核酸分離純化經(jīng)典

演示文稿核酸分離純化經(jīng)典版目前一頁\總數(shù)四十一頁\編于一點(diǎn)（優(yōu)選）核酸分離純化經(jīng)典版目前二頁\總數(shù)四十一頁\編于一點(diǎn)核酸（nucleicacid）是遺傳信息的攜帶者，是基因表達(dá)的物質(zhì)基礎(chǔ)。無論是進(jìn)行核酸結(jié)構(gòu)還是功能研究，首先需要對(duì)核酸進(jìn)行分離和純化。核酸樣品質(zhì)量將直接關(guān)系到實(shí)驗(yàn)的成敗。概述目前三頁\總數(shù)四十一頁\編于一點(diǎn)一、核酸分離、純化原則（一）保持核酸分子一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性1.意義：遺傳信息全部儲(chǔ)存在一級(jí)結(jié)構(gòu)之中，核酸的—級(jí)結(jié)構(gòu)還決定其高級(jí)結(jié)構(gòu)的形式以及和其他生物大分子結(jié)合的方式。目前四頁\總數(shù)四十一頁\編于一點(diǎn)2.實(shí)驗(yàn)過程中，應(yīng)注意以下條件及要求：1）減少化學(xué)因素對(duì)核酸的降解:pH4-102）減少物理因素對(duì)核酸的機(jī)械剪切力：0-4C

強(qiáng)烈振蕩、攪拌，細(xì)胞突置于低滲液中，細(xì)胞裂解，反復(fù)凍貯等造成的機(jī)械剪切力等條件都能明顯破壞大分子量的線性DNA分子，對(duì)于分子量小的環(huán)狀質(zhì)粒DNA及RNA分子，威脅相對(duì)小一些；另外如高溫加熱，除高溫本身對(duì)核酸分子中的化學(xué)鍵的破壞作用外，還可能因煮沸帶來液體剪切力，因此核酸提取常常在0～4℃的條件下進(jìn)行。

（一）保持核酸分子一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性目前五頁\總數(shù)四十一頁\編于一點(diǎn)3）抑制DNase或RNase的活性：

所用器械和一些試劑需高溫滅菌，提取緩沖液中需加核酸酶抑制劑。4）簡化步驟，縮短時(shí)間，減少破壞。（一）保持核酸分子一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性目前六頁\總數(shù)四十一頁\編于一點(diǎn)3.DNA酶抑制劑(1）金屬離子螯合劑：

DNA酶需要金屬二價(jià)離子Mg2+、Ca2+的激活，因此使用金屬二價(jià)離子螯合劑，可抑制DNA酶活性。如EDTA、檸檬酸鹽絡(luò)合Mg2+、Ca2+等離子。(2）陰離于型表面活性劑：

如SDS，該試劑除對(duì)核酸酶有抑制作用外，還能使蛋白質(zhì)變性，并與變性蛋白結(jié)合成帶負(fù)電荷的復(fù)合物，該復(fù)合物在高鹽溶液中沉淀。（一）保持核酸分子一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性目前七頁\總數(shù)四十一頁\編于一點(diǎn)4.RNA酶（RNAase)抑制劑

RNAase分布廣泛，極易污染樣品，而且耐高溫、耐酸、耐堿，不易失活，所以生物降解是RNA提取過程中的主要危害因素。(1)皂土（bentonite）作用機(jī)制：皂土帶負(fù)電荷，能吸附RNase，使其失活。

（一）保持核酸分子一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性目前八頁\總數(shù)四十一頁\編于一點(diǎn)(2)DEPC(二乙基焦碳酸鹽)

(C2H5OCOOCOOC2H5)

粘性液體，很強(qiáng)的核酸酶抑制劑。作用機(jī)制：與蛋白質(zhì)中His結(jié)合使蛋白變性。

使用注意：

DEPC也能破壞單鏈核酸中大部分腺嘌呤環(huán)。但濃度比使蛋白質(zhì)變性的濃度大100～1000倍。容易降解，保存在4℃或液氮中；提RNA時(shí)，0.1%DEPC浸泡器皿37℃2h。劇毒。（一）保持核酸分子一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性4.RNA酶（RNAase)抑制劑目前九頁\總數(shù)四十一頁\編于一點(diǎn)（3)肝素（4）復(fù)合硅酸鹽（Macaloid)（5）RNase阻抑蛋白（RNasin）（6）氧釩核糖核苷復(fù)合物(Vanadyl-RibonucleosideComplex,VRC)4.RNA酶（RNAase)抑制劑（一）保持核酸分子一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性目前十頁\總數(shù)四十一頁\編于一點(diǎn)一、核酸分離、純化原則(二)盡量排除其它分子的污染，保證核酸樣品的純度純化的核酸樣品不應(yīng)存在對(duì)酶有抑制作用的有機(jī)溶劑或過高濃度的金屬離子，蛋白質(zhì)、脂類、多糖分子的污染應(yīng)降低到最低程度；無其它核酸分子的污染，如提DNA分子時(shí)，應(yīng)去除RNA分子。目前十一頁\總數(shù)四十一頁\編于一點(diǎn)破碎組織細(xì)胞提取純化I.材料與方法的選擇II.破碎細(xì)胞或包膜－核酸的釋放III.核酸分離、純化IV.核酸的濃縮、沉淀、洗滌,并去除雜質(zhì)

V.核酸的鑒定與保存二、分離提取核酸的主要步驟目前十二頁\總數(shù)四十一頁\編于一點(diǎn)臨床常見的標(biāo)本有血液、尿液、唾液、組織及體外培養(yǎng)的細(xì)胞等都可作為提取核酸的原料，具體實(shí)驗(yàn)材料的選擇應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)的目的來確定。不同的研究目的對(duì)核酸的完整性、純度、產(chǎn)量及濃度有不同的要求。需考慮制備核酸所需的時(shí)間與成本：簡便快速、安全、經(jīng)濟(jì)；應(yīng)選擇安全的試劑與制備方案：完整性、產(chǎn)量、純度和濃度符合實(shí)驗(yàn)要求。（一）材料與方法的選擇目前十三頁\總數(shù)四十一頁\編于一點(diǎn)臨床常見的標(biāo)本有血液、尿液、唾液、組織及體外培養(yǎng)的細(xì)胞等都可作為提取核酸的原料，具體實(shí)驗(yàn)材料的選擇應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)的目的來確定。不同的研究目的對(duì)核酸的完整性、純度、產(chǎn)量及濃度有不同的要求。需考慮制備核酸所需的時(shí)間與成本：簡便快速、安全、經(jīng)濟(jì)；應(yīng)選擇安全的試劑與制備方案：完整性、產(chǎn)量、純度和濃度符合實(shí)驗(yàn)要求。（一）材料與方法的選擇目前十四頁\總數(shù)四十一頁\編于一點(diǎn)DNA和RNA均位于細(xì)胞內(nèi)（病毒除外），因此核酸分離與純化的第一步即是裂解細(xì)胞、釋放核酸。（二）細(xì)胞的破碎——核酸的釋放目前十五頁\總數(shù)四十一頁\編于一點(diǎn)破碎細(xì)胞的方法有三種：①機(jī)械方法：超聲波處理法、研磨法、勻漿法；②化學(xué)試劑法：用SDS處理細(xì)胞，SDS可溶解細(xì)胞膜、核膜，去除脂質(zhì)和蛋白質(zhì)，并使組織蛋白與DNA分離；③酶解法：加入溶菌酶或蛋白酶，都可使細(xì)胞膜破裂，核酸釋放。蛋白酶還能降解與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)，促進(jìn)核酸分離。（二）細(xì)胞的破碎——核酸的釋放目前十六頁\總數(shù)四十一頁\編于一點(diǎn)注意：1.細(xì)胞破碎方法中機(jī)械剪切法不能用于基因組DNA的提?。?.非機(jī)械法常用化學(xué)試劑或酶細(xì)胞溶解法。（二）細(xì)胞的破碎——核酸的釋放目前十七頁\總數(shù)四十一頁\編于一點(diǎn)細(xì)胞裂解物是含核酸分子的復(fù)雜混合物，核酸分子本身可能仍與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起。核酸與蛋白質(zhì)的結(jié)合力主要是正負(fù)靜電吸力(核酸與堿性蛋白的結(jié)合)、氫鍵和非極性的范德華力。分離核酸最困難的是將與核酸緊密結(jié)合的蛋白質(zhì)分開，同時(shí)避免核酸降解。（三）核酸的分離純化目前十八頁\總數(shù)四十一頁\編于一點(diǎn)

應(yīng)該清除的雜質(zhì)主要包括:1.非核酸的大分子污染物蛋白質(zhì)、多糖及脂類物質(zhì)等大分子物質(zhì)

2.非目的的核酸分子分離某一核酸分子時(shí)，其它核酸皆為雜質(zhì)

3.加入的有機(jī)溶劑和某些金屬離子（三）核酸的分離純化目前十九頁\總數(shù)四十一頁\編于一點(diǎn)1.加入濃鹽溶液（如NaCl）RNA核蛋白和DNA核蛋白在不同濃度氯化鈉溶液中的溶解度有顯著區(qū)別。DNA核蛋白在0.14mol/L氯化鈉中溶解度低，但在1–2mol/L氯化鈉中溶解度高；RNA核蛋白在0.14mol/L氯化鈉中溶解度仍有相當(dāng)大的溶解度。調(diào)節(jié)氯化鈉濃度，可使RNA核蛋白和DNA核蛋白分步提取開來。核酸-蛋白質(zhì)加入NaCl后，破壞靜電吸力，使氫鍵破壞，核蛋白解聚；

核酸分離純化的基本方法目前二十頁\總數(shù)四十一頁\編于一點(diǎn)2.加入SDSSDS除有破胞和抑制核酸酶的作用外，還具有使核酸從蛋白質(zhì)上游離出來的功能；

核酸分離純化的基本方法目前二十一頁\總數(shù)四十一頁\編于一點(diǎn)3.酚/氯仿抽提細(xì)胞裂解后離心分離含核酸的水相，加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇混合液，混勻后離心分離。疏水性的蛋白質(zhì)被分配至有機(jī)相，核酸則被留于上層水相。在含核酸的水相中加入醋酸鉀或醋酸鈉，形成核酸鹽，核酸鹽可被一些有機(jī)溶劑沉淀，離心得到的核酸可以用70%乙醇洗滌以除去多余的鹽分，即可獲得一定純度的核酸。

核酸分離純化的基本方法目前二十二頁\總數(shù)四十一頁\編于一點(diǎn)酚／氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并對(duì)核酸酶有抑制作用。氯仿比重大，能加速有機(jī)相與水相分層，減少殘留在水相中的酚，同時(shí)氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。在酚/氯仿抽提核酸提取液時(shí)，需要振搖，為防止起泡和促使水相與有機(jī)相的分離，再加上一定量的異戊醇（酚：氯：異戊醉=25：24：1）。

核酸分離純化的基本方法目前二十三頁\總數(shù)四十一頁\編于一點(diǎn)(1）使用注意酚通常是透明無色的結(jié)晶，如果酚結(jié)晶呈現(xiàn)粉紅色或黃色，表明其中含有酚的氧化產(chǎn)物，例如醌、二酸等。變色的酚不能用于核酸抽提實(shí)驗(yàn)，因?yàn)檠趸锟善茐暮怂岬牧姿岫ユI。

(2）安全操作

酚腐蝕性很強(qiáng)，并可引起嚴(yán)重的灼傷，操作時(shí)應(yīng)戴手套。使用酚時(shí)應(yīng)注意

核酸分離純化的基本方法目前二十四頁\總數(shù)四十一頁\編于一點(diǎn)

沉淀是濃縮核酸最常用的方法。優(yōu)點(diǎn)：

①改變核酸的溶解緩沖液；②重新調(diào)整核酸的濃度，提高樣品濃度；③去除溶液中某些鹽離子與雜質(zhì)。（四）核酸的濃縮、沉淀與洗滌目前二十五頁\總數(shù)四十一頁\編于一點(diǎn)沉淀的方法：常用的鹽類:醋酸鈉、醋酸鉀、醋酸銨、氯化鈉、氯化鉀及氯化鎂。常用的有機(jī)溶劑:乙醇、異丙醇和聚乙二醇洗滌：核酸沉淀常常含有少量共沉淀的鹽，需用70%～75%的乙醇洗滌去除。（四）核酸的濃縮、沉淀與洗滌當(dāng)核酸溶液的pH值大于4時(shí)，核酸分子呈多聚陰離子狀態(tài)，它與一價(jià)或二價(jià)陽離子形成的鹽在許多有機(jī)溶劑中不溶解，也不會(huì)被有機(jī)溶劑變性。DNA不溶于乙醇等有機(jī)溶劑，因此可以通過乙醇沉淀來純化和濃縮DNA。目前二十六頁\總數(shù)四十一頁\編于一點(diǎn)核酸沉淀的溫度和時(shí)間

一般強(qiáng)調(diào)，核酸沉淀在低溫長時(shí)間下進(jìn)行。低溫長時(shí)間沉淀，易導(dǎo)致鹽與DNA共沉淀，影響以后的實(shí)驗(yàn)。一般使用0℃冰水，10-15min，DNA樣品足可達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。（四）核酸的濃縮、沉淀與洗滌目前二十七頁\總數(shù)四十一頁\編于一點(diǎn)1.核酸的鑒定濃度鑒定純度鑒定完整性鑒定（五）核酸的鑒定與保存目前二十八頁\總數(shù)四十一頁\編于一點(diǎn)紫外分光光度法：核酸分子中的堿基具有共軛雙鍵結(jié)構(gòu)，可以吸收紫外線，其最大吸收波長為260nm。前提：核酸樣品要較純，無顯著蛋白質(zhì)、酚、瓊脂糖及其他核酸污染。測定濃度應(yīng)大于0.25μg/ml。結(jié)論：在波長260nm紫外光下，1OD值的吸光度相當(dāng)于雙鏈DNA濃度為50μg/ml；單鏈DNA為37μg/ml；RNA為40ug/ml。

濃度鑒定（五）核酸的鑒定與保存目前二十九頁\總數(shù)四十一頁\編于一點(diǎn)目前三十頁\總數(shù)四十一頁\編于一點(diǎn)熒光光度法：核酸的熒光染料溴化乙錠嵌入堿基平面后，本身無熒光的核酸在UV激發(fā)下發(fā)出紅色熒光。熒光強(qiáng)度的強(qiáng)度與溶液中核酸的含量呈正比。

使用一系列已知的不同濃度DNA溶液作標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，可比較出被測DNA溶液濃度。注意：此法的比較主要基于目測，是估計(jì)水平。（五）核酸的鑒定與保存EB與DNA的結(jié)合濃度鑒定目前三十一頁\總數(shù)四十一頁\編于一點(diǎn)

紫外分光光度法：主要通過A260與A280的比值來判定有無蛋白質(zhì)的污染。比值升高或降低均提示制備的核酸純度不佳。純度鑒定（五）核酸的鑒定與保存目前三十二頁\總數(shù)四十一頁\編于一點(diǎn)純度鑒定（五）核酸的鑒定與保存判斷核酸樣品的純度：DNA純品:OD260/OD280=1.8RNA純品:OD260/OD280=2.0比值降低：蛋白質(zhì)污染（280）、酚污染（270）比值升高：DNA變性、RNA污染混合污染：比值正常目前三十三頁\總數(shù)四十一頁\編于一點(diǎn)熒光光度法：

EB等熒光染料示蹤的核酸電泳可判定核酸制品的純度。（五）核酸的鑒定與保存純度鑒定目前三十四頁\總數(shù)四十一頁\編于一點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳：以EB為示蹤劑的核酸凝膠電泳可判定核酸制品的完整性；根據(jù)電泳條帶的數(shù)目、位置和形狀判定，RNA分子可以通過熒光強(qiáng)度強(qiáng)弱來判定有無降解。基因組DNA如果發(fā)生降解，電泳圖呈拖尾狀。

完整性鑒定（五）核酸的鑒定與保存目前三十五頁\總數(shù)四十一頁\編于一點(diǎn)DNA的降解（五）核酸的鑒定與保存目前三十六頁\總數(shù)四十一頁\編于一點(diǎn)

完整的或降解很少的總RNA電泳圖譜中，原核生物5S、16S、23S三條帶；真核生物：5S和5.8S、18S、28S三條帶；而且三條帶熒光強(qiáng)度應(yīng)呈特定的比值。沉降系數(shù)大，電泳遷移率低，熒光強(qiáng)度高沉降系數(shù)小，電泳遷移率高，熒光強(qiáng)度低

（五）核酸的鑒定與保存

完整性鑒定目前三十七頁\總數(shù)四十一頁\編于一點(diǎn)28S（或23S）RNA的熒光強(qiáng)度一般約為18S（或16S）RNA的2倍，否則提示有RNA的降解；若在點(diǎn)樣孔附近有著色條帶，提示可能存在DNA的污染。（五）核酸的鑒定與保存目前三十八頁\總數(shù)四十一頁\編于一點(diǎn)核酸保存的主要條件是溫度和介質(zhì)

溫度：

4℃樣