藥品的微生物學檢查

一、目的要求1、了解微生物學實驗室常用消毒滅菌儀器設備2、了解空氣、皮膚細菌檢查方法3、掌握藥品的微生物學檢驗程序和方法二、實驗內(nèi)容1.藥品的微生物限度檢查（一）1）口服藥物的檢查:①藥品的預處理：②大腸桿菌的檢查：③細菌總數(shù)的檢查：2）外用藥物的檢查:①藥品的預處理：②綠膿桿菌的檢查：③金黃色葡萄球菌的檢查：2.空氣、皮膚細菌檢查方法(驗證)3.微生物學實驗室常用消毒滅菌儀器設備：高壓蒸汽滅菌鍋、消毒煮沸器、G6玻璃濾菌器裝置、潔凈工作臺、移動式紫外光燈、鼓風式干烤箱、紫外線殺菌標本。實驗一藥品的微生物限度檢查（一）實驗室常用消毒滅菌設備空氣和皮膚細菌檢查方法（綜合實驗+基礎實驗）目前一頁\總數(shù)五十八頁\編于二點

通過實驗了解藥品微生物限定檢查法的意義、設計方法、細菌檢查常用的基本技術和程序，結果分析方法。藥品的微生物限度檢查實驗目的藥品的微生物限度檢查實驗程序

一、藥品的預處理二、藥品的增菌培養(yǎng)、結果分析三、細菌分離鑒定、結果分析目前二頁\總數(shù)五十八頁\編于二點口服藥外用藥藥品的微生物限度檢查實驗方法（一）

1.藥品的預處理2克藥品加20毫升生理鹽水，研磨制成懸液

2.細菌培養(yǎng)外用藥口服藥藥品混懸液10毫升加入膽鹽乳糖增菌液中藥品混懸液10毫升加入膽鹽乳糖增菌液中藥品混懸液10毫升加入亞碲酸鈉增菌液中37℃,24小時37℃,24小時目前三頁\總數(shù)五十八頁\編于二點

將剩余口服藥以10-110-210-310-4進行稀釋(以生理鹽水稀釋)

3.細菌總數(shù)測定從上述四個稀釋管中各取1ml混入溶化的瓊脂培養(yǎng)基中，混勻，冷卻后置37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時

。取四個中試管各加9ml生理鹽水從剩余10ml懸液中取1ml加入上述四個稀釋管中1ml1ml10-110-410-210-39ml生理鹽水目前四頁\總數(shù)五十八頁\編于二點一、目的要求:1、了解細菌培養(yǎng)接種技術2、掌握細菌基本形態(tài)3、掌握藥品的微生物學檢驗程序和方法二、實驗內(nèi)容1.藥物的微生物限度檢查（二）2.空氣、皮膚細菌檢查結果測定。3.講授基礎培養(yǎng)基的制備方法（營養(yǎng)瓊脂、營養(yǎng)肉湯）。4.細菌在三種不同物理性狀培養(yǎng)基上的接種方法(基本技能)

液體培養(yǎng)基 平板培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基 雙糖含鐵半固體斜面培養(yǎng)基5.顯微鏡下觀察

細菌的基本形態(tài):球菌、枯草桿菌、霍亂弧菌。特殊結構：肺炎莢膜、變形鞭毛、破傷風芽胞。6.培養(yǎng)基的種類和用途普通培養(yǎng)基、營養(yǎng)培養(yǎng)基、厭氧培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基實驗二藥品的微生物限度檢查（二）細菌的形態(tài)學檢查及培養(yǎng)接種技術目前五頁\總數(shù)五十八頁\編于二點一、空氣、皮膚細菌培養(yǎng)現(xiàn)象觀察

（一）記錄空氣微生物培養(yǎng)結果菌落數(shù)目、大小、邊緣、顏色、粗糙（光滑）（二）記錄皮膚微生物培養(yǎng)結果比較消毒前后細菌菌落數(shù)，菌落特點。目前六頁\總數(shù)五十八頁\編于二點培養(yǎng)基的制備培養(yǎng)基分類根據(jù)物理性狀分類：液體培養(yǎng)基主要用于增菌半固體培養(yǎng)基用于檢測動力及保存菌種固體培養(yǎng)基用于分離鑒定細菌根據(jù)用途分類：基礎培養(yǎng)基普通瓊脂培養(yǎng)基營養(yǎng)培養(yǎng)基血液瓊脂培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基SS培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基雙糖鐵培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)基庖肉培養(yǎng)基目前七頁\總數(shù)五十八頁\編于二點培養(yǎng)基的制備程序調配→矯正pH（）→分裝→滅菌（121.3℃，20-30分鐘）→放入冰箱冷藏備用。因高壓之后pH值會下降0.1左右，所以矯正pH時應比所需的pH高。鑒定是否有菌可將培養(yǎng)基置于37℃培養(yǎng)24小時，然后觀察。目前八頁\總數(shù)五十八頁\編于二點二、細菌的接種技術材料普通瓊脂平板、肉湯培養(yǎng)基、半固體斜面培養(yǎng)基大腸埃希菌培養(yǎng)物（１套／臺）目前九頁\總數(shù)五十八頁\編于二點方法1.平板劃線接種法（1）平行劃線法（2）分區(qū)劃線法2.瓊脂斜面的接種方法3.液體培養(yǎng)基接種法4.半固體接種法目前十頁\總數(shù)五十八頁\編于二點分區(qū)劃線法目前十一頁\總數(shù)五十八頁\編于二點菌落目前十二頁\總數(shù)五十八頁\編于二點斜面移種技術目前十三頁\總數(shù)五十八頁\編于二點菌苔目前十四頁\總數(shù)五十八頁\編于二點液體移種技術目前十五頁\總數(shù)五十八頁\編于二點穿刺技術目前十六頁\總數(shù)五十八頁\編于二點取出前次實驗培養(yǎng)物觀察：1.口服藥物1)細菌鑒定：在膽鹽乳糖增菌液中有無細菌生長：增菌液變混濁―――――有-----接種在伊紅美蘭瓊脂平板培養(yǎng)基上面。方法：分區(qū)劃線接種。2)細菌總數(shù)測定：選擇30-300個菌落平板，細菌總數(shù)＝菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)藥物的微生物限度檢查方法（二）目前十七頁\總數(shù)五十八頁\編于二點2.外用藥1)判定膽鹽乳糖增菌液培養(yǎng)物及亞碲酸鈉增菌液培養(yǎng)物有無細菌生長：增菌液變混濁―――有2)細菌鑒定：（1）將膽鹽乳糖增菌液培養(yǎng)物無菌接種在16烷三甲基溴化胺瓊脂斜面培養(yǎng)基上面。方法：斜面化線接種；（2）將亞碲酸鈉增菌液培養(yǎng)物，無菌接種在卵黃高鹽瓊脂平板培養(yǎng)基上面。方法：分區(qū)劃線接種。37℃恒溫孵育箱24小時培養(yǎng)后，觀察結果。目前十八頁\總數(shù)五十八頁\編于二點細菌基本形態(tài)球菌桿菌螺形菌目前十九頁\總數(shù)五十八頁\編于二點葡萄球菌目前二十頁\總數(shù)五十八頁\編于二點鏈球菌目前二十一頁\總數(shù)五十八頁\編于二點大腸埃希菌目前二十二頁\總數(shù)五十八頁\編于二點枯草桿菌目前二十三頁\總數(shù)五十八頁\編于二點霍亂弧菌目前二十四頁\總數(shù)五十八頁\編于二點細菌特殊結構鞭毛莢膜芽孢目前二十五頁\總數(shù)五十八頁\編于二點破傷風梭菌spore目前二十六頁\總數(shù)五十八頁\編于二點一、目的要求:1、了解細菌的生長現(xiàn)象及代謝產(chǎn)物的觀察2、掌握藥品的微生物學檢驗程序和方法二、實驗內(nèi)容1.藥物的微生物限度檢查（三）2.細菌的生長現(xiàn)象及代謝產(chǎn)物的觀察 1）液體培養(yǎng)基---沉淀、渾濁、表面生長現(xiàn)象。 2）三葡、三鏈、大腸與副傷乙培養(yǎng)基的菌落特征、溶血環(huán)觀察。3）雙糖含鐵培養(yǎng)基---動力、氣體、硫化氫、分解乳糖觀察。 4）結核桿菌菌落的觀察。 3.中草藥、抗生素抑菌試驗1）中草藥---大蒜汁、黃連、黃芩、黃柏。2）抗生素---青霉素、慶大、氨芐、新諾明、生理鹽水。實驗三

藥品的微生物限度檢查（三）微生物的形態(tài)學檢查及藥物的敏感性試驗

目前二十七頁\總數(shù)五十八頁\編于二點1）從伊紅美蘭瓊脂平板培養(yǎng)基上-----挑取黑色帶有金屬光澤的濕潤菌落，接種在普通瓊脂斜面培養(yǎng)基上面，進行細菌的純培養(yǎng)。2）觀察外用藥物在16烷三甲基溴化胺瓊脂斜面培養(yǎng)基上生長狀況。記錄被檢菌色素的溶解性質、液化明膠的狀況及菌苔粘稠度等。革蘭氏染色鏡下觀察其菌落形態(tài)。根據(jù)上述被檢菌落的生物性質和狀況及細菌形態(tài)，確定該被檢菌的名稱。3）從卵黃高鹽瓊脂平板培養(yǎng)基上生長，挑取黃色的濕潤菌落，接種在普通瓊脂斜面培養(yǎng)基上面，進行細菌的純培養(yǎng)。藥物的微生物限度檢查（三）目前二十八頁\總數(shù)五十八頁\編于二點2.細菌的生長現(xiàn)象及代謝產(chǎn)物的觀察混濁生長菌膜菌沉淀均勻渾濁對照目前二十九頁\總數(shù)五十八頁\編于二點菌膜生長目前三十頁\總數(shù)五十八頁\編于二點目前三十一頁\總數(shù)五十八頁\編于二點目前三十二頁\總數(shù)五十八頁\編于二點目前三十三頁\總數(shù)五十八頁\編于二點3.中草藥、抗生素抑菌試驗目前三十四頁\總數(shù)五十八頁\編于二點紙片法目前三十五頁\總數(shù)五十八頁\編于二點六、革蘭染色法原理：革蘭陽性菌與革蘭陰性菌細胞壁差異應用方法標本片制備革蘭染色結果目前三十六頁\總數(shù)五十八頁\編于二點

2.革蘭染色（1）初染：滴加結晶紫染液l～2滴，1分鐘.水洗（2）媒染：滴加碘液，l～2滴，作用1分鐘后水洗。（3）脫色：滴加95％酒精數(shù)滴，（約15～30秒），立即水洗。（4）復染：滴加稀釋復紅染液1～2滴，作用1分鐘后水洗。（5）結果：牙垢標本中革蘭陽性菌染成紫色，革蘭陰性菌染成紅色。其中真菌(白色念珠菌)染成紫色，而螺旋體等被染成紅色?？谇恢忻撀涞慕M織細胞及個別白細胞被染成紅色。其細胞質呈紅色，細胞核呈深紅色。

目前三十七頁\總數(shù)五十八頁\編于二點實驗四藥物的微生物限度檢查（四）病毒和細菌及其他病原微生物一、目的要求1、了解抗酸染色方法及各種病毒和細菌的菌落形態(tài)2、掌握藥品的微生物學檢驗程序和方法二、實驗內(nèi)容1、藥物的藥物的微生物限度檢查（四）1）將口服藥物中的細菌分別接種：①蛋白胨水培養(yǎng)基；②葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基；③枸櫞酸鹽（西蒙氏）培養(yǎng)基。同時接種產(chǎn)氣桿菌于上述培養(yǎng)管做對照，以備進行IMViC試驗。2）取接種在普通瓊脂斜面培養(yǎng)基上面的外用藥物中細菌進行血漿凝固酶檢測,依據(jù)其反應結果,確定該菌的性質及名稱。2、抗酸染色 3、真菌培養(yǎng)物的觀察------黑曲霉、木霉、青霉菌菌落，白色念珠菌假菌絲，酵母菌菌落的觀察。4、記錄中草藥、抗生素抑菌試驗結果5、觀察雞胚的結構 目前三十八頁\總數(shù)五十八頁\編于二點---------------------------------------------------試驗培養(yǎng)基加試劑試驗結果大腸埃希菌產(chǎn)氣桿菌蛋白胨水2管11葡萄糖蛋白胨水2管11葡萄糖蛋白胨水2管11枸櫞酸鹽2管11目前三十九頁\總數(shù)五十八頁\編于二點實驗四藥物的微生物限度檢查（四）病毒和細菌及其他病原微生物取接種在普通瓊脂斜面培養(yǎng)基上面的外用藥物中細菌進行血漿凝固酶檢測,依據(jù)其反應結果,確定該菌的性質及名稱。

目前四十頁\總數(shù)五十八頁\編于二點二.血漿凝固酶試驗原理：非致病性葡萄球菌不產(chǎn)生血漿凝固酶而致病性葡萄球菌能產(chǎn)生血漿凝固酶，可使含有枸櫞酸鈉或肝素抗凝劑的兔或人等血漿發(fā)生凝固。方法：1.取潔凈玻片，用記號筆畫兩個圈并標號，其中一個滴加生理鹽水另一個滴加兔血漿。2.接種環(huán)燒灼滅菌后挑取金葡菌苔，1/2在生理鹽水中研勻混懸，另1/2在兔血漿中研勻混懸，靜止片刻，觀察結果。結果：凝集呈顆粒狀判定為血漿凝固酶試驗（+），呈均勻混濁狀不凝集判定為（-）目前四十一頁\總數(shù)五十八頁\編于二點方法：1.取潔凈玻片，用記號筆畫兩個圈并標號，其中一個滴加生理鹽水另一個滴加兔血漿。2.接種環(huán)燒灼滅菌后挑取金葡菌苔，1/2在生理鹽水中研勻混懸，另1/2在兔血漿中研勻混懸，靜止片刻，觀察結果。結果：凝集呈顆粒狀判定為血漿凝固酶試驗（+），呈均勻混濁狀不凝集判定為（-）目前四十二頁\總數(shù)五十八頁\編于二點制片（涂片、干燥、固定）；石炭酸復紅初染（加溫、蓋濾紙片）5min---水洗；3％鹽酸酒精脫色（15S,水洗）；美蘭復染（1min，水洗）-濾紙吸干鏡檢。抗酸染色步驟目前四十三頁\總數(shù)五十八頁\編于二點結核桿菌目前四十四頁\總數(shù)五十八頁\編于二點抗生素體外抑菌試驗（二）

記錄紙片法結果測量抑菌環(huán)直徑

目前四十五頁\總數(shù)五十八頁\編于二點病毒的分離培養(yǎng)—雞胚接種動物接種雞胚培養(yǎng)組織細胞培養(yǎng)病毒的培養(yǎng)方法：目前四十六頁\總數(shù)五十八頁\編于二點病毒的分離培養(yǎng)—雞胚接種目前四十七頁\總數(shù)五十八頁\編于二點病毒名稱接種部位雞胚胚齡（天）痘類病毒絨毛尿囊膜10～13流感、副流感、腮腺炎病毒尿囊9～11嗜神經(jīng)病毒卵黃囊5～8初次分離標本羊膜腔10～12病毒的分離培養(yǎng)—雞胚培養(yǎng)目前四十八頁\總數(shù)五十八頁\編于二點實驗五藥物的微生物限度檢查（五）一、目的要求掌握藥品的微生物學檢驗程序和方法二、實驗內(nèi)容以生化反應（IMViC）檢測口服藥中細菌的性質。目前四十九頁\總數(shù)五十八頁\編于二點---------------------------------------------------試驗培養(yǎng)基加試劑試驗結果大腸埃希菌產(chǎn)氣桿菌吲哚(I)蛋白胨水2管苯甲醛試劑0.5ml(5滴)紅陽性（+）無色變陰性（-）甲基紅(M)葡萄糖蛋白胨水2管甲基紅5滴紅色陽性（+）黃色陰性（-）VP葡萄糖蛋白胨水2管培氏乙6滴——萘酚試劑6滴無色變陰性（-）紅色陽性（+）枸椽酸鹽(C)枸櫞酸鹽2管綠無色變陰性（-）綠—藍色陽性（+）目前五十頁\總數(shù)五十八頁\編于二點IMViC結果吸哚試