免疫原和抗血清的制備多媒體

第三章免疫原和抗血清的制備第一頁，共四十頁。?第一節(jié)免疫原的制備一、顆粒性抗原的制備二、可溶性抗原的制備和純化三、半抗原性免疫原的制備第二節(jié)免疫佐劑一、佐劑的種類二、佐劑的作用機(jī)制第三節(jié)抗血清的制備一、免疫動物的選擇二、免疫程序三、動物采血法第二頁，共四十頁。?第四節(jié)抗血清的鑒定和保存一、抗血清的鑒定二、抗血清的保存第五節(jié)抗血清的純化一、特異性IgG抗體二、單價特異性抗血清思考題小結(jié)第三頁，共四十頁。?第一節(jié)免疫原的制備免疫原(immunogen)是能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體并能與抗體發(fā)生反應(yīng)的物質(zhì)顆粒性抗原－細(xì)胞、細(xì)菌、寄生蟲可溶性抗原－蛋白質(zhì)、糖蛋白、脂蛋白、核酸第四頁，共四十頁。?細(xì)胞抗原：綿羊紅細(xì)胞細(xì)菌抗原：菌體抗原、鞭毛抗原寄生蟲體抗原：蟲卵一、顆粒性抗原的制備第五頁，共四十頁。?組織細(xì)胞抗原的制備：高速搗碎法－組織搗碎機(jī)搗碎研磨法－用玻璃勻漿器或乳缽研磨

（一）可溶性抗原的制備二、可溶性抗原的制備和純化第六頁，共四十頁。?組織細(xì)胞或培養(yǎng)細(xì)胞可溶性抗原的制備：

反復(fù)凍融法－-20℃凍結(jié)，然后室溫融化超聲破碎法－超聲波（1～20kHz）自溶法－自身酶系酶處理法－溶菌酶、纖維素酶、蝸牛酶表面活性劑處理法－SDS、去氧膽酸鈉、二乙基十六烷基溴

第七頁，共四十頁。?免疫球蛋白片段的制備：非共價鍵解離法－改變pH、利用強(qiáng)變性劑共價鍵解離法－氧化法和還原法溴化氰裂解法酶解法－木瓜酶、胃蛋白酶

第八頁，共四十頁。?超速離心法：差速離心法－低速和高速離心交替進(jìn)行密度梯度離心法－區(qū)帶離心法（二）可溶性抗原的純化第九頁，共四十頁。?選擇性沉淀法：核酸去除法－氯化錳、硫酸魚精蛋、鏈霉素鹽析法－硫酸銨、硫酸鈉有機(jī)溶劑沉淀法－乙醇、丙酮聚合物沉淀法－聚乙二醇

第十頁，共四十頁。?離子交換層析法：利用蛋白質(zhì)帶電荷不同進(jìn)行分離離子交換劑：

離子交換纖維素、離子交換凝膠、離子交換樹脂

凝膠過濾法：利用凝膠的分子篩作用，對分子量不同的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離

第十一頁，共四十頁。?親和層析法：利用生物大分子之間具有的專一性親和力(1)親和層析支持物的選擇：①非特異性吸附低；②液體流速快；③在各種pH和高濃度鹽溶液中穩(wěn)定；④有合適豐富的化學(xué)基團(tuán)，與蛋白質(zhì)或其它化合物結(jié)合；⑤有豐富的微孔，以增加結(jié)合容量。最常用的支持物是Separose4B

第十二頁，共四十頁。?(2)配體的選擇條件：①抗原或抗體必須單一特異性；②抗原與抗體必須具有較高的親和力；③配體必須有一個適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)基團(tuán)。第十三頁，共四十頁。?(3)抗原或抗體與支持物的結(jié)合：①活化：溴化氰；②接“手臂”：帶“手臂”瓊脂糖有氨基瓊脂糖、羧基瓊脂糖、溴乙酰瓊脂糖、重氮鹽衍生物瓊脂糖、疏基瓊脂糖。第十四頁，共四十頁。?(4)親和層析條件的選擇：

①封閉活性基團(tuán)：用無關(guān)蛋白質(zhì)或三乙醇胺過柱；②除去未結(jié)合和結(jié)合不牢的蛋白：先用NaHCO3洗脫，再用解脫劑處理；解脫劑：3mol/L硫氰酸鉀（或鈉）、0.1mol/LpH2.4甘氨酸緩沖液第十五頁，共四十頁。?電泳法：

利用分子量和電荷量不同進(jìn)行分離

第十六頁，共四十頁。?（三）純化抗原的鑒定蛋白含量測定：紫外吸收法、雙縮脲法、酚試劑法分子量測定：SDS、凝膠過濾純度鑒定：醋酸纖維膜電泳、SDS、毛細(xì)管電泳、等電聚焦、高效液相層析免疫活性鑒定：雙向免疫擴(kuò)散、免疫電泳、ELISA第十七頁，共四十頁。?三、半抗原性免疫原的制備

半抗原(hapten)：僅有抗原性而無免疫原性的物質(zhì)如多肽、甾體激素、核苷、某些藥物等載體(carrier)：賦予半抗原以免疫原性的物質(zhì)第十八頁，共四十頁。?①蛋白質(zhì)：牛血清白蛋白、人血清白蛋白、兔血清白蛋白牛甲狀腺球蛋白血藍(lán)蛋白②多肽聚合物：多聚賴氨酸（polylysine）③大分子聚合物：羧甲基纖維素(carboxymethylcellulose,CMC)聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone,PVP）

（一）載體第十九頁，共四十頁。?①物理方法：利用通過電荷和微孔吸附半抗原吸附的載體有CMC、PVP、硫酸葡聚糖等

（二）半抗原與載體的連接方法②化學(xué)方法：利用某些功能基團(tuán)將半抗原連接到載體上帶有游離氨基或羧基以及兩種基團(tuán)都有的半抗原：碳二亞胺法戊二醛法混和酸酐法過碘酸氧化法不帶氨基和羧基的半抗原：用化學(xué)方法使其轉(zhuǎn)變?yōu)閹в杏坞x氨基或游離羧基的衍生物，再與載體連接

第二十頁，共四十頁。?（三）半抗原性免疫原的鑒定一個載體分子至少要連接20個以上的半抗原分子半抗原與載體的比例測定：吸收光譜分析法放射性核素標(biāo)記半抗原滲入法第二十一頁，共四十頁。?第二節(jié)免疫佐劑免疫佐劑（immunoadjuvant）：預(yù)先或與抗原同時注入體內(nèi)，可增強(qiáng)機(jī)體對該抗原的免疫應(yīng)答或改變免疫應(yīng)答的類型的物質(zhì)稱為免疫佐劑,簡稱佐劑（adjuvant）。第二十二頁，共四十頁。?化合物:氫氧化鋁、明礬、礦物油、吐溫-80、弗氏不完全佐劑以及人工合成的多聚肌苷酸∶胞苷酸(polyI∶C)、脂質(zhì)體生物制劑:處理改造的細(xì)菌及代謝產(chǎn)物，如卡介苗、短小棒狀桿菌、百日咳桿菌及CTB、LPS和類脂A、胞壁酰二肽等；細(xì)胞因子及熱休克蛋白用于人體的佐劑：氫氧化鋁、明礬、polyI∶C、胞壁酰二肽、細(xì)胞因子、熱休克蛋白常用于動物實(shí)驗(yàn)的佐劑：弗氏佐劑(Freund’sadjuvant)

一、佐劑的種類第二十三頁，共四十頁。?弗氏佐劑(Freund,sadjuvant)：弗氏完全佐劑－羊毛脂與液體石蠟的混合物弗氏不完全佐劑－弗氏完全佐劑加卡介苗乳化方法：研磨法和攪拌混合法

第二十四頁，共四十頁。?改變抗原物理性狀，延緩其降解和排除，更有效刺激免疫系統(tǒng)。刺激單核-吞噬細(xì)胞系統(tǒng)，增強(qiáng)其處理和提呈抗原的能力。刺激淋巴細(xì)胞增殖和分化。

二、佐劑的作用機(jī)制第二十五頁，共四十頁。?第三節(jié)抗血清的制備

抗血清的制備是將制備好的免疫原按照一定的免疫程序接種給所選擇的動物，該動物在含有多種抗原表位的抗原刺激下，體內(nèi)多個B細(xì)胞克隆被激活并產(chǎn)生針對某一抗原多種不同表位的抗體，其混合物為多克隆抗體第二十六頁，共四十頁。?多克隆抗體的產(chǎn)生示意圖多克隆抗體(polyclonalantibody,pcAb)：天然抗原刺激多種B淋巴細(xì)胞克隆產(chǎn)生的多種抗體的混合物

第二十七頁，共四十頁。?抗原來源與動物種屬的關(guān)系

種屬差異越遠(yuǎn)，免疫原性越強(qiáng)

動物個體的選擇

適齡、健康、體重符合要求

抗原的性質(zhì)一、免疫動物的選擇第二十八頁，共四十頁。?免疫原的劑量

中間劑量范圍內(nèi)，免疫原劑量增加可獲得高效價抗體

免疫間隔時間

第一次和第二次間隔10～20天，三次及以后間隔7～10天免疫途徑

皮內(nèi)、皮下、肌肉、靜脈、腹腔、淋巴結(jié)

二、免疫程序第二十九頁，共四十頁。?頸動脈采血法：家兔、綿羊、山羊

心臟采血法：

家兔、豚鼠、大鼠、雞

靜脈采血法：

家兔、山羊、綿羊

三、動物采血法第三十頁，共四十頁。?第四節(jié)抗血清的鑒定和保存第三十一頁，共四十頁。?抗體特異性的鑒定：雙向免疫擴(kuò)散法抗體效價的鑒定：凝集試驗(yàn)、雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)、ELISA抗體純度的鑒定：SDS、雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)、免疫電泳抗體親合力的鑒定：平衡透析法、ELISA、RIA競爭結(jié)合試驗(yàn)

一、抗血清的鑒定第三十二頁，共四十頁。?2℃～8℃保存：短期保存冰凍保存：保存5年真空干燥保存：保存5～10年二、抗血清的保存第三十三頁，共四十頁。?第五節(jié)抗血清的純化抗原免疫動物制備的抗血清是成分復(fù)雜的混合物，除含有特異性抗體外，還存在與目的抗體不相關(guān)的成分。純化目的是除去這些不相關(guān)成分，防止抗血清中其他雜抗體干擾試驗(yàn)結(jié)果。第三十四頁，共四十頁。?鹽析法：硫酸銨鹽析法、硫酸鈉鹽析法凝膠過濾法：常結(jié)合鹽析法離子交換層析法：DEAE纖維素、QAE-sephadex、QAE纖維素親和層析法：純化抗原或SPA交聯(lián)Sepharose4B制成親和層析柱

一、特異性IgG抗體第三十五頁，共四十頁。?親和層析法：雜抗原交聯(lián)Sepharose4B柱吸附劑方法：借助雙功能試劑用不含特異抗原的抗原混合液制成固相吸附劑二、單價特異性抗血清第三十六頁，共四十頁。?1．什么是免疫原？2．如何制備可溶性抗原？3．常用的細(xì)胞破碎方法有哪些？4．連接半抗原的載體有哪些？制備半抗原性免疫原的方法有哪些？5．純化抗原的鑒定包括有哪些內(nèi)容？6．什么是免疫佐劑？免疫佐劑有哪些種類？免疫佐劑的作用機(jī)制有哪些？7．什么是抗血清？什么是多克隆抗體？8．如何制備抗血清？9．動物采血有哪些方法？10．抗血清的鑒定包括哪些內(nèi)容？思考題第三十七頁，共四十頁。?小結(jié)免疫原是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體并能與抗體發(fā)生反應(yīng)的物質(zhì)。半抗原是指僅有抗原性而無免疫原性的物質(zhì)，與載體結(jié)合后可具有免疫原性。免疫佐劑是先于抗原或與抗原一起注入機(jī)體，可增強(qiáng)機(jī)體對該抗原的特異性免疫應(yīng)答或改變免疫應(yīng)答類型的物質(zhì)?？寡迨墙?jīng)過抗原免疫的動物血清。在含有多種抗原表位的抗原刺激下，體內(nèi)多個B細(xì)胞克隆被激活并產(chǎn)生針對多種不同表位的抗體，其混合物為多克隆抗體。特異性IgG抗體的純化方法有鹽析法、凝膠過濾法、離子交換層析法、親和層析法等；制備單價特異性抗血清可采用親和層析法和吸附劑方法。第三十八頁，共四十頁。?謝謝2023/5/142023/5/142023/5/142023/5/142023/5/142023/5/142023/5/142023/5/142023/5/142023/5/142023/5/142023/5/142023/5/14第三十九頁，共四十頁。內(nèi)容總結(jié)第三章免疫原和抗血清的制備。?。研磨法－用玻璃勻漿器或乳缽研磨。表面活性劑處理法－SDS、去氧膽酸鈉、二乙基十六烷基溴。共價鍵解離法－氧化法和還原