ELISA的原理及分類完整版資料

ELISA的原理及分類50年代的免疫熒光（IFA）和60年代的放射免疫(RIA)分析技術(shù)之后，在70年代初期又建立了用酶來標(biāo)記抗原或抗體的分析技術(shù)。由于酶的高效生物催化作用，一個酶分子在數(shù)分鐘內(nèi)可以催化幾十幾百個底物分子發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生了放大作用，使得原來極其微乎其微的抗原或抗體在數(shù)分鐘后就可被識別出來，這種技術(shù)被稱為酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法?，F(xiàn)已成功地應(yīng)用于多種病原微生物所引起的傳染病、寄生蟲病及非傳染病等方面的免疫診斷。ELISA的基本原理酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA）概念：以酶作為標(biāo)記指示物、以抗原抗體免疫反應(yīng)為基礎(chǔ)的固相吸附測定方法。三個方面：固相支持物包被的抗原或抗體酶標(biāo)記的抗體或抗原和酶反應(yīng)底物

1.抗原(antigen，Ag)

一個完整的抗原應(yīng)包括兩方面的免疫性能：①免疫原性(immunogenicity):誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生免疫應(yīng)答的能力，具有這種能力的物質(zhì)稱為免疫原(immunogen)；②免疫反應(yīng)性(immunoreactivity):抗原與抗體或致敏淋巴細(xì)胞發(fā)生特異性結(jié)合的能力。2.抗原的基本理化特性——?大于Ab或者TCR的抗原結(jié)合部位 ?無機(jī)物不能成為抗原；?分子量太小（如對氨基苯甲酸，DNP）的有機(jī)物不能成為抗原；?蛋白質(zhì)是最主要、最常見的抗原；?多糖、脂肪、核苷酸等有機(jī)大分子能被B細(xì)胞和gd-T細(xì)胞所識別。

3.最大特性：免疫應(yīng)答的特異性

某一特定抗原只能刺激機(jī)體產(chǎn)生針對該特定抗原的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答；

某一特定抗原只能與其相應(yīng)的特異抗體或致敏淋巴細(xì)胞產(chǎn)生結(jié)合反應(yīng)。4.抗原抗體的結(jié)合:

實(shí)質(zhì)上只發(fā)生在抗原的抗原決定簇與抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)之間。由抗原決定簇和抗體分子超變區(qū)之間空間結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)性決定的。

抗體分子N端可變區(qū)形成3nm×1.5nm×0.7nm的槽溝，只有與其空間結(jié)構(gòu)互補(bǔ)的抗原決定簇才能如楔狀嵌入。

由于兩者在化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型上呈互補(bǔ)關(guān)系，所以抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性。

抗體1抗體2抗體3例如：乙肝病毒中的HBsAg誘導(dǎo)機(jī)體的免疫應(yīng)答產(chǎn)生只針對病毒表面抗原成分的抗體，HBeAg和HBcAg也可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，雖然這兩種也來源于同一病毒，但表面抗原僅與其相應(yīng)的抗體結(jié)合，而不與另外兩種抗體反應(yīng)。

抗原抗體反應(yīng)的這種特異性使免疫測定能在非常復(fù)雜的蛋白質(zhì)化合物（例如血清）中測定某一特定的物質(zhì)，而不需先分離待檢物。但是這種特異性也不是絕對的。交叉反應(yīng)(crossreaction)當(dāng)兩種不同的抗原物質(zhì)具有部分相同或類似結(jié)構(gòu)的抗原決定簇，則可與彼此相應(yīng)的抗體反應(yīng)，從而在抗原抗體反應(yīng)中可出現(xiàn)交叉反應(yīng)。

例如：絨毛膜促性腺激素（hCG）和黃體生成激素（LH）均由α和β兩個亞單位組成，其結(jié)構(gòu)的不同處在β亞單位，而兩者的α亞單位是同類的。用hCG免疫動物所得的抗血清中含有抗α-hCG和抗β-hCG兩種抗體，抗α-hCG抗體將與LH中的α酶位發(fā)生交叉反應(yīng)。在臨床檢驗(yàn)中，如用抗hCG抗血清作為妊娠診斷試劑檢定尿液中hCG，只能用于hCG濃度較高的試驗(yàn)，否則婦女生理性排泄入尿液中的微量LH將與之發(fā)生交叉反應(yīng)。因此在作為早孕診斷（敏感度應(yīng)達(dá)到50mIu/mlhCG）的實(shí)際中必須應(yīng)用只對hCG特異的抗β-hCG，以避免與其它激素的交叉反應(yīng)的發(fā)生。1.用于免疫測定方法建立的抗原----ELISA方法純化抗原：如HBsAg

從體液，組織或病原體培養(yǎng)物等中采用物理化學(xué)方法：超速離心，過濾層析，電泳分離等分離獲得。注：純化抗原的純度對相應(yīng)的免疫測定方法的特異性有較大的影響合成抗原（多肽片段）如HCV

缺乏完整的立體構(gòu)型決定簇，導(dǎo)致抗體的漏檢。基因工程抗原HBcAg,HBeAg和HCV

早期：多為病原體的部分抗原，導(dǎo)致敏感性上缺陷。融合蛋白：對抗原的生物學(xué)和免疫學(xué)特性能最大程度的保留，工業(yè)化大量生產(chǎn)，沒有提純抗原存在的傳染危險性。抗原分類2.干擾免疫測定的抗原多為機(jī)體內(nèi)源性抗原異嗜性抗原：不同種屬的動物/植物和微生物細(xì)胞表面上的共同抗原，廣泛的交叉性，故影響免疫測定的特異性。免疫球蛋白：免疫應(yīng)答的產(chǎn)物?抗體最常見的類風(fēng)濕因子（RF），可于變性的IgG發(fā)生特異的結(jié)合，在ELISA引起非特異性反應(yīng)?？贵w—分類在感染或疫苗接種以后，最先出現(xiàn)的抗體是IgM；血內(nèi)含量低、半衰期短、出現(xiàn)早、消失快、組織穿透力弱，故其保護(hù)作用實(shí)際上常不如IgG。在抗原的反復(fù)刺激下，可通過Ig基因的類轉(zhuǎn)換而轉(zhuǎn)向IgG合成IgG是再次免疫應(yīng)答的主要抗體；合成速度快、分解慢、半衰期長?？勺鞅Ｗo(hù)性抗體。IgGIgAIgDIgMIgAIgE多為機(jī)體內(nèi)源性抗原基因工程抗原HBcAg,HBeAg和HCV再加入特異抗原，與固相上捕獲的IgM抗體結(jié)合包被的抗原或抗體這種雙位點(diǎn)夾心法具有很高的特異性。原理：利用酶標(biāo)記的抗抗體（抗人免疫球蛋白抗體）以檢測與固相抗原結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。保存血清自采集時就應(yīng)注意無菌操作類風(fēng)濕因子（RF，IgM類）及其他非特異性IgM的干擾非特異性IgM在第一步溫育中，可與特異性IgM競爭與固相抗體結(jié)合，所以影響測定的靈敏度。因此在使用一步法試劑測定標(biāo)本中含量可異常增高的物質(zhì)（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）時，應(yīng)注意可測范圍的最高值。醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中均以血清作為檢測標(biāo)本洗滌的方式：某些ELISA儀器配有特殊的自動洗滌儀抗原(antigen，Ag)血清標(biāo)本可按常規(guī)方法采集，應(yīng)注意避免溶血，紅細(xì)胞溶解時會釋放出具有過氧化物酶活性的物質(zhì)，以HRP為標(biāo)記的ELISA測定中，溶血標(biāo)本可能會增加非特異性顯色。制備抗體的發(fā)展技術(shù)：多克隆抗體：免疫動物后從血清中所得。抗原通常都有許多的抗原決定簇，所得抗體為針對這些所有抗原決定簇的抗體混合物?？贵w的親和力和特異性相對低于單克隆抗體。單克隆抗體：雜交瘤技術(shù)缺點(diǎn)：結(jié)合的單一性，產(chǎn)生假陰性混合單克隆抗體：雜交瘤技術(shù)雙特異性單克隆抗體或多抗：雜交瘤技術(shù)基因工程抗體：基因工程技術(shù)HRP的色原底物--反應(yīng)形式：氧化還原底物的氧化作用?！狾PD（鄰苯二胺）1.原理：在HRP的作用下，由過氧化氫（H2O2）氧化而聚合成2，2‘-二氨基偶氮苯（DAB）顯色在pH5.0左右時，DAB在波長450nm處有廣范圍的最大吸收。2.由于不穩(wěn)定性，在試劑盒中，OPD均以片劑或粉劑供應(yīng)，臨用前溶解。3.缺點(diǎn)：對機(jī)體具有致突變作用。

—TMB（四甲基聯(lián)苯胺）

1.優(yōu)于OPD2.原理：在HRP的作用下，由過氧化氫（H2O2）氧化合成聯(lián)苯醌，在波長450nm處有最大消光系數(shù)。3.A液和B液：一種為TMB溶液，一種為一定濃度的過氧化氫溶液。4.如發(fā)現(xiàn)底物A和（或）B出現(xiàn)顏色，或二者各取一滴混合后顯色，說明該試劑盒的底物溶液已變質(zhì)或已受污染，必須廢棄。顯色和終止反應(yīng)TMB（無色）

TMB陽離子根（藍(lán)色）

聯(lián)苯醌（黃色）

λmax=370和650nmλmax=450nmHRPHRP酸性固相支持物及抗原抗體的固相化一般有聚苯乙烯、聚氯乙稀、硝酸纖維素膜等。多用聚苯乙烯塑料---好的光透性和蛋白吸附能力、易加工、價格低廉。1.聚苯乙烯的主鏈結(jié)構(gòu)為碳鏈，側(cè)鏈為非極性集團(tuán)，表面成疏水性。2.抗體或抗原蛋白被動吸附于固相時，疏水鍵是其吸附于聚苯乙烯等疏水性固相表面的主要作用力。3.缺點(diǎn)：孔間變異較大，重復(fù)性差。改善ELISA測定的重復(fù)性：間接非共價吸附方法－－proteinA、抗IgG或鏈霉親和素等作為中介物而吸附于固相上。共價吸附法－－化學(xué)交聯(lián)試劑如戊二醛法，在其作用下抗體或抗原的活性基團(tuán)與固相反應(yīng)形成共價鍵而成。ELISA載體的形狀主要有三種：微量滴定板、小珠和小試管。以微量滴定板最為常用，專用于EILSA的產(chǎn)品稱為ELISA板，國際上標(biāo)準(zhǔn)的微量滴定板為8×12的96孔式。已有多種自動化儀器用于微量滴定板型的ELISA檢測，包括加樣、洗滌、保溫、比色等步驟，對操作的標(biāo)準(zhǔn)化極為有利。聚苯乙烯經(jīng)射線照射后，其吸附性能特別是對免疫球蛋白的吸附性能增加良好的ELISA板應(yīng)該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間、同一板各孔之間性能相近。ELISA基本原理1.抗原抗體反應(yīng)在固相支持物上進(jìn)行；2.反應(yīng)結(jié)果的判斷以酶與其底物作用后的顯色或產(chǎn)生熒光或發(fā)光反應(yīng)為準(zhǔn)則；3.顯色強(qiáng)度產(chǎn)生熒光或發(fā)光反應(yīng)與臨床標(biāo)本中待測物的濃度成正比或反比關(guān)系。國內(nèi)試劑盒均以酶的顯色反應(yīng)來完成測定。酶學(xué)ELISA基本原理1.抗原或抗體的固相化抗原或抗體能以物理性地吸附于固相載體表面，并保持其免疫學(xué)活性；2.抗原或抗體的酶標(biāo)記抗原或抗體可通過共價鍵與酶連接形成酶結(jié)合物，而此種酶結(jié)合物仍能保持其免疫學(xué)和酶學(xué)活性；

3.酶結(jié)合物與相應(yīng)抗原或抗體結(jié)合后，可根據(jù)加入底物的顏色反應(yīng)來判定是否有免疫反應(yīng)的存在，而且顏色反應(yīng)的深淺是與標(biāo)本中相應(yīng)抗原或抗體的量成正比例的，因此，可以按底物顯色的程度顯示試驗(yàn)結(jié)果。ELISA試劑盒包含以下各組分：

1.已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）；

2.酶標(biāo)記的抗原或抗體（結(jié)合物）；

3.酶的底物；

4.陰性對照品和陽性對照品（定性測定中），參考標(biāo)準(zhǔn)品和控制血清（定量測定中）；

5.結(jié)合物及標(biāo)本的稀釋液；

6.洗滌液；

7.酶反應(yīng)終止液。在測定時受檢標(biāo)本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。靈敏度和特異性由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測定方法達(dá)到很高的敏感度。特異性：1.抗原與相應(yīng)的抗體的結(jié)合具有高度特異性2.酶標(biāo)記物與相應(yīng)抗原或抗體結(jié)合具有高度特異性3.酶的催化具有高度特異性臨床ELISA測定的常用模式一、檢測抗原：（1）雙抗體夾心法測抗原雙抗體夾心法適用于測定二價或二價以上的大分子抗原，適用于檢驗(yàn)各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。但不適用于測定半抗原及小分子單價抗原，因其不能形成兩位點(diǎn)夾心?？贵w的來源為多克隆抗體即抗血清時，包被和酶標(biāo)用的抗體最好分別取自不同種屬的動物。應(yīng)用單克隆抗體，一般選擇兩個針對抗原上不同決定簇的單抗，分別用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物。這種雙位點(diǎn)夾心法具有很高的特異性。兩步法雙抗體夾心法測抗原酶標(biāo)抗體固相抗體待測抗原EE溫育洗板溫育洗板溫育兩步法中抗原抗體遵循下述規(guī)律1.Ab＋AgAb·Ag（復(fù)合物）2.Ab·Ag＋Ab*Ab·Ag·Ab*（復(fù)合物）隨著待測抗原濃度的增加，顯色程度也逐步加深，當(dāng)抗原濃度增加到一定程度時，反應(yīng)顯色達(dá)到平臺，不再加深，呈S形變化曲線吸光度抗原兩步法ELISA抗原濃度與顯色變化的反應(yīng)曲線圖臨床工作中多采用一步法將待測樣本和酶標(biāo)抗體同時加入，從而僅有一步溫育和洗板過程，即為通常所說的“一步法”。EEE溫育洗板溫育固相抗體待測抗原酶標(biāo)抗體一步法測定時結(jié)合形式Ab＋Ag＋Ab*Ab·Ag·Ab*---aAb·Ag---bAg·Ab*---cAb*·Ag·Ab*---d

a為最后測定結(jié)果的顯色之源，當(dāng)待測種抗原濃度增加時，無疑會使b，c和d復(fù)合物增加，從而消耗有限的Ab*，使a復(fù)合物相應(yīng)減少，顯色降低，吸光度對抗原濃度的變化曲線呈鐘形。鉤狀效應(yīng)抗原濃度與顯色變化的反應(yīng)曲線為鐘形曲線測定顯色隨著待測標(biāo)本中抗原濃度的增加升高至一定程度后，測定吸光度即隨抗原濃度的增加而開始下降直至不顯色，出現(xiàn)假陰性結(jié)果。一步法抗原濃度與顯色變化的反應(yīng)曲線抗原吸光度因此在使用一步法試劑測定標(biāo)本中含量可異常增高的物質(zhì)（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）時，應(yīng)注意可測范圍的最高值。用高親和力的單克隆抗體制備此類試劑可削弱鉤狀效應(yīng)。如包被使用一種單抗，酶標(biāo)記使用另一種單抗，同時充分混勻反應(yīng)液，并適當(dāng)延長反應(yīng)溫育時間，則可使b,c和d復(fù)合物減少至最低程度，大大減輕鉤狀效應(yīng)。

測定標(biāo)本中HBeAg時

多克隆抗－HBe包被反應(yīng)板

加入代測標(biāo)本，同時加入單克隆抗－HBe－HRP

形成抗－HBe－HBeAg－抗－HBe－HRP復(fù)合物

加入TMB低物顯色反應(yīng)

測OD值測定HBsAg時：單克隆抗－HBs包被反應(yīng)板加入待測標(biāo)本，同時加入多克隆抗－HBs－HRP形成抗－HBs－HBsAg－抗HBs-HRP復(fù)合物加入TMB低物產(chǎn)生顯色反應(yīng)測OD值類風(fēng)濕因子（RF）的干擾RF是一種自身抗體，多為IgM型，能和多種動物IgG的Fc段結(jié)合。用作雙抗體夾心法檢測的血清標(biāo)本中如含有RF，它可充當(dāng)抗原成份，同時與固相抗體和酶標(biāo)抗體結(jié)合，表現(xiàn)出假陽性反應(yīng)。2.改良雙抗體夾心法

特異性抗體a包被于固相載體洗滌加入含有欲測抗原之待檢樣品孵育洗滌再加一次未標(biāo)記的特異性抗體b孵育洗滌再加酶標(biāo)記抗b抗體，孵育洗滌加底物顯色進(jìn)行測定注：加入的抗體b于第一次包被于固相載體上的特異性抗體a對被測抗原來說都是特異性的，但不是用同種動物免疫制備的，否則可出現(xiàn)非特異性反應(yīng)。

這種方法與雙抗體夾心法不同之處是多加了一層抗體。因此，放大的倍數(shù)更高，故比雙抗體夾心法更加靈敏。同時避免標(biāo)記特異性抗體，而另一優(yōu)點(diǎn)是只要標(biāo)記一種抗抗體，即可達(dá)到多種應(yīng)用。3.競爭抑制法測抗原

適用于小分子抗原或半抗原測定如地高辛、茶堿等藥物以及T3、T4及睪酮等激素，因其只有一個抗原決定簇，無法使用雙抗體夾心法測定，只能采用競爭抑制法測定。原理：是標(biāo)本中的抗原和一定量的酶標(biāo)抗原競爭與固相抗體結(jié)合。標(biāo)本中抗原量含量愈多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原愈少，最后的顯色也愈淺。固相抗體EEE酶標(biāo)抗原待測抗原E底物E顯色反應(yīng)（弱）固相抗體EEE酶標(biāo)抗原底物顯色反應(yīng)（強(qiáng)）EEEEEE競爭法ELISA測小分子抗原測定模式缺點(diǎn)：1.小分子酶結(jié)合物制備上不如抗體酶結(jié)合物簡便2.純化困難，結(jié)合小分子的酶與游離酶之間難分離。雙抗體夾心競爭ELISA方法測定小分子抗原，測定的靈敏度和特異性均有所提高。雙抗體夾心競爭ELISA方法測定小分子抗原二或多聚體小分子待測抗原酶標(biāo)抗體EEEE溫育洗板溫育二、檢測抗體間接法測抗體

間接法是檢測抗體常用的方法。原理：利用酶標(biāo)記的抗抗體（抗人免疫球蛋白抗體）以檢測與固相抗原結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。目前應(yīng)用最多的是抗HCV、抗HIV以及梅毒螺旋體抗體等檢測。酶標(biāo)抗體固相抗原待測抗體EE間接法測抗體影響因素1.嚴(yán)格講所測定的僅為抗體的IgG類，不涉及IgM和IgA類，這是有酶標(biāo)二抗體決定的。2.間接法成功的關(guān)鍵在于抗原的純度。一般為基因工程重組抗原，如HCV的NS3,NS4,NS5,HIV的GP41和GP120等。3另一種干擾因素為正常血清中所含的高濃度的非特異性IgG。病人血清中受檢的特異性IgG只占總IgG中的一小部分。IgG的吸附性很強(qiáng)，非特異IgG可直接吸附到固相載體上，有時也可吸附到包被抗原的表面。在檢測過程中標(biāo)本須先行稀釋，以避免過高的陰性本底影響結(jié)果的判斷。

2.雙抗原夾心法測抗體

反應(yīng)模式與雙抗體夾心法類似。原理：用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物，以檢測相應(yīng)的抗體。與間接法測抗體的不同之處為以酶標(biāo)抗原代替酶標(biāo)抗抗體。此法中受檢標(biāo)本不需稀釋，可直接用于測定，因此其敏感度相對高于間接法。乙肝標(biāo)志物中抗HBs的檢測常采用本法。雙抗原夾心法測抗體也可采用“一步法”。由于機(jī)體產(chǎn)生抗體IgG的滴度有限，因而不會產(chǎn)生“鉤狀效應(yīng)”。固相抗原EE待測抗體酶標(biāo)抗原溫育洗板EE溫育EE測定HBsAb時采用純化的HBsAg包被反應(yīng)板加入待測標(biāo)本，同時加入HBsAg-HRP形成HBsAg-抗－HBs-HBsAg-HRP復(fù)合物加入TMB低物顯色測OD值3.競爭法測抗體

當(dāng)抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時，可用此法檢測特異性抗體。其原理為標(biāo)本中的抗體和一定量的酶標(biāo)抗體競爭與固相抗原結(jié)合。標(biāo)本中抗體量越多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗體愈少，因此陽性反應(yīng)呈色淺于陰性反應(yīng)。如抗原為高純度的，可直接包被固相。競爭法測抗－HBe采用多克隆抗－HBe、基因工程重組HBeAg包被反應(yīng)板，加入待測標(biāo)本，同時加入單克隆抗－HBe-HRP，與抗原形成競爭結(jié)合，如待測標(biāo)本中抗抗－Hbe含量高，則抗－HBe-HRP與HbeAg結(jié)合少，加入TMB顯色時低物顯色淡，反之顯色深。加入底物顯色測OD值（1）雙抗體夾心法測抗原在臨床檢驗(yàn)中，如用抗hCG抗血清作為妊娠診斷試劑檢定尿液中hCG，只能用于hCG濃度較高的試驗(yàn)，否則婦女生理性排泄入尿液中的微量LH將與之發(fā)生交叉反應(yīng)。但不適用于測定半抗原及小分子單價抗原，因其不能形成兩位點(diǎn)夾心。雙抗體夾心競爭ELISA方法測定小分子抗原同時避免標(biāo)記特異性抗體，而另一優(yōu)點(diǎn)是只要標(biāo)記一種抗抗體，即可達(dá)到多種應(yīng)用。此法常用于病毒性感染的早期診斷。加入TMB低物顯色?蛋白質(zhì)是最主要、最常見的抗原；形成HBsAg-抗－HBs-HBsAg-HRP復(fù)合物洗滌時設(shè)法加大水流量或加大水壓，讓水流沖擊板孔表面，洗滌效果更佳。Ab＋Ag＋Ab*Ab·Ag·Ab*---a在定量測定中，加入底物后的反應(yīng)溫度和時間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。0左右時，DAB在波長450nm處有廣范圍的最大吸收。4.捕獲包被法測抗體

如抗原中會有干擾物質(zhì)，直接包被不易成功，可采用捕獲包被法，即先包被與固相抗原相應(yīng)的抗體，然后加入抗原，形成固相抗原。在臨床檢驗(yàn)中測定抗體IgM時多采用捕獲包被法。原理：先用抗人IgM抗體包被固相，以捕獲血清標(biāo)本中的IgM（其中包括針對抗原的特異性IgM抗體和非特異性的IgM）。然后加入抗原，此抗原僅與特異性IgM相結(jié)合。繼而加酶標(biāo)記針對抗原的特異性抗體。再與底物作用，呈色即與標(biāo)本中的IgM成正相關(guān)。此法常用于病毒性感染的早期診斷。急性甲型肝炎的診斷的血清抗-HAV的IgM檢測、急性乙型肝炎病毒感染的血清抗HBcIgM檢測和TORRCH系列的IgM檢測等。

抗人IgMμ鏈作為固相抗體加入待測標(biāo)本IgM類抗體被固相捕獲再加入特異抗原，與固相上捕獲的IgM抗體結(jié)合加入酶標(biāo)抗特異抗原的抗體加入底物顯色測OD值戌型肝炎病毒（HEV）IgM抗體檢測

鼠抗人IgMμ鏈作為固相抗體

加入待測標(biāo)本IgM類抗體固相捕獲加入HRP標(biāo)記的HEV抗原

形成包被二抗-IgM抗體-酶標(biāo)抗原復(fù)合物加入底物顯色測OD值甲型肝炎病毒（HAV）IgM抗體檢測鼠抗人IgMμ鏈作為固相抗體

加入待測標(biāo)本IgM類抗體固相捕獲加入HRP標(biāo)記的HAV抗原

形成包被二抗-IgM抗體-酶標(biāo)抗原復(fù)合物加入底物顯色測OD值

也有用間接法ELISA測IgM抗體如用抗原包被的間接法直接測定IgM抗體，因標(biāo)本中一般同時存在較高濃度的IgG抗體，部分特異IgG抗體將與IgM抗體競爭與固相的抗原結(jié)合，干擾IgM抗體的檢測。必須先將標(biāo)本A蛋白或抗IgG抗體處理，以除去IgG的干擾。類風(fēng)濕因子（RF，IgM類）及其他非特異性IgM的干擾1.RF由于能與固相的抗人μ鏈抗體結(jié)合，并可與隨后加入的酶標(biāo)抗體（動物IgG)反應(yīng)，導(dǎo)致假陽性反應(yīng)。

2.非特異性IgM在第一步溫育中，可與特異性IgM競爭與固相抗體結(jié)合，所以影響測定的靈敏度。因此需對樣本進(jìn)行稀釋。影響測定結(jié)果的標(biāo)本因素標(biāo)本采集可用作ELISA測定的標(biāo)本十分廣泛，體液（如血清）、分泌物（唾液）和排泄物（如尿液、糞便）等均可作標(biāo)本以測定其中某種抗體或抗原成份。

醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中均以血清作為檢測標(biāo)本血清標(biāo)本可按常規(guī)方法采集，應(yīng)注意避免溶血，紅細(xì)胞溶解時會釋放出具有過氧化物酶活性的物質(zhì)，以HRP為標(biāo)記的ELISA測定中，溶血標(biāo)本可能會增加非特異性顯色。

如有細(xì)菌污染，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP，也會產(chǎn)生假陽性反如在冰箱中保存過久，其中的可發(fā)生聚合，在間接法ELISA中可使本底加深。一般說來，在5天內(nèi)測定的血清標(biāo)本可放置于4℃，超過一周測定的需低溫冰存。

凍結(jié)血清融解后，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應(yīng)充分混勻，宜輕緩，避免氣泡，可上下顛倒混和，不要在混勻器上強(qiáng)烈振蕩?；鞚峄蛴谐恋淼难鍢?biāo)本應(yīng)先離心或過濾，澄清后再檢測反復(fù)凍融會使抗體效價跌落，所以測抗體的血清標(biāo)本如需保存作多次檢測，宜少量分裝冰存。保存血清自采集時就應(yīng)注意無菌操作2.試劑的準(zhǔn)備從冰箱中拿出即用，有可能影響后面溫育時間不夠，導(dǎo)致對一些若陽性的標(biāo)本的檢測出現(xiàn)假陰性。洗板液稀釋時所用的蒸餾水或去離子水應(yīng)保證質(zhì)量。3.加樣

在ELISA中一般有3次加樣步聚，即加標(biāo)本，加酶結(jié)合物，加底物。加樣時應(yīng)將所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。加