第五章色譜分離法新2

吸附色譜排阻色譜（凝膠色譜）分配色譜離子交換色譜吸附能力的差異分子尺寸的大小不同兩相中分配系數(shù)的不同親和力的差異AdsorptionchromatographyExclusionchromatographyGel-permeationchromatographyPartitionchromatographyIon-exchangechromatography色譜分離法的分類（原理）目前一頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)§5－1紙色譜法紙色譜法：以濾紙吸附的水作固定相，有機(jī)溶劑作流動相的一種色譜法。目前二頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)§5－1紙色譜法一、基本原理和特點(diǎn)二、定性分析三、操作技術(shù)四、應(yīng)用目前三頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)一、基本原理和特點(diǎn)基本原理：它和萃取一樣，它也是根據(jù)不同物質(zhì)在兩相間的分配比不同而進(jìn)行分離的（相當(dāng)于逆流萃?。┨攸c(diǎn)：操作簡單、分離效率高，但分離速度慢。目前四頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)1.層析缸123456732.濾紙3.原點(diǎn)4.展開劑5.前沿6.7.斑點(diǎn)目前五頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)二、定性分析

組分分離后，它們在濾紙上的位置用比移值來表示，它也是色譜定性分析的依據(jù)。aABbl

將標(biāo)準(zhǔn)和樣品的Rf值進(jìn)行比較，可以對樣品進(jìn)行定性分析。定性分析方法：目前六頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)二、定性分析影響比移值的因素：1）欲分離物的本性:物質(zhì)在兩相的分配系數(shù),決定了它的Rf大小2)層析溶劑:同一組分在不同溶劑中Rf不同。通常應(yīng)選這樣的層析劑，使溶質(zhì)的Rf在0.050.85之間,不同組分的Rf差值>0.05.3）pH:影響它們的存在狀態(tài)目前七頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)二、定性分析4）濾紙:質(zhì)地均一、厚薄適當(dāng)、具有一定機(jī)械強(qiáng)度、不含雜質(zhì)5）溫度:溫度會影響溶質(zhì)的分配系數(shù)及流動相的擴(kuò)散速度。層析操作應(yīng)在恒溫下進(jìn)行，溫度不超過±0.5oC6）展開方式:展開方式不同,Rf也不同。下行法的Rf最大，上行法的Rf較小，環(huán)行法的Rf也不大。目前八頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)三、操作技術(shù)1.濾紙的選擇和處理2.固定相的選擇3.試樣的制備和點(diǎn)樣4.展開5.顯色目前九頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)1.濾紙的選擇與處理濾紙的選擇：

a.要求濾紙質(zhì)地均勻、平整無折痕邊緣整齊

b.要求濾紙的纖維松緊適宜

c.濾紙的雜質(zhì)含量少

以0.1～0.4mol/LHCl(或2mol/LHAc)浸泡數(shù)小時,除去無機(jī)雜質(zhì)后,取出用蒸餾水洗凈,再將濾紙放在丙酮-乙醇(1:1)中浸泡一周時間,除去有機(jī)雜質(zhì),再取出風(fēng)干備用.濾紙的處理目前十頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)2.固定相的選擇

紙層析——以吸著在纖維素上的水作固定相。反相紙層析——用甲酰胺、二甲基甲酰胺、丙二醇等作固定相。若分離芳香油等非極性物，以石蠟油、硅油作固定相。目前十一頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)3.試樣的制備和點(diǎn)樣A.試樣的制備

固體試樣盡量不用水來溶解，而多采用乙醇、丙酮、氯仿等有機(jī)溶劑來溶解，最好采用與展開劑極性相似的溶劑。液體試樣可直接點(diǎn)樣。

?。┫扔勉U筆在距紙條一端2~3cm處劃一條直線（起始線）并在線上隔一定距離劃一“x”號表示點(diǎn)樣位置；見下示意圖：B.點(diǎn)樣方法目前十二頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)3.試樣的制備和點(diǎn)樣目前十三頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)3.試樣的制備和點(diǎn)樣ⅱ）點(diǎn)樣工具：微量注射器、毛細(xì)滴管（Φ＝0.5mm)

；ⅲ）點(diǎn)樣方法：用點(diǎn)樣工具吸取試液輕輕與“x”號接觸，使點(diǎn)樣的斑點(diǎn)直徑為0.2~0.5cm,每次點(diǎn)樣2~20μL于濾紙上，以冷風(fēng)吹干；ⅳ）干后，將紙的兩邊用線縫好，以圓筒形式置于層析缸中展開。目前十四頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)4.展開欲分離物在兩相中的溶解度；展開劑的極性展開劑與欲分離物間應(yīng)無化學(xué)反應(yīng)欲分離物在展開劑中的分配系數(shù)最好不受溫度的影響欲分離物在兩相間的分配平衡瞬間達(dá)到A.展開劑的選擇目前十五頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)4.展開B.展開方法

展開前，層析缸與已點(diǎn)樣濾紙必須預(yù)先經(jīng)水蒸汽、溶劑蒸氣飽和。方法：將溶劑和水置于分液漏斗中充分振蕩，分層后，將水層放入小燒杯內(nèi)，置于層析缸中平衡一段時間，使濾紙吸飽蒸汽，然后移去小燒杯，將溶劑倒入溶劑槽中，立即將點(diǎn)好樣的濾紙的一端浸入溶劑槽內(nèi)展層。展開方式可分為上行法、下行法和環(huán)行法及雙向展開法等。目前十六頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)4.展開B.展開方法（上行法）將點(diǎn)有試樣的濾紙條的下端浸入溶劑（但不能浸沒點(diǎn)樣處）上端固定在層析缸的上部，保持垂直，將缸密閉，使溶劑沿下端上升而展層。待溶液上升到距離紙上端3~4cm時，將濾紙取出，用鉛筆在溶劑前沿處畫線作記號（見右圖）目前十七頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)4.展開B.展開方法（下行法）

溶劑自紙的上端向下降（借助于重力的作用），具有分離速度快及連續(xù)揮發(fā)色譜的優(yōu)點(diǎn)。玻皿玻片玻璃棒原點(diǎn)剪成鋸齒狀，便于溶劑滴下目前十八頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)4.展開B.展開方法（環(huán)行法）取一張圓形濾紙?jiān)谥睆降膬蛇吀鳟媰筛叫芯€，用剪刀沿這兩根線剪至圓心處，在紙的中央滴上試液，干后，將濾紙夾在兩個大小相同培養(yǎng)皿之間，使剪開的紙條的尾端浸入流動相。目前十九頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)4.展開B.展開方法（雙向展開法）

有時用一種溶劑不能將樣品中組份分開時，可以試用雙向展開法。該法是用正方形或長方形濾紙，在紙的一角上點(diǎn)樣，先用一種展開劑朝一個方向展開，展開完畢，待溶劑揮發(fā)后，再用另一種展開劑朝與原來垂直的方向進(jìn)行第二次展層。目前二十頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)4.顯色a.有色物：直接觀察各個色斑無色物：物理法顯色：用紫外燈照，觀察有無吸收或發(fā)出各種不同顏色的熒光斑點(diǎn)，并用鉛筆畫下斑點(diǎn)的位置及大小。化學(xué)法顯色：利用各種物質(zhì)的特性反應(yīng)，噴灑適當(dāng)?shù)娘@色劑。如若被分離的物質(zhì)含有氨基酸，則可噴茚三酮，多數(shù)氨基酸呈紫色，個別氨基酸呈黃色。其它化合物所用顯色劑可從手冊里查閱。目前二十一頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)四、應(yīng)用例１．氨基酸的分離（固定相為水）流動相分離情況正丁醇：2mol/LHAc=1:1酪氨酸、二碘酪氨酸用水飽和的芐醇亮氨酸、異亮氨酸叔丁醇：甲乙酮：甲酸：水＝16:16:0.1:3.9亮氨酸、異亮氨酸目前二十二頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)四、應(yīng)用例2.糖的分離(固定相為水)流動相分離情況醋酸乙脂:吡啶:水=2:1:1木糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖丁醇:吡啶:水=45:25:40乳糖、半乳糖、葡萄糖丁醇:乙醇:水:NH3=40:10:49:1尿中葡萄糖丁醇:乙醇:水=10:1:2蜜二糖、果糖、葡萄糖、目前二十三頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)四、應(yīng)用例３．脂肪酸的分離（固定相為水）流動相分離情況95%乙醇：濃氨水＝100:1同系的直鏈脂肪酸正己醇：1.5mol/L氨水＝1:1烷氧基酸流動相1:乙醇：濃氨水:H2O=80:5:15流動相2：乙二醇乙醚：桉樹腦：88%甲酸=5:5:2草酸、酒石酸、檸檬酸、蘋果酸、羥基醋酸、順丁烯二酸、丙二酸、乳酸、琥珀酸、烏頭酸、己二酸、延胡索酸、葵二酸目前二十四頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)四、應(yīng)用例4.醇、酚的分離（固定相為水）流動相分離情況丁醇：5%NaHCO3＝1:1甲醇、乙醇、異丙醇、異丁醇、異戊醇、辛醇己烷飽和甲醇乙醇、異丙醇、丙醇、異丁醇、正丁醇丁醇：乙醇：水＝4:1.1:1.9乙二醇、丙三醇、甘露糖醇、山梨醇、肌醇目前二十五頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)四、應(yīng)用流動相分離情況正丁醇：濃氨水：水＝4:1:5磺胺嘧啶、磺胺噻睉、Sulfamerzine、p,p’-sulfonyldianiline正丁醇：醋酸：水＝4:1:5對胺基苯甲酸、維生素C、N－甲基－菸酰胺、菸堿酰胺、菸酸、潘妥寧、泛酸、VB6、VB1甲苯：石油醚：乙醇：水＝200:100:30:70雌酮、雌二酮、雌三酮、馬烯雌酮、脫氫皮質(zhì)甾酮酸、孕甾酮、順式睪丸甾酮例5.其它類的分離（固定相為水）目前二十六頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)四、應(yīng)用例6．無機(jī)應(yīng)用（固定相為水）流動相分離情況12mol/LHCl:甲醇:丁醇:甲基異丁酮＝55:35:5:5K+、Rb+

、Cs+乙醇：水＝80:20Li+

、Na+

、K+10%HCl的水飽和丁醇Zn2+－Ga3+－In3+

－Al3+苯酚:甲醇:HCl＝5:3:2Al3+－Ga3+－In3+－Tl3+目前二十七頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)四、應(yīng)用例7．生物學(xué)應(yīng)用黑毛紅毛黃毛白毛

取不同顏色兔毛(300~500mg),干法灰化,溶于稀HCl中,用丙酮:丁醇:HCl=10:4:2,展開后,顯色目前二十八頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)Exercise1用紙色譜分離混合物中物質(zhì)A和B，已知兩者的比移值分別為0.50和0.60，問欲使層析后斑點(diǎn)顯著分開，斑點(diǎn)間至少間隔1cm，問濾紙應(yīng)截取多長？

設(shè)前沿為l，原點(diǎn)到A、B斑點(diǎn)中心距離分別為a、b，兩斑點(diǎn)間至少間隔1cm，那么兩斑點(diǎn)中心相距為2.0cm，則可列出：解：原點(diǎn)應(yīng)距濾紙下端4cm，前沿應(yīng)距濾紙上端2-3cm，應(yīng)截取濾紙長20+4+2=26cm,濾紙條應(yīng)截取26-27cm長。目前二十九頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)Exercise2紙色譜法分離混合離子,若混合離子極性大小順序?yàn)锳>B>C,用弱極性有機(jī)溶劑展開后其Rf值大小順序?yàn)開_____________________。

C,B,A目前三十頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)§5－2薄層色譜法（TLC）一、基本原理和特點(diǎn)二、吸附劑三、操作技術(shù)四、應(yīng)用目前三十一頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)一、基本原理和特點(diǎn)[原理]:經(jīng)典的薄層色譜是以吸附劑為固定相的一種液相色譜法，利用試樣組分在流動相（展開劑）和固定相（吸附劑）之間反復(fù)吸附、溶解而分離。

實(shí)際上，薄層色譜的固定相不僅僅局限于吸附劑，也可以在鋪好的惰性薄層上均勻地再涂一種作為固定液的液體，進(jìn)行分配分離。目前三十二頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)一、基本原理和特點(diǎn)[特點(diǎn)]:

裝置簡單、操作方便展開時間短（10～60min）靈敏度高：可以檢出0.01μg

顯色方法多于紙色譜[缺點(diǎn)］：Rf值的重復(fù)性差定性分析：Rf定量分析：光度法或熒光法目前三十三頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)二、吸附劑［要求］：合適的吸附力與展開劑、被吸附物質(zhì)均不起化學(xué)反應(yīng)粒度細(xì)小而且均勻

常用的吸附劑有氧化鋁、硅膠。此外，硅藻土、硅酸鹽、雜多酸鹽、聚酰胺、纖維素也可用作吸附劑。根據(jù)范氏方程，減少渦流擴(kuò)散項(xiàng)目前三十四頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)1.氧化鋁

氧化鋁可分為中性、堿性和酸性三種，一般常用堿性氧化鋁。通常用于分離碳?xì)浠衔铩⑸飰A類和對堿性物質(zhì)比較穩(wěn)定的中性和堿性物質(zhì)。酸性化合物可用酸性氧化鋁分離。

氧化鋁的活性與含水量密切相關(guān)（含一定量的水份時，吸附劑表面的吸附中心會被水分子占據(jù)）目前三十五頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)1.氧化鋁活性Ⅰ

Ⅱ

Ⅲ

Ⅳ

Ⅴ含水量(％)０３６１０１５Δ100~150oC,除去Al2O3中與羥基結(jié)合的部分水份，使Al2O3有一定的活性Δ150~300oC，

Al2O3活性達(dá)Ⅱ～Ⅲ級Δ300~400oC，Al2O3活性達(dá)Ⅰ

～Ⅱ級Δ>600oC，Al2O3進(jìn)一步脫水并開始燒結(jié)一般要求薄板用的活性為Ⅱ~Ⅲ級目前三十六頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)

由于脫水過程受到許多因素的影響，因此，每批生產(chǎn)的Al2O3

，其表面積和表面孔穴結(jié)構(gòu)并不一致，活性也不相同。

Al2O3活性的測定：取20μL染料溶液（偶氮苯30mg、對－甲氧基偶氮苯、蘇丹黃、蘇丹紅、和對氨基偶氮苯各20mg，溶解于50mLCCl4中），加到薄板上，用CCl4展層，根據(jù)下表確定活性。目前三十七頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)活性ⅡⅢⅣⅤRf,偶氮苯0.590.740.850.95Rf,對-甲氧基偶氮苯0.160.490.690.89Rf,蘇丹黃0.010.250.570.78Rf,蘇丹紅0.000.100.330.56Rf,偶氮苯0.000.030.080.19Al2O3活性表目前三十八頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)市售的供薄層色譜用的Al2O3有:Al2O3

－H氧化鋁中無粘合劑Al2O3

－G氧化鋁中含煅石膏（一般5％煅石膏）［煅石膏CaSO4，作為粘合劑］Al2O3

－HF254氧化鋁中不含煅石膏，僅含熒光指示劑（在254nm下呈黃綠色熒光）Al2O3

－GF254氧化鋁中既含煅石膏又含熒光指示劑（在254nm下呈黃綠色熒光）上述商品可以直接調(diào)料涂敷（1份料，2份水調(diào)合）目前三十九頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)2.硅膠

硅膠是微酸性吸附劑，適用于酸性、中性物質(zhì)的分離（如有機(jī)酸、氨基酸、萜類、甾類），堿性物質(zhì)則能與硅膠作用（當(dāng)用中性溶劑展層，堿性物質(zhì)有時停留在原點(diǎn)不動，或者得到拖尾的斑點(diǎn)，而不能很好的分離）活性ⅠⅡ

ⅢⅣⅤ含水量（％）05152535注硅膠薄層的活化溫度不能高于200oC目前四十頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)

硅膠活性的測定：稱取二甲黃、蘇丹紅、靛酚藍(lán)各40mg溶于100mL苯中，將此混合液滴加于薄層上，用石油醚展開10cm，混合物應(yīng)不動；如用苯展開，則應(yīng)分成三個斑點(diǎn)，其Rf值分別為：二甲黃0.58，蘇丹紅0.19，靛酚藍(lán)0.08（展層時間30~45min），則認(rèn)為此硅膠合格。經(jīng)本法測定的活性與Al2O3活性Ⅱ~Ⅲ級相當(dāng)。

薄層用商品硅膠有：硅膠H（不含粘結(jié)劑）、硅膠G（含粘結(jié)劑煅石膏）、硅膠HF254（含熒光物質(zhì)的硅膠）硅膠GF254（含有煅石膏和熒光劑）目前四十一頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)3.吸附劑的選擇1）根據(jù)樣品組分的性質(zhì)親脂性選擇硅膠、氧化鋁、乙?；w維素、聚酰胺等親水性選擇離子交換纖維素、硅藻土等酸性物質(zhì)首選硅膠板，堿性物質(zhì)首選氧化鋁板極性很大的物質(zhì)解吸難時可用聚酰胺（如酚）2）根據(jù)吸附劑的性質(zhì)適宜活性：活性大，易脫尾；活性小，不能分離考慮吸附劑對樣品的作用：如堿性氧化鋁對酯的水解起催化作用。目前四十二頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)三、操作技術(shù)1.薄層板的制備2.樣品溶液的配制3.點(diǎn)樣4.展開5.顯色6.定性定量分析7.常見問題及消除方法目前四十三頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)1.薄層板的制備

玻璃板

a.平整、去油、去污（可用濃H2SO4-K2CrO7洗液浸洗，或丙酮擦洗，自來水洗凈后，烘干）

b.玻璃板的尺寸根據(jù)自己的需要自由選擇，小的可用2.57.5cm的載玻片,大的可用2020cm的玻片。

涂鋪液

取一定量的吸附劑放入研缽中，加入需要的水或適當(dāng)?shù)娜軇?，研磨時間以調(diào)成稀糊狀為度，當(dāng)濃度均一后，即成膠狀物，色澤潔白為最佳，立即傾入玻璃板上，用下述方法涂布。目前四十四頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)1.薄層板的制備

涂布方法

軟板的制備：干法鋪層。

硬板的制備：濕法鋪板。方法有傾注法，平鋪法和涂鋪器法三種。目前廣為應(yīng)用的是涂鋪器法，操作簡便，薄板厚度均勻，適合于定量分析。目前四十五頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)1.薄層板的制備

活化

薄板首先風(fēng)干，否則濕板一下加熱到高溫，烘出的薄板很酥松，使用效果不好。

氧化鋁G板在150~160oC,烘4小時(Ⅱ級左右)

硅膠G板在110oC烘1小時薄板經(jīng)活化后，一定要儲藏在密閉的干燥器或烘箱中備用。目前四十六頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)2.樣品溶液的制備

首先將固體樣品粉碎過篩：疏松的粉末過40目篩，堅(jiān)實(shí)的粉末過80目篩

用適宜的方法和溶劑提取樣品組分：其提取方法包括索式提取器提取法、冷浸法、熱回流法、振搖提取法、超聲提取法。

樣品溶液的精制（除去雜質(zhì)）：溶劑萃取或柱色譜法

溶液的蒸發(fā)與殘?jiān)娜芙猓▽θ芤簼饪s）：（常用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、KD濃縮器、水浴蒸發(fā)等）目前四十七頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀KD濃縮器目前四十八頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)3.點(diǎn)樣

點(diǎn)樣方法類似于紙色譜

點(diǎn)樣量一般1~10μL。點(diǎn)樣器有微量注射器，容量毛細(xì)管和精密的自動或半自動點(diǎn)樣儀點(diǎn)樣的形狀一般為圓點(diǎn)，直徑小于3mm切勿損傷薄層表面目前四十九頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)4.展開1）對展開劑的要求※

能夠溶解待測組分※

能使待測組分與雜質(zhì)分開※

使待測組分的Rf值在0.2~0.8之間，定量測定最好在0.3~0.5之間?！?/p>

不能與待測組分或吸附劑發(fā)生化學(xué)反應(yīng)※

具有適中的沸點(diǎn)和比較小的粘度※

混合溶劑最好臨用前新鮮配制。目前五十頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)2）展開劑的性質(zhì)A極性：單一溶劑的極性順序是：石油醚<環(huán)己烷<二硫化碳<苯<四氯化碳<三氯乙烯<甲苯<二氯甲烷<氯仿<乙醚<乙酸乙酯<丙酮<乙醇<甲醇<水

混合溶劑的極性參數(shù)P’=δAPA＋δBPB（δA是體積分?jǐn)?shù)）B強(qiáng)度在吸附色譜中，用εo表示，指溶劑在單位表面積的標(biāo)定活性的吸附劑上的吸附能。分配色譜與極性參數(shù)有關(guān)。目前五十一頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)C展開劑的選擇性組別溶劑名稱Ⅰ脂肪族醚，三級烷胺，四甲基胍，六甲基磷酰胺Ⅱ脂肪醇Ⅲ吡啶，四氫呋喃，酰胺（除甲酰胺），乙二醇醚，亞砜Ⅳ乙二醇，苯甲醇，甲酰胺，乙酸Ⅴ二氯甲烷，二氯乙烷Ⅵa磷酸三甲苯酯，脂肪族酮和酯，聚醚，二氧六環(huán)Ⅵb腈，砜，碳酸丙烯酯Ⅶ硝基化合物，芳香醚，芳烴，鹵代芳烴Ⅷ氟烷醇，間甲苯酚，氯仿，水

根據(jù)溶劑分子與樣品分子間的四種作用力，將溶劑分為八組。目前五十二頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)3）展開劑的選擇A總原則：

先用一展開劑，它的極性或強(qiáng)度能夠使容量因子k最好在0.5~5之間（或Rf值在0.2~0.6)，然后保持此強(qiáng)度不變，然后根據(jù)溶劑的選擇性再更換其他的展開劑，直到使待測組分很好分離。B二元展開劑的選擇由一個強(qiáng)度較強(qiáng)的溶劑和一個強(qiáng)度近于零的溶劑（強(qiáng)度調(diào)節(jié)劑）混合并計算其強(qiáng)度。正相TLC多用正己烷為強(qiáng)度調(diào)節(jié)劑，反相TLC則使用水。目前五十三頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)3）展開劑的選擇C多元展開劑的選擇Glajch提出了確定溶劑強(qiáng)度和選擇性的最優(yōu)化三角形法.

做法如下：先選三種選擇性相差大的純?nèi)軇?，再選一種調(diào)節(jié)極性的純?nèi)軇┙M成三個相等洗脫強(qiáng)度的二元基本溶劑A,B,C.BACDEFGHIJ

然后再分別配成A:B:C=0.5:0.5:0,(D)0.5:0:0.5(E),0:0.5:0.5(F)和0.33:0.33:0.33(G),0.67:0.16:0.16(H)0.16:0.16:0.67(I),0.16:0.67:0.16(J)的幾種混合溶劑。目前五十四頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)以正相TLC法為例：1）先選擇溶劑選擇性相差較大的三種溶劑：乙醚(Ⅰ)、氯仿(Ⅷ)和二氯甲烷(Ⅴ)。選正己烷為極性調(diào)節(jié)劑。2)用氯仿-正己烷的不同比例在硅膠板上分離樣品，發(fā)現(xiàn)用氯仿：正己烷＝34：66的組成比例可使斑點(diǎn)(待測組分)的Rf在0.3~0.5之間，算出極性參數(shù)：P’=4.1×0.34+0.1×0.66=1.46。保持P’不變，計算出其他兩個二元溶劑的體積比。二氯甲烷：正己烷＝45：55，乙醚：正己烷＝50：50。3)再根據(jù)Glajch三角形圖，確定其他七種多元體系的體積比。目前五十五頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)4）展開方式TLC的展開方式類似于紙色譜。矮型色譜缸內(nèi)一般用近水平上行展開，不加粘合劑的板層也適合在此展開；直立上行一般在長方筒形或雙底槽色譜缸中進(jìn)行，這種展開只適合含有粘合劑的薄層。目前五十六頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)5.顯色1）光學(xué)檢出法本身是有色物，可以直接觀測斑點(diǎn)的位置和顏色本身無色但在紫外線的照射下會發(fā)出不同顏色的熒光在可見光和紫外光下都不顯示，也沒有合適的顯色方法，可以用熒光薄板(硅膠HF254+366,硅膠GF254,...)進(jìn)行分離,欲測物吸收紫外線,在熒光背景下呈暗色目前五十七頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)5.顯色3）生物自顯影

對于抗菌素等具有生物活性的物質(zhì)，將分離后的薄層與具有適當(dāng)微生物的瓊脂培養(yǎng)基表面接觸，經(jīng)過培養(yǎng)后觀察抑菌點(diǎn)。4）放射自顯影

在薄層上分離的放射性同位素的輻射線，可使照相底片感光，照片所呈暗度與斑點(diǎn)的放射活性成正比，因此，得到的放射顯跡圖可以定性和定量。2)蒸氣顯色法利用一些物質(zhì)的蒸氣與樣品作用生成不同顏色或產(chǎn)生熒光。如多數(shù)有機(jī)物吸附碘蒸氣顯示黃色斑點(diǎn)。目前五十八頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)5.顯色5）試劑顯色法

薄層色譜中顯色最多的方法是光學(xué)檢出法和試劑顯色法

展開后的薄層根據(jù)待測化合物的性質(zhì)選擇適當(dāng)?shù)娘@色劑使之生成顏色穩(wěn)定、輪廓清晰、靈敏度高的色斑。由于對薄層板的處理方式不同，試劑顯色法又分為噴霧顯色和浸漬顯色兩種。不加粘合劑的薄板禁用

有些顯色反應(yīng)需要加熱，一般在恒溫烤箱內(nèi)進(jìn)行，溫度控制在100~110℃。目前五十九頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)表主要顯色試劑試劑配制及使用方法檢出范圍濃H2SO4噴霧,100~120oC,觀察顏色變化高級醇、醛、酮、甾體H2SO4-K2Cr2O75gK2Cr2O7+100mLH2SO4,噴霧,280oC觀察顏色變化全部有機(jī)物2’,7’-二氯熒光黃(0.2%乙醇)噴霧，紫外線照射類脂類化合物I2-KI1gI2+10gKI溶于50mLH2O中，加入2mLHAc，稀釋至100mL，噴霧生物堿目前六十頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)試劑配制及使用方法檢出范圍溴甲酚綠0.04g溶于100mL乙醇中，以0.1mol/LNaOH調(diào)至藍(lán)色剛消失，<pH3.6顯黃色羧基酸Ag(NH3)2+2.6gAgNO3溶于50mL水，加入NH3H2O至沉淀剛好消失還原性物質(zhì)、醛、還原糖茚三酮0.5%丙酮溶液胺類（如麻黃堿、氨基酸等）FeCl31g溶于100mL酚羥基、鞣質(zhì)、黃酮磷鉬酸5g溶于100mL95%乙醇脂肪、甾類、類脂、三萜酸、生物堿續(xù)表主要顯色試劑目前六十一頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)6.定性定量分析1）定性分析

比移值定性：標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對照。

光譜定性：薄層掃描儀

各種聯(lián)用檢測儀器聯(lián)用：將斑點(diǎn)吸附轉(zhuǎn)移到試管中，用其他方法純化，然后進(jìn)行紫外、熒光、紅外等光譜法定性。目前六十二頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)6.定性定量分析2）定量分析

目視比較半定量法：雜質(zhì)的限量實(shí)驗(yàn)。測量斑點(diǎn)面積：要求斑點(diǎn)邊緣清晰從薄層上將被測組分洗脫下來進(jìn)行定量測定：先確定斑點(diǎn)，再取下斑點(diǎn)和吸附劑，最后用適當(dāng)?shù)南疵搫┫疵摲治鑫?，進(jìn)行測定薄層色譜掃描儀原位定量測定：紫外－可見吸收測定或熒光測定法。目前六十三頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)7.常見問題及消除辦法1）斑點(diǎn)拖尾現(xiàn)象▲酸性物質(zhì)用中性溶劑展開時，造成拖尾。（在展開劑中加入一定濃度的酸）。堿性物質(zhì)類似?！趬A性氧化鋁薄層上分離酸性物質(zhì)，或在硅膠G板上分離生物堿，由于成鹽而造成拖尾。（禁止此類操作）▲點(diǎn)樣量過多造成拖尾（減少點(diǎn)樣量）目前六十四頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)7.常見問題及消除辦法3）邊緣效應(yīng)

板層中部斑點(diǎn)的Rf值小于兩側(cè)斑點(diǎn)的Rf值，這是因?yàn)榉悬c(diǎn)較低的和與吸附劑親和力弱的溶劑在薄層的兩個邊緣處較易揮發(fā)（用刀片刮去同樣寬度的邊或增加板層的預(yù)飽和時間）2）S形及波浪形斑點(diǎn)

主要由于吸附劑的顆粒細(xì)度和板層厚度不均勻造成（鋪板時要注意這個問題）目前六十五頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)7.常見問題及消除辦法5）Rf值不穩(wěn)定

溫度、分配系數(shù)、展開劑的揮發(fā)、板層厚度和不同批號的薄層板都影響Rf值。注意逐一分析。4）展速慢

加入丙酮等中等極性溶劑可使不相混合的溶劑混合，加快展速。目前六十六頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)四、應(yīng)用1.氨基酸分離薄層:硅膠G板;流動相:

正丁醇:醋酸:水=3:1:1Rf值:丙氨酸0.27,氨基辛酸0.60,精氨酸鹽酸鹽0.08,磺基丙氨酸0.14,胱氨酸鹽酸鹽0.16,二羥基苯丙氨酸0.45,

甘氨酸0.22,組氨酸鹽酸鹽0.06,羥脯氨酸0.20,亮氨酸0.47,甲硫氨酸0.40,頡氨酸0.36,

苯丙氨酸0.49,脯氨酸0.19,肌氨酸0.17,蘇氨酸0.25,色氨酸0.56目前六十七頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)2.核苷,核苷酸,寡核苷酸的分離薄層:硅膠F254

流動相:正丁醇:HAc:H2O=5:2:3Rf值:腺苷-5`-磷酸0.35,胞苷-5`-磷酸0.24,脫氧腺苷-5`-磷酸三氯乙酯0.74,脫氧胸苷酰(3`,5`)脫氧胸腺嘧啶核苷0.61,5-甲基尿苷-5`-磷酸酯(胸苷-5`-磷酸)0.37,5`-0-磷酸基脫氧胸腺嘧啶核苷酰-(3`5`)脫氧胸腺苷酰-(3,5)脫氧胸苷0.19,5`-0-三氯乙基-磷酸脫氧腺苷酰(3`,5)脫氧腺苷0.68,尿苷-5`-磷酸0.30四、應(yīng)用目前六十八頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)3.類固醇、固醇的分離薄層：Al2O3

流動相：C6H6:乙酸乙酯=4:1Rf值:膽甾醇0.83,別色膽甾醇0.77,-谷甾醇0.63,豆甾醇0.62,-谷甾烷醇0.444.堿金屬的分離薄層:硅膠卷流動相：含0.1mol/LI2

的硝基甲烷:C6H6=40:60Rf值:Cs+0.55,Rb+0.47,K+0.36,NH4+0.24,Na+0.18,Li+0.06四、應(yīng)用目前六十九頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)§5－3凝膠色譜法一、基本原理和特點(diǎn)二、凝膠的種類和性質(zhì)三、操作技術(shù)四、應(yīng)用目前七十頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)一、基本原理和特點(diǎn)

1.原理：按溶質(zhì)分子大小分離。小分子可以擴(kuò)散到凝膠空隙，由其中通過，出峰最慢；中等分子只能通過部分凝膠空隙，中速通過；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶劑分子小，故在最后出峰。所以凝膠色譜又稱為排阻色譜。它的分離機(jī)理與其他色譜完全不同，它不是依靠溶質(zhì)在兩相間的作用力不同而分離的。

目前七十一頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)2.特點(diǎn)：◎全部在死體積前出峰。所以保留時間短，柱內(nèi)峰擴(kuò)展就比其他分離方法小很多，所以峰通常比較窄，有利于檢測。

◎分離對象范圍寬?？蓪ο鄬Ψ肿淤|(zhì)量在100-105范圍內(nèi)的化合物按質(zhì)量分離

◎

固定相和流動相選擇方便，根據(jù)流動相不同，分為兩類：以水溶液作流動相的叫做凝膠過濾色譜，分離溶于水的物質(zhì)；以有機(jī)溶劑為流動相的叫做凝膠滲透色譜，分離不溶于水的物質(zhì)。◎

只能分離相對分子質(zhì)量相差10％以上的分子，不能分離分子量接近、分子大小相似的分子。一、基本原理和特點(diǎn)目前七十二頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)二、凝膠的種類和性質(zhì)

1.凝膠的種類所謂凝膠，是含有大量液體（一般是水）的柔軟而富有彈性的物質(zhì)，是一種經(jīng)過交聯(lián)而具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的多聚體。

?根據(jù)凝膠的來源分類，凝膠可分為無機(jī)凝膠和有機(jī)凝膠兩類。

?根據(jù)凝膠的制備方法可分為均勻凝膠、半均勻凝膠和非均勻凝膠。

?根據(jù)凝膠使用的強(qiáng)度可分為軟質(zhì)凝膠、半硬質(zhì)凝膠、硬質(zhì)凝膠。

?根據(jù)凝膠對溶劑的適用范圍，凝膠可分為親水性、親油性和兩性凝膠。目前七十三頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)二、凝膠的種類和性質(zhì)①多孔硅膠

是使用較多的無機(jī)凝膠，它的特點(diǎn)是穩(wěn)定性好、機(jī)械強(qiáng)度好，可在柱中直接更換溶劑。缺點(diǎn)是吸附問題，需要經(jīng)特殊處理。一般表面未處理硅膠可用于水、酸體系，但不能用于強(qiáng)堿性溶劑；表面硅烷化的硅膠可用于有機(jī)溶劑。由于多孔硅膠的機(jī)械強(qiáng)度高，因此在交聯(lián)聚苯乙烯凝膠后，細(xì)粒度的多孔硅膠已經(jīng)發(fā)展成為一種很好的高速、高效凝膠色譜填料。其中以μBondagel更有特色，能成功分離水中的生化體系。目前七十四頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)二、凝膠的種類和性質(zhì)②

交聯(lián)聚苯乙烯凝膠

商品名叫Styrogel，這種凝膠孔徑分布比較寬，因此分子量分離范圍比較大，可分離分子量從1600到40000000的生物大分子。主要使用非極性溶劑，丙酮、乙醇等極性溶劑不能應(yīng)用，且不能在柱中直接更換溶劑。最高使用溫度為150℃，一般裝完柱后不再拆下來。洗脫劑可用甲基亞砜。適用于有機(jī)多聚物、分子量測定和脂溶性天然物的分離。目前七十五頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)二、凝膠的種類和性質(zhì)③交聯(lián)葡聚糖凝膠

商品名叫Sephadex，是最早發(fā)展的有機(jī)凝膠。主要有sephadexG型和SephadexLH－20型。

SephadexG型的凝膠在字母G后面用阿拉伯?dāng)?shù)字表示得水值的10倍。如G－25表示每克凝膠膨脹時吸水2.5克。目前主要有G－10，15，25，50，75，100，150，200等型。主要應(yīng)用于生物高分子如蛋白質(zhì)、核酸、酶以及多糖類的分離，生化體系的脫鹽等。

SephadexLH－20型是sephadexG－25的羧丙基衍生物，屬于兩性凝膠，可用于分離不溶于水的物質(zhì)。目前七十六頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)二、凝膠的種類和性質(zhì)④交聯(lián)聚丙烯酰胺凝膠

是丙烯酰胺和次甲基雙丙烯酰胺的共聚物，其商品名為Bio-GelP，型號有P－2,4,6,10,30,60,100,150,200，300等10種。P后面的數(shù)字乘以1000就是凝膠的排阻限度。這類凝膠的優(yōu)點(diǎn)是孔徑尺寸范圍較寬，所以分離范圍大。如Bio－GelP－300分離分子的分子量范圍可從60000～400000。骨架沒有離子基團(tuán)，因而吸附效應(yīng)小。不溶于水、鹽溶液和普通有機(jī)溶劑。其最大弱點(diǎn)是不耐酸，遇酸時酰胺鍵易水解產(chǎn)生羧基，帶上一定量的離子交換基團(tuán)，一般在pH2～11范圍內(nèi)比較穩(wěn)定。目前七十七頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)二、凝膠的種類和性質(zhì)⑤瓊脂糖凝膠

是全天然凝膠，商品名較多。如Sepharose（瑞典pharmacia），Bio－Gel－A（美國Bio－Rad）等。它是瓊脂經(jīng)過分級沉淀除去了帶電荷的瓊脂膠，留下了不帶電荷的瓊脂糖的產(chǎn)品，然后在油相中分散成球。它是用來分離高分子量物質(zhì)的凝膠，滲透極限極高，分離范圍的下限相當(dāng)于前兩種凝膠的上限。因而瓊脂糖凝膠使得分離一些分子量極高的物質(zhì)如病毒成為可能。瓊脂糖凝膠在高溫下不穩(wěn)定，在40℃以上就開始熔解。要避免如脲素溶液等破壞氫鍵結(jié)構(gòu)的淋洗劑。要用化學(xué)滅菌的方式殺菌，避免堵塞柱子。目前七十八頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)二、凝膠的種類和性質(zhì)

2.凝膠的性質(zhì)凝膠的性質(zhì)分為凝膠的結(jié)構(gòu)參數(shù)和色譜指標(biāo)兩類。凝膠的結(jié)構(gòu)參數(shù)一般有粒度、比表面積、孔體積、堆比重（指緊密堆積每毫升凝膠的重量）、骨架密度、孔度（孔的體積占多孔性物質(zhì)總體積的分?jǐn)?shù)）、平均孔徑和孔徑分布等。凝膠的色譜指標(biāo)主要有滲透極限、分離范圍、固流相比和柱效四個。目前七十九頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)二、凝膠的種類和性質(zhì)①滲透極限

指凝膠可以用來分離高分子的最大極限。超過這個極限，高分子都在凝膠粒間隙體積V0處流出，沒有分離效果。②分離范圍

一般是指分子量－淋出體積標(biāo)定曲線的線性部分。孔徑分布寬的凝膠分離范圍大。實(shí)際應(yīng)用時可以用不同規(guī)格的凝膠串聯(lián)起來。目前八十頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)二、凝膠的種類和性質(zhì)③固流相比

指固定相的體積（指色譜柱內(nèi)凝膠的全部可滲透的孔內(nèi)體積）比上流動相的體積（凝膠的粒間隙體積），它反映了色譜柱的分離容量。分離容量越大越好。④柱效是凝膠分離效率的量度?？捎脤?shí)驗(yàn)方法測定，讓一個小分子試樣流經(jīng)長度L的柱子，得到色譜峰（Ve是淋出體積，W是峰寬），則單位柱長的柱效為：目前八十一頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)三、操作技術(shù)1.層析柱的選擇

層析柱是凝膠分離的主體，一般使用玻璃管或有機(jī)玻璃管。層析柱的直徑不影響分離度，樣品用量大可選擇直徑大的柱。分離度與柱長的平方根成正比，但由于軟質(zhì)凝膠柱過高易造成擠壓變形從而堵塞柱子，所以一般不超過1m。分族分離柱長一般20～30cm，柱高與柱直徑之比一般在5：1～10：1之間，而分級分離柱長一般為50～100cm，柱高與柱直徑之比一般在20：1～100：1之間。目前八十二頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)三、操作技術(shù)2.凝膠的選擇

凝膠的選擇主要考慮兩點(diǎn)：Ⅰ）凝膠和溶劑的匹配Ⅱ）凝膠的孔徑及其分布與被測試樣分子體積范圍的匹配。由于目前凝膠種類繁多，所以選擇和流動相相匹配的凝膠并不難，只要求能被流動相溶解即可，而對于凝膠的孔徑和分布的選擇，一般需作標(biāo)定曲線，找出凝膠的選擇性滲透的范圍，再根據(jù)分子的體積范圍進(jìn)行選擇。目前八十三頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)三、操作技術(shù)3.凝膠的制備

商品凝膠是干燥的顆粒，使用前需要在欲分離的洗脫液中膨脹。為了加速膨脹，可用加熱法。即在沸水浴中將濕凝膠逐漸升溫，這樣可以大大加速膨脹，通常在1～2h之內(nèi)即可完成。特別在使用軟凝膠時，自然膨脹需24h甚至數(shù)天，而加熱法在幾小時內(nèi)即可完成。而且使用加熱法還可消毒，并除去凝膠中污染的細(xì)菌和空氣。目前八十四頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)三、操作技術(shù)4.裝柱

裝柱的基本原則是：色譜柱應(yīng)填得盡可能均勻和緊密，在柱中沒有裂縫或溝槽，也不發(fā)生柱的徑向或軸向凝膠的不均勻分布。色譜柱的裝填可以分為干法和漿法裝柱兩種。粒度較大的硬膠和多孔硅膠及多孔玻璃可以用干法裝柱；漿法裝柱首先需要尋找與凝膠密度相同的混合溶劑，這樣才不會發(fā)生粒度分層。目前八十五頁\總數(shù)九十六頁\編于八點(diǎn)三、操作技術(shù)5.溶劑的選擇

①溶劑應(yīng)與凝膠色譜儀匹配：首先考慮色譜儀材料能否忍受的問題，如腐蝕不銹鋼的溶劑不能選。另外，溶劑還應(yīng)與檢測器匹配，如使用示差折光檢測器，那么溶劑的折光指數(shù)應(yīng)與被測試樣的折光指數(shù)有盡可能大的差別。

②盡可能使用純