RNA轉(zhuǎn)錄后的剪接與加工

第五章RNA轉(zhuǎn)錄后的剪接與加工5.1概述真核生物基因的表達(dá)在時(shí)間和空間上存在明顯的間隔，ＲＮＡ轉(zhuǎn)錄在細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行，而翻譯則在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)完成，因此不能像原核細(xì)胞那樣幾乎同步同時(shí)地進(jìn)行。RNAprocessing5’端加帽３’端形成polyA內(nèi)含子的去除與外顯子的連接鏈的斷裂核苷酸修飾糖苷鍵的改變RNA編輯5.2原核生物rRNA的轉(zhuǎn)錄加工rrnA-rrnGm4CmN4,2’-O-二甲基胞苷5.3原核生物tRNA前體的加工1.tRNA前體分子的形式：不同的tRNA串聯(lián)排列多個(gè)相同tRNA串聯(lián)排列tRNA與rRNA混合串聯(lián)排列2.tRNA前體的加工修飾內(nèi)切核酸酶使tRNA分子５’端成熟RNA外切酶使tRNA分子３’端成熟在tRNA分子３’端添加CCAOH核苷酸的修飾與異構(gòu)化①tRNA分子３’端成熟A.參與的酶：RNaseP﹑RNaseF﹑RNaseD﹑RNaseBN﹑

RNaseT﹑RNasePH﹑RNaseⅡ﹑polynucleotidePNPase

B.步驟RNaseP將tRNA前體分子水解，但是水解后的片段的3’端與5’端端仍還有額外的核苷酸RNaseF從靠近3’端處水解切割，對tRNA前體3’端逐步加工RNaseD從前體3’端再逐個(gè)切除附加序列，修剪tRNA的3’端在tRNA核苷酰轉(zhuǎn)移酶的作用下添加3’端CCA②tRNA分子5’端成熟由RNaseP催化切除5’端額外核苷酸。該酶是一種核糖核蛋白，由兩個(gè)亞基組成，大亞基是分子量約為125kDa

的RNA,另外一個(gè)為分子量為14kDa的蛋白質(zhì)。5.4原核生物mRNA前體的加工5.5真核生物RNA的轉(zhuǎn)錄后加工（一）剪接方式的分類①

第一類：自我剪接內(nèi)含子,又可分為Ⅰ型和Ⅱ型內(nèi)含子②第二類：需蛋白質(zhì)（酶）參與剪接的內(nèi)含子③第三類：依賴snRNP剪接的內(nèi)含子（二）真核生物tRNA前體的轉(zhuǎn)錄后加工1.結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及加工概述A.與原核生物的差異①

基因組內(nèi)的tRNA基因成簇排列,各基因間有一定間隔,tRNA前體是單順反子,且各個(gè)tRNA可作為獨(dú)立的轉(zhuǎn)錄單位②tRNA基因數(shù)目比原核生物多③tRNA基因有內(nèi)含子,需經(jīng)過剪接加工B.特點(diǎn)長度和序列沒有共同性,一般有16~46個(gè)核苷酸位于反密碼子的下游內(nèi)含子和外顯子間的邊界沒有保守序列,因此tRNA前體的剪接方式不符合一般規(guī)律,需要RNase的參與

tRNA分子的二級結(jié)構(gòu)：氨基酸受體臂、D環(huán)、TψC環(huán)和反密碼環(huán)2.加工過程內(nèi)含子的剪接tRNA前體分子中內(nèi)含子的切除,兩個(gè)tRNA半分子的連接3’端添加CCA：在tRNA核苷酸轉(zhuǎn)移酶（tRNAnucleotidetransferase）催化下進(jìn)行3’端添加,由CTP和ATP提供胞苷酸和腺苷酸核苷酸修飾

:甲基化酶、異戊烯轉(zhuǎn)移酶、鳥嘌呤轉(zhuǎn)糖苷酶、硫轉(zhuǎn)移酶（三）真核生物rRNA前體的轉(zhuǎn)錄后加工1.結(jié)構(gòu)組成與特點(diǎn)小亞基:16～18SrRNA大亞基:26～28SrRNA

、5SrRNA

和5.8SrRNA

基因拷貝數(shù)多,在基因組內(nèi)成簇排列,成串重復(fù)數(shù)百次集中在核仁內(nèi),并由轉(zhuǎn)錄區(qū)（transcribedspacer）與非轉(zhuǎn)錄區(qū)（non-transcribedspacer,NTS）交替排列2.rRNA前體加工的基本步驟5’端非編碼序列的切除,41S中間產(chǎn)物的生成41S的RNA被切割成32S（２８

S和5.8S）與20S（18S）兩段32S被剪切成２８

S和5.8S，并且部分序列互補(bǔ)配對20S被剪切成18S

切割位點(diǎn)如何確定①核仁小分子RNA（smallnucleolarRNA,snoRNA）參與核糖核酸酶對特定立體結(jié)構(gòu)的識別②rRNA前體分子的甲基化3.snoRNA的結(jié)構(gòu)與功能①

結(jié)構(gòu)特點(diǎn)a.BoxC框/D框，C框的序列為AUGAUGA,D框?yàn)镃UGA,可借助互補(bǔ)序列識別rRNA前體中甲基化和切割的位點(diǎn)b.BoxH/ACA,H框?yàn)锳NANNA，能識別假尿苷酸化位點(diǎn)②功能與蛋白質(zhì)結(jié)合成snoRNP參與rRNA前體的加工boxC/D具有互補(bǔ)序列，是指導(dǎo)rRNA中2’-O-核糖的甲基化修飾系統(tǒng)，boxC參與甲基的轉(zhuǎn)移反應(yīng)boxH/ACA能形成莖環(huán)二級結(jié)構(gòu)，與rRNA特定序列互補(bǔ)(四)真核生物mRNA前體的加工1.5’端的帽子結(jié)構(gòu)及加工步驟核苷酸磷酸水解酶從生長著的RNA5’端切去5’端γ磷酸基團(tuán)鳥苷酸7-甲基轉(zhuǎn)移酶催化一分子游離GTP中的GMP攻擊5’端第二個(gè)磷酸，形成5’

，5’-三磷酸的連接，阻塞了RNA的5’端2’-O-甲基轉(zhuǎn)移酶催化S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl

methionine,AdoMet）的甲基基團(tuán)轉(zhuǎn)移到cap-0帽子結(jié)構(gòu)鳥嘌呤的N7位另外一分子甲?；D(zhuǎn)移酶催化將另一分子的AdoMet連接到從5’端的第二個(gè)核苷酸cap-1的2-OH’上，使之甲基化繼續(xù)由甲?；D(zhuǎn)移酶催化隨后的cap-2的2-OH’甲基化及嘌呤核苷酸N7位甲基化，形成不同的帽子結(jié)構(gòu)2.5’端帽子結(jié)構(gòu)的功能對mRNA的保護(hù)作用，是mRNA免受核苷酸酶從5’端開始的降解使mRNA具有可翻譯能力（translatability）有利于成熟mRNA從細(xì)胞核輸送到細(xì)胞質(zhì)3.mRNA3’端的多聚腺苷酸化(polyadenylation)保護(hù)mRNA，提高mRNA在細(xì)胞質(zhì)中的穩(wěn)定性能增強(qiáng)mRNA的可翻譯能力，在真核細(xì)胞的mRNA翻譯過程中，有一種能結(jié)合在polyA上的蛋白質(zhì)稱為polyA結(jié)合蛋白I（polyA-bingdingproteinI,PABI）,當(dāng)PABI結(jié)合在polyA時(shí)，mRNA的翻譯從效率大大增強(qiáng)4.

核內(nèi)不均一RNA

①

概述核內(nèi)不均一RNA(heterogeneousnuclearRNA,hnRNA)的堿基組成與總DNA組成類似，所以又稱為類似DNA的RNA(D-DNA)②與mRNA的關(guān)系a.有相同的序列b.在體外能作翻譯模板，與mRNA有相同功能c.兩者的5’端都有帽子結(jié)構(gòu)，3’端有polyAd.兩者的轉(zhuǎn)錄合成都可以被高劑量放線菌素D抑制

③

hnRNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)5’端有帽子結(jié)構(gòu)(5’-cap)3’端有polyA+結(jié)構(gòu)帽子結(jié)構(gòu)的下游3個(gè)寡聚U區(qū)，長度約30nt寡聚U區(qū)下游有重復(fù)序列莖環(huán)結(jié)構(gòu)分布于編碼區(qū)的兩側(cè)編碼區(qū)為非重復(fù)結(jié)構(gòu)，含有內(nèi)含子④

hnRNA的加工過程a.5’端形成特殊的帽子結(jié)構(gòu)(m7G5’ppp5’N1mpN2p-)b.修剪鏈的3’端，并加上polyAc.通過剪接除去由內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄而來的序列d.RNA鏈內(nèi)的核苷酸被甲基化5.mRNA前體加工的簡要過程①

mRNA前體中內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)a.兩端邊界有共同序列，這些序列是mRNA前體的剪接信號b.與第一類II型內(nèi)含子剪接有些類似，必須形成套索結(jié)構(gòu)（lariat）,區(qū)別在于真核生物的mRNA的剪接要求形成剪接體②

剪接體剪接的簡要過程a.在內(nèi)含子的5’切斷，通過5’、2’鍵將內(nèi)含子5’-G與分支點(diǎn)A殘基的2’為連接成套索結(jié)構(gòu)b.在內(nèi)含子的3’端剪接位點(diǎn)，外顯子1與外顯子2連接，內(nèi)含子以套索形式被釋放6.真核生物mRNA前體的剪接機(jī)制①

snRNP:由U1、U2、U4、U5&U6snRNP組成a.U1

snRNP:8中蛋白質(zhì)與1種RNA鏈b.

U2

snRNP:能與內(nèi)含子的分支點(diǎn)共同序列互補(bǔ)，另外還與U6

snRNP堿基配對，協(xié)助snRNA在剪接體上定向c.

U4

snRNP:與U6snRNP偶聯(lián)形成配對的莖I和莖II，當(dāng)剪接體裝配時(shí)，U4與U6解離開后發(fā)揮作用。U4主要是結(jié)合U6直到在剪接需要U6時(shí)才釋放它，使之參與5’端剪接d.U5snRNP

:與其它snRNA或剪接底物pre-mRNA的保守區(qū)無明顯的互補(bǔ)，但它的確同pre-mRNA的5’和3’端剪接位點(diǎn)有相互作用e.U6

snRNP與內(nèi)含子5’端剪接區(qū)域配對②

剪接體（spliceosome)a.概念

:

mRNA前體在剪接過程中組裝形成的多組分復(fù)合物，主要是由細(xì)胞核內(nèi)小分子RNA和蛋白質(zhì)組成b.組成:

每種都含有1-2種snRNA和數(shù)種蛋白質(zhì)因子③

剪接體的組裝與循環(huán)a.組成snRNP非snRNPSR蛋白SR相關(guān)蛋白:Tra、Tra2、U2AFb.步驟早期剪接復(fù)合體的形成前剪接復(fù)合體的組裝過渡復(fù)合物的形成剪接體內(nèi)結(jié)構(gòu)重排剪接產(chǎn)物的形成mRNA剪接產(chǎn)物和內(nèi)含子的釋放Step1.早期剪接復(fù)合體的形成U1snRNP結(jié)合到pre-mRNA的5’端剪接點(diǎn)上剪接因子(splicingfactorI)又稱BBP(branchpointbindingprotein)結(jié)合到分支點(diǎn)上U2snRNP的輔助因子U2AF(U2auxiliaryfactor)的65kDa和35kDa兩個(gè)亞基分別結(jié)合到分支點(diǎn)和3’剪接位點(diǎn)的AG堿基上在SR蛋白作用下，已經(jīng)結(jié)合在5’剪接位點(diǎn)的U1snRNP和結(jié)合在3’剪接位點(diǎn)的SR/U2AF相互靠近，形成早期剪接復(fù)合物（earlyspliceosomecomplex)Step2.前剪接復(fù)合體的組裝在U2輔助因子U2AF協(xié)助下，U2snRNP與內(nèi)含子的分支點(diǎn)結(jié)合ATP水解釋放能量使內(nèi)含子180°彎曲U1snRNP和U2snRNP兩種復(fù)合物相互作用，使內(nèi)含子５’端和3’端靠近SR蛋白協(xié)助U1snRNP和U2AF結(jié)合，使早期剪接復(fù)合體組建成跨越內(nèi)含子復(fù)合物，即前剪接體復(fù)合物(pre-spliceosomecomplex)Step3過渡態(tài)復(fù)合物的形成U4/U6和U5snRNP開始參與，使得U6內(nèi)部序列和U4的5’端互補(bǔ)，前剪接體與U4snRNP、U5snRNP和U6snRNP的三聚體結(jié)合U4與U6解離，U6在5’端剪接位點(diǎn)由ATP激活取代U1，使得U4離開前剪接復(fù)合體，同時(shí)在ATP的激活下，U1離開前剪接體復(fù)合物，形成過渡態(tài)復(fù)合物Step4剪接體內(nèi)的結(jié)構(gòu)重排在ATP激活下，U6與結(jié)合于分支點(diǎn)序列的U2snRNP的5’端序列互補(bǔ)U1離開5’端剪接位點(diǎn)后，U5能夠與兩個(gè)外顯子的剪接位點(diǎn)互補(bǔ)，使剪接體內(nèi)發(fā)生結(jié)構(gòu)重排，從而形成有利于催化剪接反應(yīng)的構(gòu)象Step5

形成剪接產(chǎn)物并釋放在剪接體被激活的情況下，形成剪接產(chǎn)物釋放mRNA剪接產(chǎn)物和內(nèi)含子U5snRNP環(huán)通過外顯子1和外顯子2接觸，使兩個(gè)剪接位點(diǎn)在空間上靠近，由于它能引導(dǎo)其它RNA區(qū)域到剪接體的適當(dāng)位置，以催化剪接功能的發(fā)揮，故又將U5snRNP環(huán)稱為導(dǎo)向RNAb.U2snRNP與內(nèi)含子的分支點(diǎn)形成螺旋區(qū)域，分支點(diǎn)A周圍的堿基對使A突出，該結(jié)構(gòu)為II型內(nèi)含子的一種核酶（ribozyme)結(jié)構(gòu)，是催化剪接的活性中心c.剪接體組裝過程中的重排反應(yīng)內(nèi)含子5’端剪接點(diǎn)與U1snRNP的相互作用轉(zhuǎn)變?yōu)榕cU6snRNP間的相互作用U2snRNP與分支點(diǎn)相互作用代替了在分支點(diǎn)上結(jié)合蛋白BBP與分支點(diǎn)的相互作用U2snRNP分子內(nèi)部發(fā)生重排，形成莖-環(huán)構(gòu)象的活化U4/U6之間RNA配對形成的莖II結(jié)構(gòu)被破壞，U6snRNP在其3’端形成分子內(nèi)的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)U4/U6莖I區(qū)配對被破壞，使游離的U6snRNP與U2snRNP相互作用，而形成U2/U6螺旋IU2snRNP的5’莖-環(huán)結(jié)構(gòu)被破壞使其5’端游離，并與U6相應(yīng)部分作用形成U2/U6螺旋II

至此，前剪接體轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓募艚芋w，剪接催化反應(yīng)通過U4的釋放啟動(dòng)，ATP水解供能7.mRNA前體剪接中的轉(zhuǎn)酯反應(yīng)概述:在成熟剪接體上完成剪接反應(yīng)實(shí)際上是磷酸二酯鍵的轉(zhuǎn)移，又稱為轉(zhuǎn)酯反(transesterification)①

第一次轉(zhuǎn)酯反應(yīng)②

第二次轉(zhuǎn)酯反應(yīng)第二次剪接反應(yīng)是外顯子1的3’端對內(nèi)含子3’端剪接點(diǎn)進(jìn)行親核進(jìn)攻，U5snRNA在反應(yīng)中起著排布外顯子的功能，使5’端外顯子移動(dòng)、定位，然后在外顯子I和II粗發(fā)生第二次轉(zhuǎn)酯反應(yīng)，形成5’，

3’-磷酸二酯鍵，產(chǎn)生兩個(gè)外