDNA合成，其摻入量與DNA合成的量以及增殖細胞數(shù)成正比，用液體閃爍計數(shù)器測定3H-TdR的摻入量，即可判定粒細胞的增殖水平。【參考值】SI＜2下一頁第三節(jié)第34頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三【臨床評價】在正常情況下，體內(nèi)粒細胞在增殖池（骨髓）、循環(huán)池（血液）及邊緣池（組織）之間處于平衡狀態(tài)，末梢血中成熟粒細胞數(shù)為（2.5－5.5）×109／L。在罹患血液等病理情況下，這種平衡狀態(tài)受到不同程度的破壞，即可能出現(xiàn)異常。研究白血病細胞動力學(xué)時給急性白血病患者連續(xù)靜脈輸人3H-TdR，8－10天后觀察到仍有8％－10％的白血病細胞未被標(biāo)記，這一小部分白血病細胞增殖相當(dāng)緩慢。說明白血病細胞是一群非同步化增殖的細胞。上一頁第三節(jié)返回第35頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三【原理】正常時骨髓中粒細胞儲備量大于外周血中的10－15倍，潑尼松具有刺激骨髓中性粒細胞由儲備池向外周血釋放的功能。如果受檢者骨髓的粒細胞儲備池正常，服用潑尼松后經(jīng)過一定時間儲備池大量釋放至血流而使外周血中性粒細胞的絕對值明顯增高。反之，則無此作用或作用不明顯?？砷g接測定骨髓粒細胞池粒細胞的儲備功能。【參考值】服藥后中性粒細胞最高絕對值＞20×109／L（服藥后5小時為中性粒細胞上升到高峰的時間）下一頁第三節(jié)第36頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三【臨床評價】潑尼松試驗可反應(yīng)骨髓中性粒細胞儲備池的容量。中性粒細胞減少患者，如服用潑尼松后外周血中性粒細胞最高絕對值＞20×109／L，表明患者中性粒細胞的儲備池正常，粒細胞減少可能是由于骨髓釋放障礙或其他因素所致。這對于某些骨髓受損引起粒細胞減少的輕微病例有一定參考及診斷價值。反之，則反映儲備不足。上一頁第三節(jié)返回第37頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三【原理】白細胞（主要是指中性粒細胞）進入血流后，約半數(shù)進入循環(huán)池，半數(shù)粘附于血管壁成為邊緣池的組成成分。此部分白細胞在外周血白細胞計數(shù)中不能得到反映。注射腎上腺素后血管收縮，粘附于血管壁上的白細胞脫落，從邊緣池進入循環(huán)池，致外用血白細胞數(shù)增高，其作用持續(xù)時間為20－30分鐘。分別在注射前和注射后20分鐘取血，計數(shù)中性粒細胞數(shù)。下一頁第三節(jié)第38頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三【參考值】粒細胞上升值一般低于（1.5－2）×109／L【臨床意義】白細胞減少者，注射腎上腺素后，如外周血白細胞能較注射前增加1倍以上或粒細胞上升值超過（1.5－2）×109／L，表示患者白細胞在血管壁粘附增多，提示病人粒細胞分布異常，即邊緣池粒細胞增多，如無牌大，可考慮為“假性”粒細胞減少。如果增高低于上述值，則應(yīng)進行其他檢查，進一步確定白細胞減少的病因。上一頁第三節(jié)返回第39頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三【原理】二異丙酯氟磷酸鹽標(biāo)記（DF32P）是利用含有放射性磷的二異丙酯氟磷酸作為膽堿酯酶的抑制劑，與細胞上的膽堿酯酶結(jié)合，即使細胞崩解，也不再與其他細胞相結(jié)合。故對測定血液循環(huán)中細胞池的大?。╬oolsize）以及滯留的時間均非常方便。用于粒細胞動力學(xué)研究時，一旦采血制成離體標(biāo)記物后，即作靜脈注射。經(jīng)過一段時間再次采血。分離粒細胞，通過追蹤觀察其放射活性的變化，可測知外周血中有關(guān)粒細胞地的參數(shù)。下一頁第三節(jié)第40頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三【參考值】l.粒細胞總數(shù)的測定標(biāo)記粒細胞半衰期間（T1/2）：4－10小時；血中滯留時間：10－14小時。全血粒細胞池（TBGP）：（35－70）x107/kg循環(huán)粒細胞池（CGP）：（20－30）xl07／kg邊緣粒細胞地（MGP）：（l5－40）x107/kg粒細胞周轉(zhuǎn)率（GTR）：（60－160）x107／（kg·d）上一頁下一頁第三節(jié)第41頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三

2．單核細胞總數(shù)的測定標(biāo)記單核細胞半衰期：4.5－10.0小時全血單核細胞池（TBMP）：（3．9－12.7）x107／kg循環(huán)單核細胞池（CMP）：（l．0－2．7）x107／kg邊緣單核細胞池（MMp）：（2．4－11.7）×107／k。單核細胞周轉(zhuǎn)率（MTR）：（7．2－33．6）x107／kg【臨床評價】在慢性白血病、真性紅細胞增多癥和骨髓纖維化時，TBGP及GTR顯著增加。粒細胞半壽期明顯延長。急性粒細胞白血病時有輕微的延長，而再生障礙性貧血時各指數(shù)測定值均偏低。上一頁第三節(jié)返回第42頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三流式細胞儀（FCM）是對單細胞快速定量分析和分選的新技術(shù)。當(dāng)被測細胞被制成單細胞懸液，經(jīng)特異性熒光染料染色后加入樣品管中，在氣體壓力推動下，流經(jīng)100μm的孔道時，細胞排成單列，逐個勻速通過激光束，被熒光染料染色的細胞受到強烈的激光照射后發(fā)出熒光，同時產(chǎn)生散射光。熒光被轉(zhuǎn)化為電子信息，在多道脈沖高度分析儀的熒光屏上，以一維組方圖或二維點陣圖及數(shù)據(jù)表或三維圖形顯示，計算機快速而準(zhǔn)確地將所測數(shù)據(jù)計算出來，結(jié)合多參數(shù)分析，從而實現(xiàn)了細胞的定量分析。下一頁第三節(jié)第43頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三（一）DNA合成的檢測【原理】與氚-胸腺嘧啶標(biāo)記法的原理一樣，用5-溴脫氧尿嘧啶摻入S期細胞的DNA，然后用抗5-BrdU抗原的特異性抗體，通過免疫熒光技術(shù)，用FCM準(zhǔn)確測定DNA合成速率?！窘Y(jié)果】快速提供有關(guān)細胞周期各時相分布的動態(tài)參數(shù)，間接了解DNA的合成情況?！九R床評價】可直接用于白血病病人體內(nèi)細胞增殖的動態(tài)研究，據(jù)此按化療藥物對細胞動力學(xué)的干擾理論設(shè)計最佳治療方案，靜止期腫瘤細胞對化療不敏感而增殖期（SG2M）敏感，可將GO期細胞分化誘導(dǎo)進人SG2M期，再予以細胞殺傷藥物，以達到最佳殺傷瘤細胞的效果。上一頁下一頁第三節(jié)第44頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三（二）DNA含量的檢測【原理】碘化丙啶（ProPidiumiodide，PI）熒光染料可嵌入到雙鏈DNA和RNA的堿基對中與之結(jié)合。用PI染DNA后能在指定波長的光波激發(fā)下產(chǎn)生紅色熒光，利用FCM可將細胞按不同的熒光強度即DNA含量分類并繪出DNA直方圖。細胞在增殖周期的不同階段，其DNA含量是不同，從DNA直方圖中可以得出細胞周期不同階段的細胞百分?jǐn)?shù)。上一頁下一頁第三節(jié)第45頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三

【結(jié)果】l.細胞DNA含量V1細胞中DNA含量多少用DNA指數(shù)（DI）來表示。根據(jù)DI值來判斷細胞DNA倍體的方法是：以正常同源組織細胞作為樣品2CDNA含量細胞的內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)。DNA倍體的判斷標(biāo)準(zhǔn)為DI＝0.1±2CV。二倍體：DI＝1.0±2CV（直方圖上僅1個G0／G1峰）。非整倍體（aneuplid，AN）：DI值＜0.91，＞1.10。DNA指數(shù)（DI）計算公式:上一頁下一頁樣品G0／G1期DNA量平均數(shù)÷標(biāo)準(zhǔn)二倍體DNA量平均數(shù)第三節(jié)第46頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三2.細胞周期各時相細胞比率包括：G0／G1期、5期和G2M期，計算各時相細胞的百分比。其中S期細胞百分比也叫SPF（S-Phaseraction）。

細胞增殖指數(shù)（proliferousindex，PI）（％）＝上一頁下一頁SPF（%）＝［S（G0／G1＋S＋G2M）］x100％［（S＋G2M）÷（G0／G1．＋S＋G2M）］x100％第三節(jié)第47頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三【臨床評價】1.DNA非整倍體細胞是腫瘤的特異性標(biāo)志，從FCM的DNA圖形分析，可得知血細胞和骨髓細胞DNA的相對含量，從而了解白血病細胞的信體水平及增殖活動。2.以縱坐標(biāo)表示細胞數(shù)，橫坐標(biāo)表示DNA相對含量，可繪出DNA不同含量血細胞分布曲線，得到G期、S期和G2＋M期細胞的百分比，尤其對白血病病人血細胞動力學(xué)的了解更為重要。急性白血病患者在來經(jīng)治療時其骨髓細胞（大多數(shù)為白血病細胞）S％（S期細胞DNA的百分含量）明顯低于正常骨髓。上一頁下一頁第三節(jié)第48頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三

3.用流式細胞儀對白血病化療后監(jiān)測藥效是目前較為靈敏的方法，對比化療后的細胞內(nèi)DNA含量表化，可迅速得出是否敏感的結(jié)論，從而指導(dǎo)臨床對初治或復(fù)發(fā)白血病病人選用和及時更換化療方案。4.白血病病人外周血白血病細胞多處于G0或G1期。S期細胞百分率（S％）高者對常用周期特異性藥物較為敏感，患者的完全緩解率高，但容易復(fù)發(fā)。S％低者對化療不敏感，但一旦緩解，不易復(fù)發(fā)。根據(jù)增殖期細胞對周期特異藥物比靜止期細胞為敏感，應(yīng)用G-CSF來復(fù)蘇G0期白血病細胞，有利于提高化療效果。上一頁第三節(jié)返回第49頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三第四節(jié)白細胞免疫標(biāo)記檢測

一、熒光顯微鏡計數(shù)檢測

二、流式細胞儀計數(shù)檢測三、堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶橋聯(lián)酶標(biāo)法檢測

四、生物素-親合素酶標(biāo)法檢測第四節(jié)第50頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三

【原理】將抗體標(biāo)記上熒光素制成的熒光抗體，在一定條件下與細胞表面的分化抗原簇相互作用，洗去游離的熒光抗體后，結(jié)合于細胞表面的熒光素在一定波長激發(fā)光照射下，發(fā)出一定波長的熒光，借此用熒光顯微鏡就可檢測到與熒光抗體特異結(jié)合的表面標(biāo)志。以鼠抗羊IgG作陰性對照，標(biāo)本中有明顯熒光現(xiàn)象就證明有相應(yīng)的抗原存在，借此對標(biāo)本中的抗原作鑒定和定位。根據(jù)標(biāo)記物和反應(yīng)程序的不同分為：直接熒光法，間接熒光法和雙標(biāo)記法，

下一頁第四節(jié)第51頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三【結(jié)果】觀察標(biāo)本的特異性熒光強度一般用＋號表示，－表示無熒光；±為極弱的可疑熒光；＋為熒光較弱但清楚可見；2＋為熒光明亮；3＋－4＋為熒光閃