細(xì)胞色素C的制備

生物技術(shù)及應(yīng)用專業(yè)教學(xué)資源庫細(xì)胞色素C的制備細(xì)胞色素C的制備產(chǎn)品簡介1實(shí)訓(xùn)目標(biāo)2實(shí)訓(xùn)原理3實(shí)訓(xùn)試劑與設(shè)備4生產(chǎn)實(shí)訓(xùn)5產(chǎn)品檢測6細(xì)胞色素C的制備產(chǎn)品簡介一、產(chǎn)品簡介名稱：細(xì)胞色素C英文名稱:CytochromeC別名：細(xì)胞色素丙、細(xì)丙分子量：11000-13000，12400二、產(chǎn)品藥理作用1、呼吸鏈中的作用本品為生物氧化過程中的電子傳遞體。其作用原理為在酶存在的情況下，對組織的氧化、還原有迅速的酶促作用。通常外源性細(xì)胞色素C不能進(jìn)入健康細(xì)胞，但在缺氧時(shí)，細(xì)胞膜的通透性增加，細(xì)胞色素C便有可能進(jìn)入細(xì)胞及線粒體內(nèi)，增強(qiáng)細(xì)胞氧化，能提高氧的利用。細(xì)胞色素C的制備產(chǎn)品簡介細(xì)胞色素C是一種細(xì)胞色素氧化酶，是電子傳遞鏈中唯一的外周蛋白，位于線粒體內(nèi)側(cè)外膜。2、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)細(xì)胞凋亡的研究表明，細(xì)胞色素C與細(xì)胞凋亡有關(guān)，從線粒體中泄露出的細(xì)胞色素C有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。細(xì)胞色素C的制備實(shí)訓(xùn)目標(biāo)1.掌握凝膠色譜基本原理。凝膠顆粒2.熟悉凝膠色譜法的操作。3.了解物質(zhì)在色譜柱中洗脫行為與分配系數(shù)的關(guān)系。細(xì)胞色素C的制備實(shí)訓(xùn)原理細(xì)胞色素C的制備實(shí)訓(xùn)試劑與設(shè)備一、試劑和材料市售新鮮豬心、三氯乙酸溶液、氫氧化鈉、硫酸銨、葡聚糖凝膠G-25、葡聚糖凝膠G-100二、實(shí)驗(yàn)器材組織勻漿搗碎機(jī)、數(shù)顯恒溫磁力攪拌器、冷凍高速離心機(jī)、抽濾裝置、LKB柱層析系統(tǒng)、三用電熱恒溫水箱細(xì)胞色素C的制備生產(chǎn)實(shí)訓(xùn)一、生產(chǎn)前準(zhǔn)備1、檢查生產(chǎn)原料、各種生產(chǎn)用試劑；2、檢查生產(chǎn)設(shè)備；3、檢查生產(chǎn)記錄等文件。二、生產(chǎn)操作1、細(xì)胞色素C粗品的制備（1）預(yù)處理以豬心為材料制成肉糜，按1g肉糜加入1mL0.145mol/L的三氯乙酸溶液，使pH=4，室溫下置3h后，于4000r/min離心15min，收集上清液，將沉淀重復(fù)抽提1~2次，（每次lh），合并提取液，用氫氧化鈉調(diào)至pH=7.3。細(xì)胞色素C的制備生產(chǎn)實(shí)訓(xùn)（2）細(xì)胞色素C粗品的制備硫酸銨鹽析：在上面收集的提取液中，加入固體硫酸銨（使溶液硫酸銨的飽和度為45％）邊加邊攪拌，放置30分針后，雜蛋白便從溶液中沉淀析出，而細(xì)胞色素C仍留在溶液中，用濾紙（或離心）除去雜蛋白，即得紅色透亮細(xì)胞色素C溶液。三氯醋酸沉淀：在攪拌情況向所得透亮溶液加入20％三氯醋酸(2.5m1三氯醋酸/100m1細(xì)胞色素C溶液)，細(xì)胞色素C立即沉淀出來（沉淀出來的細(xì)胞色素C屬可逆變性），立即于3000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，收集沉淀。加入少許蒸餾水，用玻棒攪拌，使沉淀溶解。細(xì)胞色素C的制備生產(chǎn)實(shí)訓(xùn)2、脫鹽與純化（1）脫鹽將葡聚糖凝膠G-25用沸水浴溶脹2h后，冷卻后裝入LKB柱層析系統(tǒng)(柱管為φ2.7m、長64.5cm)中。將粗樣品溶于少量無離子水中，加樣時(shí)檢查床表面平整后，將柱的出口打開，使床表面的洗脫液（無離子水）至表面以上2mm關(guān)閉柱的出口。將LKB層析柱表面的尼龍布移至柱床表面1mm處，緩慢注入樣品液3~5cm，打開柱的出口，使樣品滲入凝膠內(nèi)。樣品加完后，用無離子水作為洗脫液，以小體積的洗脫液，洗表面1~2次，當(dāng)樣品將流干時(shí)，象加樣時(shí)一樣，仔細(xì)地加入洗脫液。當(dāng)洗脫液滲入表面時(shí)，即可開始層析。由微量泵控制流速1mL/min收集紅色部分。用奈氏試劑或乙酸鋇溶液檢查收集液無銨離子或硫酸根離子，將收集液濃縮后再走第二根柱。細(xì)胞色素C的制備生產(chǎn)實(shí)訓(xùn)（2）純化第二根層析柱柱管(柱管為φ2.7m、長64.5cm)葡聚糖凝膠為葡聚糖凝膠G-100，沸水浴溶脹5h,冷卻后裝柱.洗脫液為無離子水。加樣方法同上。微量泵控制流速1mL/min收集紅色部分即為純化的細(xì)胞色素C。細(xì)胞色素C的制備產(chǎn)品檢測所得制品是還原型細(xì)胞色素C水溶液，在波長520nm處有最大吸收值，根據(jù)這一特性，用721型分光光度計(jì)，先作出一條標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞色素C濃度和對應(yīng)的光密度值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)測得的待測樣品溶液的光密度值就可以由標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率求出待測樣品的含量。細(xì)胞色素C的制備產(chǎn)品檢測一、檢測前準(zhǔn)備1、檢測裝置、各種檢測用試劑2、檢查檢測記錄等文件二、產(chǎn)品檢測1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取1毫升標(biāo)準(zhǔn)品(81mg/ml)，稀釋至25ml，從中分別取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml，分別置于五支試管中，每管補(bǔ)加蒸餾水至4m1，并加少許聯(lián)二亞硫酸鈉作還原劑，然后在520nm處測得各管的光密度，分別為0.179，0.330，0.520，0.700，0.870。以濃度為橫坐標(biāo)，光密度值為縱坐標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，從圖中求得斜率。細(xì)胞色素C的制備產(chǎn)品檢測2、樣品測定取ml樣品，稀釋適當(dāng)倍數(shù)，再加少許聯(lián)二亞硫酸鈉，在波長520nm處測定光密度。最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率計(jì)算其細(xì)胞色