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文檔簡介

第二章目的基因獲得演示文稿目前一頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點(優(yōu)選)第二章目的基因獲得目前二頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點三、目的基因的獲得限制酶酶切直接分離法PCR擴增法從mRNA合成cDNA化學(xué)合成法通過構(gòu)建基因文庫分離法目前三頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點對已克隆在載體中的目的基因,可根據(jù)目的基因兩側(cè)的限制酶識別序列,選擇適當(dāng)?shù)南拗泼该盖?,獲得目的基因。(一)限制酶酶切直接分離法注意:目的基因內(nèi)部不能有該限制酶的切點,否則目的基因會被切成碎片!目前四頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點Ampr5’AOX1HIS4Kanr3’AOX1ColE1pPIC9K/hVEGF165EcoRINotIBglIIhVEGF165BglII9.8KbTTSAmpr5’AOX1HIS4Kanr3’AOX1ColE1

pPIC9K9.3KbBglIIBglIISnaBIEcoRIAvrIINotISTTf1oriAmprlacZpGEM-T/hVEGF165hVEGF1653.5Kb目前五頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點

(二)PCR法擴增目的基因利用耐熱DNA聚合酶的反復(fù)作用,通過變性-退火-延伸的循環(huán)操作,在體外迅速將DNA模板擴增數(shù)百萬倍的操作技術(shù)。PCR(polymerasechainreaction):目前六頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點以目的基因為模板,合成互補的新DNA鏈。雙鏈DNA解鏈為單鏈DNA;引物與模板單鏈DNA的特定互補部位配對、結(jié)合;退火:變性:延伸:變性退火延伸目前七頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點

30thcycle?由于每一循環(huán)所產(chǎn)生的DNA片段均能成為下一次循環(huán)的模板,故PCR產(chǎn)物以指數(shù)方式增加,即Y=2n(n為循環(huán)次數(shù))。230(109)copies目前八頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點PCR技術(shù)的發(fā)明--DNA操作技術(shù)的革命發(fā)明人:美國生化學(xué)家KaryB.MullisTheNobelPrizeinChemistry1993MullisKB.Theunusualoriginofthepolymerasechainreaction.ScientificAmerican.1990,262(4):56-61,64-5.1990.04MullisKB.Dancingnakedinthemindfields.1998.04目前九頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點1983.03

開汽車時的聯(lián)想:蜿蜒崎嶇的山路--DNA雙螺旋行駛的汽車--一小段DNA引物1972在加州大學(xué)伯克利分校獲得博士學(xué)位1979進入私人生物技術(shù)公司Cetus

1983.08正式做有關(guān)PCR原理的報告1983.09Mullis開始動手做實驗1984.11首次取得可信結(jié)果1985.01

RandallSaiki加入,結(jié)果毋庸置疑目前十頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點1985.03Cetus公司申請專利1985.12SaikiRK,ScharfSJ,FaloonaFA,MullisKB,HornGT,ErlichHA,ArnheimN.Enzymaticamplificationofbeta-globingenomicsequencesandrestrictionsiteanalysisfordiagnosisofsicklecellanemia.Science.1985,230(4732):1350-4.1986.05冷泉港“人類分子生物學(xué)”專題研討會1987.01MullisKB,FaloonaFA.SpecificsynthesisofDNAinvitroviaapolymerasecatalyzedchainreaction.MethodsinEnzymology.1987,155:335-50.目前十一頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點1991.12Cetus以$3億將專利賣給Hoffmann-LaRoche公司1986.06Saiki等將耐熱DNA聚合酶--Taq酶引入PCR技術(shù)。SaikiRK,GelfandDH,StoffelS,ScharfSJ,HiguchiR,HornGT,MullisKB,ErlichHA.Primer-directedenzymaticamplificationofDNAwithathermostableDNApolymerase.Science.1988,239(4839):487-91.1988.011989Science雜志將PCR列為十余項重大科學(xué)發(fā)明之首,比喻1989年為PCR爆炸年。1986.09Mullis離開Cetus公司目前十二頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點EppendorfBio-radABI目前十三頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點PCR法擴增目的基因的前提:已知目的基因全序列或其兩側(cè)序列,化學(xué)合成與模板互補的上、下游引物。

目前十四頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點

Taq酶無3’→5’外切酶活性,無閱讀校正功能,在擴增過程中會引起錯配,30次循環(huán)Taq酶錯配率約0.25%。措施:問題:

可能造成目的基因堿基序列的改變。原因:選擇高保真Taq酶,如Pfu。目前十五頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點因Taq酶對dATP具有優(yōu)先聚合活性。5’AAPCR擴增產(chǎn)物5’

由Taq酶擴增的PCR產(chǎn)物,3’末端總是帶有一個非模板依賴型的突出堿基,而這個堿基幾乎總是A,T載體TT5’5’T7lacZMCSoriAmpr可用T載體克隆。

目前十六頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點

(三)從mRNA合成cDNA以目的基因的mRNA為模板,在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下合成cDNA第一鏈,然后在Klenow酶作用下合成雙鏈cDNA。目前十七頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點此法適用于mRNA豐度極高的目的基因克隆,如血紅蛋白珠蛋白基因。哺乳動物的網(wǎng)織紅細胞中珠蛋白mRNA的比例占總mRNA的90%以上。目前十八頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點目的mRNA在細胞中的含量占細胞質(zhì)總mRNA量的0.5%以下。目的mRNA在細胞中的含量占細胞質(zhì)總mRNA量的50-90%。高豐度mRNA:低豐度mRNA:目前十九頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點步驟:dNTP逆轉(zhuǎn)錄酶primer逆轉(zhuǎn)錄酶催化合成cDNA第一鏈mRNAcDNA釣取目的基因的mRNAmRNA逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶去除mRNA-cDNA雜交鏈中的mRNA鏈cDNAKlenow酶dNTPKlenow酶合成cDNA第二鏈cDNAcDNA目前二十頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點釣取目的基因的mRNA:與oligo(dT)堿基互補的mRNA結(jié)合到柱上,非mRNA(tRNA、rRNA)流走??俶RNAoligo(dT)oligo(dT)oligo(dT)oligo(dT)纖維素柱oligo(dT)oligo(dT)oligo(dT)oligo(dT)纖維素柱總RNA1)提取特定組織或細胞的總RNA,用oligo(dT)纖維素柱分離總mRNA。目前二十一頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點2)根據(jù)已知基因序列合成DNA探針,結(jié)合到纖維素柱上,用來分離純化特定mRNA。與探針堿基互補的mRNA結(jié)合到柱上,其它mRNA流走。特定mRNA探針DNA探針DNA探針DNA探針DNA纖維素柱探針DNA探針DNA探針DNA探針DNA纖維素柱總mRNA目前二十二頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點克隆平端雙鏈cDNA的方法:平端直接與載體連接;平端接同聚尾;加裝人工接頭(adapter);加裝銜接物(linker)。目前二十三頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點加裝同聚物尾:

利用TdT,在雙鏈cDNA和載體3’端加互補的同聚物尾,退火連接成重組分子。1972年,斯坦福大學(xué)P.Labban和P.Kaiser發(fā)明。CCCCCCCCCCCCdCTPTdTcDNA5’3’載體5’3’GGGGGGGGGGGGdGTPTdTCCCCCCCCCCCCGGGGGGGGGGGGT4DNAligase目前二十四頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點加裝人工接頭(adapter)1978年,康奈爾大學(xué)吳瑞發(fā)明。

adapter是人工合成的一頭具有某種限制酶的粘性末端,另一頭為平末端的特殊的雙鏈寡核苷酸短片斷。GTCGCAGCTTAA5’3’EcoRIadapter目前二十五頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點注意:adapter易通過粘端堿基配對形成二聚體。GTCG

CAGCTTAA5’3’AATTCGAC

GCTG3’5’AATTCGAC

GCTGGTCGCAGCTTAA5’3’3’5’T4DNAligase將adapter連接到雙鏈cDNA的兩端,直接成為人工粘端。目前二十六頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點CIP去除adapter的5’-P,使5’-P成為5’-OH。5’

P-GTCG-OHOH-CAGCTTAA-P5’3’3’CIP5’OH-GTCG-OHOH-CAGCTTAA-OH5’3’3’措施:目前二十七頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點加裝銜接物(linker):

linker是人工合成的一段由10-12個核苷酸組成、具有一個或多個限制酶識別序列的平末端雙鏈寡核苷酸短片段。EcoRIlinker5’TGGAATTCCAACCTTAAGGT5’3’3’目前二十八頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點將雙鏈cDNA與linker連接,再用限制酶酶切,可產(chǎn)生粘性末端。目前二十九頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點

(四)化學(xué)合成法1979年,成功合成E.coli酪氨酸t(yī)RNA基因。

Science1976年,H.G.Khorana提出用化學(xué)方法合成基因的設(shè)想;目前三十頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點已知目的基因的DNA序列。化學(xué)合成法的前提:目前三十一頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點小片段粘接法補釘延長法大片段酶促法

戰(zhàn)略:化學(xué)合成的DNA片斷一般局限在200bp以內(nèi)。目前三十二頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點1)小片段粘接法:分別合成12-15bp的單鏈DNA小片段?;旌贤嘶餞4DNAligase片斷之間有互補區(qū),混合退火形成有斷點的雙鏈,再由T4DNAligase連接成完整雙鏈。目前三十三頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點2)補釘延長法:混合退火片斷之間有局部互補區(qū),可相互作為另一個片斷延長的引物,用Klenow酶延伸成完整雙鏈。T4DNA

ligaseKlenow分別合成12-15bp的單鏈DNA小片段及20-30bp的單鏈DNA中片段。目前三十四頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點3)大片段酶促法:分別合成40-50bp的單鏈DNA大片段?;旌贤嘶餞4DNA

ligaseKlenow片斷之間有局部互補區(qū),可相互作為另一個片斷延長的引物,用Klenow酶延伸成完整雙鏈。目前三十五頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點化學(xué)合成的份額較大,成本較高。大片段化學(xué)合成的收率極低,如合成50bp的DNA單鏈大片段的總收率僅7.7%。三種方法各有利弊:小片段粘接法:大片段酶促法:化學(xué)合成DNA的單鏈片段愈短,收率愈高;化學(xué)合成的份額較小,成本較低;目前三十六頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點化學(xué)合成DNA的實質(zhì)是按照序列要求將脫氧核苷酸單體一個個接上去,每接一個單體就是一個循環(huán)反應(yīng),包括:基團保護、分離、縮合、分離、去保護五大操作單元。目前三十七頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點DNA合成儀是根據(jù)固相亞磷酰胺三酯法原理設(shè)計的。從反應(yīng)機理上來講,DNA化學(xué)合成有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亞磷酰胺三酯法;具體操作過程又有液相合成和固相合成兩種形式。目前三十八頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點DNA合成儀基因合成一般都是自己設(shè)計序列,交給商業(yè)公司合成。目前三十九頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點DNA化學(xué)合成的用途:合成天然基因修飾改造基因設(shè)計新型基因合成測序或PCR引物制備寡核苷酸探針制備人工接頭(adaptor)和銜接物(linker)目前四十頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點合成天然基因:有些組織特異性mRNA含量很低,很難用cDNA法克隆。有些基因比較短,化學(xué)合成費用較低。

如:生長激素釋放抑制激素基因、腦啡肽基因、胰島素基因、干擾素基因等。目前四十一頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點合成寡核苷酸探針(oligonucleotideprobe):根據(jù)已知核酸序列,用DNA合成儀合成一定長度的寡核苷酸片段,作為探針使用。若未知核酸序列,可根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸序列倒推出核酸序列,但需考慮密碼子的簡并性。目前四十二頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點大多數(shù)氨基酸擁有簡并密碼子。某段連續(xù)的氨基酸序列:CysMetAspGluMetLys可能的DNA序列:TGTATGGACGAAATGAAA

CTG

G

設(shè)計系列探針:TGTATGGACGAAATGAAATGTATGGACGAGATGAAATGTATGGATGAAATGAAATGTATGGATGAGATGAAATGTATGGACGAAATGAAGTGTATGGACGAGATGAAGTGTATGGATGAAATGAAGTGTATGGATGAGATGAAGTGCATGGACGAAATGAAATGCATGGACGAGATGAAATGCATGGATGAAATGAAATGCATGGATGAGATGAAATGCATGGACGAAATGAAGTGCATGGACGAGATGAAGTGCATGGATGAAATGAAGTGCATGGATGAGATGAAG目前四十三頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點(五)通過構(gòu)建基因文庫分離目的基因基因庫(genepool)基因文庫(genelibraryorgenebank)

基本概念:目前四十四頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點是特定生物體全基因組的集合(天然存在)?;驇欤?/p>

目前四十五頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點是從特定生物個體中分離的全部基因,這些基因以克隆形式存在(人工構(gòu)建)?;蛭膸欤耗壳八氖揬總數(shù)一百零二頁\編于七點根據(jù)構(gòu)建方法的不同,基因文庫分為:基因組文庫(genomicDNAlibrary)

cDNA文庫(cDNAlibrary)

目前四十七頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點基因組文庫:

cDNA文庫:含全部基因。含全部蛋白質(zhì)編碼的結(jié)構(gòu)基因。鳥槍法構(gòu)建;材料來自染色體DNA;cDNA法構(gòu)建;材料來自mRNA;目前四十八頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點1、基因組文庫將某種生物基因組DNA經(jīng)超聲波或限制酶部分酶切處理后,與載體連接,轉(zhuǎn)化宿主細胞,得到含全部基因的克隆群體。目前四十九頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點1、基因組DNA的制備:制備的DNA分子量越大,切割后含不規(guī)則末端DNA片段的比率越低,重組率和完備性越高?;蚪M文庫的構(gòu)建為最大限度保證基因的完整性,基因組DNA在分離純化操作中應(yīng)避免過度斷裂。

目前五十頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點常規(guī)方法制備的染色體DNA長度一般100kb,如先將細胞固定在低熔點瓊脂糖凝膠,再置于含SDS、蛋白酶K、RNase的緩沖液中浸泡,可獲得1,000kb的DNA片段。目前五十一頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點一般采用超聲波和限制酶部分酶切法。保證DNA片段大小均一。2、基因組DNA的切割:目的:保證DNA片段之間存在部分重疊區(qū);目前五十二頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點超聲波處理:

處理后的DNA片段呈平末端,需加裝人工接頭。目前五十三頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點產(chǎn)生粘性末端,可與常用克隆位點(如BamHI、BglII)連接。部分酶切法:部分酶切片段大小可控,可得到15-45kb的隨機片斷;選用4bp識別序列的限制酶,如Sau3A。目前五十四頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點3、載體和受體的選擇構(gòu)建大型基因組文庫(動植物和人類),選擇BAC或YAC。根據(jù)載體,選擇E.coli、Yeast。常選-DNA或Cosmid;受體:載體:目前五十五頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點目前五十六頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點目前五十七頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點在基因組文庫構(gòu)建中,最應(yīng)引起重視的問題:盡量提高載體與外源DNA片段的連接效率!根據(jù)載體的裝載量,將DNA片段分級分離;利用CIP,去除載體的5’-P;利用TdT,在DNA片段的3’-OH加同聚尾。措施:目前五十八頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點基因文庫的完備性:是指在構(gòu)建的基因文庫中任一基因存在的概率P,與基因文庫最低所含克隆數(shù)N的關(guān)系:N=ln(1–P)/ln(1–f)P=基因文庫的完備性(某一基因被克隆的概率)f=克隆片段平均大小/生物基因組大小目前五十九頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點N=ln(1–P)/ln(1–f)如:人單倍體DNA長2.9×106kb,克隆片段平均大小15kb,構(gòu)建完備性0.9的基因文庫,至少需45萬個克??;當(dāng)完備性提高至0.9999時,至少需180萬個克隆。即:為保證某一基因以99.99%的機率至少被克隆1次,需構(gòu)建含180萬個不同重組克隆的基因文庫,這時克隆片段總和為整個基因組的

倍。9.3目前六十頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點即:為保證某一基因以99.99%的機率至少被克隆1次,需構(gòu)建含180萬個不同重組克隆的基因文庫,若1個基因文庫的插入片段總和為整個基因組的10倍以上,就能從基因文庫中調(diào)出任何一段DNA序列。目前六十一頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點基因文庫的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn):除盡可能高的完備性外,理想的基因文庫還應(yīng)具備:重組克隆能穩(wěn)定保存、擴增、篩選??寺】倲?shù)不宜過大,以減輕篩選工作的壓力;載體的裝載量必須大于基因的長度;含有相鄰DNA片段的重組克隆之間,需存在足夠長度的重疊區(qū),以利于克隆排序;克隆片段易于從載體分子上完整卸下;目前六十二頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點基因組文庫的保存影印濾膜保存法保存文庫于液體培養(yǎng)基中保存單個克隆子于液體培養(yǎng)基中目前六十三頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點1)影印濾膜保存法:目前六十四頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點2)保存文庫于液體培養(yǎng)基中從平板上挑取全部克隆,接種于含適當(dāng)抗生素的液體培養(yǎng)基中,混合的細菌生長數(shù)代后,加入終濃度25%的甘油,-70℃保存。缺點:由于文庫菌落生長的不均勻性,可能導(dǎo)致文庫中某些特定序列過多或過少。目前六十五頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點3)保存單個克隆子于液體培養(yǎng)基中從平板上挑選單個克隆,接種于含適當(dāng)抗生素的液體培養(yǎng)基中,菌體生長至一定濃度時,加入終濃度25%的甘油,-70℃保存。缺點:需保存的克隆子數(shù)過多,工作量大。目前六十六頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點從基因組文庫中篩選目的基因大型基因組文庫由數(shù)十萬甚至上百萬個重組克隆組成,除一些具特殊功能的蛋白質(zhì)編碼基因(如抗藥性基因)可用特殊的正選擇篩選程序(如抗藥性篩選)直接篩選外,一般均需多輪操作步驟。目前六十七頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點密集鋪板(1-10萬)雜交挖取鋪板目的重組克隆鋪板根據(jù)目的基因已知核苷酸序列進行篩選目前六十八頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點通過構(gòu)建基因組文庫獲取目的基因的問題:該方法僅適用于原核基因的分離,較少采用。不能除去真核生物目的基因的內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。工作量大,需了解目的基因的背景知識;不能獲得最小長度的目的基因;目前六十九頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點“鳥槍法(shotgun)”:又稱“散彈法”

用限制酶部分酶切染色體DNA將酶切片段克隆入載體轉(zhuǎn)化受體細胞并擴增分離帶有目的基因的DNA片段篩選目的重組子目前七十頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點用“鳥槍法”獲取目的基因:缺點:操作簡便。工作量大;具有一定的盲目性。優(yōu)點:目前七十一頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點優(yōu)點:保證目的基因的完整性,提高目的重組子的出現(xiàn)頻率,簡化操作。鳥槍法操作的改進:

使用特定限制酶完全酶切染色體DNA。前提:已知目的基因的酶切圖譜。策略:用目的基因兩端的限制酶完全酶切染色體DNA,然后與載體拼接。目前七十二頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點2.0kb1.6kb1.8kb如:

已知目的基因位于1.8kb的SalI片段中,將染色體DNA用SalI切開,瓊脂糖凝膠電泳分離,切下區(qū)域內(nèi)的凝膠塊,從此凝膠中回收DNA片段,與載體連接。目前七十三頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點基因組文庫重組克隆的排序構(gòu)建大型基因組文庫技術(shù)上并不困難,若文庫插入片段總和為基因組的10倍以上,就能從其中調(diào)出任何一段DNA序列。

然而基因文庫的克隆是隨機序列,必須將所有克隆排列成一個像天然染色體DNA上所表現(xiàn)出的信息順序。

這項工作的工作量遠大于文庫構(gòu)建。目前七十四頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點酶切片段末端標(biāo)記法隨機探針聯(lián)合雜交法染色體走讀法基因組文庫重組克隆的排序方法:目前七十五頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點酶切片段末端標(biāo)記法:1、將單一YAC克隆插入DNA片段用限制酶均勻地水解成若干片段,末端標(biāo)記同位素。HHHH載體DNA克隆DNA目前七十六頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點2、然后用Sau3A將末端標(biāo)記的DNA片段降解成碎片,PAGE電泳,每10個YAC克隆走在一塊板上,形成10個克隆的特征性DNA指紋圖譜。SSSSSSSSSSSSSSSSSSS10克隆指紋圖譜12345678910目前七十七頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點3、電腦分析指紋圖譜,如發(fā)現(xiàn)任何兩個克隆DNA的指紋圖譜有部分相同,二者就有互相重疊的可能性,在染色體上則可能是排列一起的。10克隆指紋圖譜12345678910目前七十八頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點隨機探針聯(lián)合雜交法:1、將若干YAC克隆固定在薄膜上,復(fù)制20份薄膜;合成20種不同序列的短探針(序列隨機)。0102030405060708091011121314151617181920A

B

CD

E

FG目前七十九頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點2、用20種探針隨機定位雜交(1對1)20份YAC克隆薄膜。若某2個克隆同時對同一種探針呈現(xiàn)雜交陽性反應(yīng),則這2個克隆有可能相互重疊。0102030405060708091011121314151617181920A

B

CD

E

FG20個隨機探針目前八十頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點3、若將雜交陽性結(jié)果記為“1”,可清晰地列成一張表,最終排出上述YAC克隆的排列順序。0102030405060708091011121314151617181920DABCEFG111111111111111111111111111111目前八十一頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點0104120613140214071911150508160310092018DABCEFG111111111111111111111111111111FCADGEB目前八十二頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點1、從基因文庫中任取1個克隆作為染色體走讀的起點,將其兩端序列分別亞克隆,亞克隆片段在0.5-2.0kb范圍內(nèi)。染色體走讀法(chromosomewalking):走讀的起點克隆片段亞克隆旁測序列目前八十三頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點2、以亞克隆DNA片段為探針,與基因文庫雜交,陽性克隆中的插入DNA片段必定與起點克隆所含的DNA片段連鎖在一起。

走讀的起點克隆片段亞克隆旁測序列探針標(biāo)記第一輪雜交陽性克隆陽性克隆目前八十四頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點3、再以陽性克隆片段的兩端序列為探針,進行第二步走讀,直至線型染色體DNA的端點。陽性克隆陽性克隆第二輪雜交第二輪雜交目前八十五頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點走讀的起點克隆片段目前八十六頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點將某種生物基因組轉(zhuǎn)錄的全部mRNA通過反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,與載體連接,轉(zhuǎn)化宿主細胞,得到含全部表達基因的克隆群體。

2、cDNA文庫目前八十七頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點信息量遠小于基因組文庫,容易構(gòu)建;具有時空性和組織細胞特異性。cDNA文庫的特點:不含內(nèi)含子序列;可以在細菌中直接表達;包含該生物全部蛋白質(zhì)編碼的結(jié)構(gòu)基因;目前八十八頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點在高度分化的生物體中,不同組織或細胞在相同時段、相同環(huán)境背景下,mRNA種類、表達水平也不同。同一組織或細胞在不同時段、不同環(huán)境背景下,mRNA種類、表達水平不同。具有時空性和組織細胞特異性:目前八十九頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點cDNA文庫特異地反映某種組織或細胞中,在特定發(fā)育階段表達的蛋白質(zhì)的編碼基因,因此具有時空性和組織細胞特異性。目前九十頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點cDNA文庫的構(gòu)建總RNA提取mRNA的分離純化cDNA第一鏈的合成cDNA第二鏈的合成目前九十一頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點1)總RNA提取:商業(yè)化試劑盒。目前九十二頁\總數(shù)一百零二頁\編于七點利用mRNA含polyA尾,將其從總RNA中分離純化,mRNA只占總RNA的1-2%。2)mRNA的分離純化:

商業(yè)化oligo(dT)纖維素柱。哺乳動物mRNA長度為,大部分為。目前九十三頁\總數(shù)一百零

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