CNAS-GL039 分子診斷檢驗(yàn)程序性能驗(yàn)證指南

CNAS-GL039分子診斷檢驗(yàn)程序性能驗(yàn)證指南GuidanceonthePerformanceforMolecularDiagnosticProcedures中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì)2019年02月日發(fā)布2019年月15日實(shí)施CNAS-GL039:2019第1頁(yè)共頁(yè)前言CNASCNAS-CL022012《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則》和CNAS-CL02-A009：2018《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)行性能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)所做的具體解釋和指導(dǎo)，供醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室和評(píng)審員參考使用。本文件為首次發(fā)布。2019年02月日發(fā)布2019年月15日實(shí)施CNAS-GL039:2019第2頁(yè)共頁(yè)分子診斷檢驗(yàn)程序性能驗(yàn)證指南1范圍本指南適用于申請(qǐng)認(rèn)可或已獲認(rèn)可的醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室對(duì)分子診斷相關(guān)檢測(cè)程序PCRSanger(NGS)、原位雜交等，其他分子診斷使用的檢驗(yàn)程序/方法可參考使用。本文件適用于醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室采用的經(jīng)確認(rèn)的檢驗(yàn)程序。度差別較大，建議結(jié)合實(shí)際情況酌情選擇與之相符合的性能驗(yàn)證方案。2規(guī)范性引用文件部分）適用于本指南。WS/T420-2013《臨床實(shí)驗(yàn)室對(duì)商品定量試劑盒分析性能的驗(yàn)證》WS/T492-2016《臨床檢驗(yàn)定量測(cè)定項(xiàng)目精密度與正確度性能驗(yàn)證》WS/T505-2017《定性測(cè)定性能評(píng)價(jià)指南》YY/T1261-2015《HER2YY/T1459-2016《人類(lèi)基因原位雜交檢測(cè)試劑盒》3術(shù)語(yǔ)和定義對(duì)于本指南，GB/T29791.1-2013/ISO18113-1：2009）中的定義適用。下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本指南。3.1可報(bào)告范圍reportablerange體外診斷醫(yī)療器械性能特征已被驗(yàn)證的測(cè)量區(qū)間。[GB/T29791.1-2013/ISO18113-1：20093.46注1]4.總則4.1性能驗(yàn)證的時(shí)機(jī)2019年02月日發(fā)布2019年月15日實(shí)施CNAS-GL039:2019第3頁(yè)共頁(yè)4.1.1檢驗(yàn)程序常規(guī)應(yīng)用前。4.1.2于儀器主要部件故障，儀器搬遷，設(shè)施、環(huán)境的嚴(yán)重失控等。4.1.3變更，如試劑升級(jí)、儀器更新、校準(zhǔn)品溯源性改變等應(yīng)按照新系統(tǒng)來(lái)進(jìn)行驗(yàn)證。4.2性能驗(yàn)證的參數(shù)分子診斷檢驗(yàn)程序的性能參數(shù)主要包括PCR定性和定量檢測(cè)、Sanger測(cè)序、二代基因測(cè)序(NGS)和原位雜交等。PCR定量檢測(cè)選擇驗(yàn)證的性能指標(biāo)宜包括測(cè)PCR擾能力、交叉反應(yīng)等。Sanger測(cè)序和NGS選擇驗(yàn)證的性能指標(biāo)宜包括方法符合宜選用方法符合率。果檢驗(yàn)程序適用樣本類(lèi)型包括除腫瘤組織/同操作人員間的驗(yàn)證，驗(yàn)證程序可參照本指南相關(guān)內(nèi)容制定。量有重要影響的參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。不同技術(shù)平臺(tái)、樣本類(lèi)型以及預(yù)期用途不同時(shí)，所需驗(yàn)證的性能指標(biāo)宜有所側(cè)重。4.3性能驗(yàn)證的判斷標(biāo)準(zhǔn)驗(yàn)證結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)是廠商或研發(fā)者在試劑盒或檢測(cè)系統(tǒng)說(shuō)明書(shū)中聲明的性能2019年02月日發(fā)布2019年月15日實(shí)施CNAS-GL039:2019第4頁(yè)共頁(yè)指標(biāo)。5實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備一份樣本需進(jìn)行多次試驗(yàn)時(shí)，對(duì)樣本進(jìn)行分裝保存，避免反復(fù)凍融。5.1量控制，確保檢測(cè)系統(tǒng)工作狀態(tài)正常。5.2實(shí)驗(yàn)室設(shè)施及環(huán)境符合分析系統(tǒng)工作要求。5.3儀器經(jīng)過(guò)校準(zhǔn)，各項(xiàng)性能指標(biāo)合格。5.4試劑和校準(zhǔn)品滿足要求。5.5負(fù)責(zé)實(shí)施性能驗(yàn)證的人員應(yīng)了解驗(yàn)證方案，制定驗(yàn)證計(jì)劃，并組織實(shí)施。5.6師于顯微鏡下確認(rèn)符合相應(yīng)要求后才可進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。需要時(shí),可行腫瘤細(xì)胞富集。5.7效率滿足要求。核酸提取效率的評(píng)價(jià)宜包括：核酸濃度、純度及完整性。6性能驗(yàn)證要求規(guī)定的程序。法）或分析軟件的，則不屬于已確認(rèn)的檢驗(yàn)程序。6.1定性項(xiàng)目的性能驗(yàn)證6.1.1方法符合率驗(yàn)證要求方法、經(jīng)驗(yàn)證性能符合要求滿足臨床預(yù)期用途的方法（如：通過(guò)ISO15189認(rèn)可驗(yàn)證方案2019年02月日發(fā)布2019年月15日實(shí)施CNAS-GL039:2019第5頁(yè)共頁(yè)a5/一般不少于10例樣本。注1：罕見(jiàn)或少見(jiàn)病種的項(xiàng)目，可酌情減少樣本例數(shù)。注2：若弱陽(yáng)性/低擴(kuò)增樣本不好獲取，可用適當(dāng)稀釋陽(yáng)性樣本獲得類(lèi)似的效果。注3：對(duì)于雜交檢測(cè)技術(shù)，若弱陽(yáng)性/低擴(kuò)增樣本不好獲取，可用不同比例的特定細(xì)胞相似臨床癥狀的樣本。b將所有檢測(cè)結(jié)果按下表匯總填表，計(jì)算符合率。表：方法符合率驗(yàn)證參比方法

總數(shù)陽(yáng)性陰性陽(yáng)性aba+b

候選方法陰性cdc+d總數(shù)a+cb+da+b+c+d陽(yáng)性符合率=a/(a+c)×100%陰性符合率=d/(b+d)×100%總符合率=(a+d)/(a+b+c+d)×100%判斷標(biāo)準(zhǔn)參見(jiàn)4.3。6.1.2檢出限驗(yàn)證要求物質(zhì)時(shí)，或以定量形式表達(dá)定性結(jié)果時(shí)，應(yīng)進(jìn)行檢出限的驗(yàn)證。驗(yàn)證方案a2019年02月日發(fā)布2019年月15日實(shí)施CNAS-GL039:2019第6頁(yè)共頁(yè)系總核酸濃度和突變序列所占比例兩個(gè)方面進(jìn)行評(píng)價(jià)。b可重復(fù)測(cè)定5次或在不同批內(nèi)對(duì)該濃度樣本進(jìn)行20次重復(fù)測(cè)定（如測(cè)定5天，每天測(cè)定4圍之內(nèi)。判斷標(biāo)準(zhǔn)如果是5100%20至少18次靶核酸。示例NGS和SangerSNVindelCNV53個(gè)，如果95%檢出限濃度以上的樣本檢測(cè)到可靠變異，則檢出限驗(yàn)證通過(guò)。示例交使用經(jīng)合格病理醫(yī)師評(píng)估的接近最低檢測(cè)限的按照一定比例混合的細(xì)胞系沉降制片/或組織切片，在不同批內(nèi)對(duì)樣本進(jìn)行測(cè)定（如連續(xù)測(cè)定5天，每天測(cè)定490%以上樣本符合細(xì)胞系特性或與中心參考實(shí)驗(yàn)室結(jié)果相同（必要時(shí)可原片復(fù)核原位雜交驗(yàn)證見(jiàn)6.1.5。6.1.3交叉反應(yīng)驗(yàn)證要求因型的方法，應(yīng)在待測(cè)核酸濃度水平驗(yàn)證其它基因型對(duì)待測(cè)核酸測(cè)定的影響。驗(yàn)證方案2019年02月日發(fā)布2019年月15日實(shí)施CNAS-GL039:2019第7頁(yè)共頁(yè)入樣本保存液或經(jīng)確認(rèn)為陰性的樣本中，與常規(guī)樣本一樣處理，至少重復(fù)檢測(cè)3樣本，與常規(guī)樣本一樣處理，至少重復(fù)檢測(cè)3次。判斷標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果應(yīng)為陰性。6.1.4抗干擾能力驗(yàn)證要求白G也應(yīng)評(píng)估抗凝劑和樣本保存液等對(duì)結(jié)果的影響。驗(yàn)證方案實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)實(shí)際情況選擇驗(yàn)證方案。方案1少重復(fù)測(cè)定3次以上。方案2對(duì)照組。分別在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中加入弱陽(yáng)性樣本（量小于10%一樣處理，每組至少重復(fù)檢測(cè)3次。判斷標(biāo)準(zhǔn)方案1：弱陽(yáng)性樣本檢測(cè)仍為弱陽(yáng)性結(jié)果，則驗(yàn)證通過(guò)。方案2證濃度下，干擾物質(zhì)對(duì)測(cè)定有顯著影響。6.1.5原位雜交技術(shù)分析敏感性和特異性驗(yàn)證要求至少200個(gè)與探針特定對(duì)應(yīng)的基因組目標(biāo)序列應(yīng)被用來(lái)進(jìn)行分析敏感性和特異性驗(yàn)證。2019年02月日發(fā)布2019年月15日實(shí)施CNAS-GL039:2019第8頁(yè)共頁(yè)驗(yàn)證方案樣本至少來(lái)自5個(gè)不同個(gè)體，至少50個(gè)（用于驗(yàn)證遠(yuǎn)離著絲粒的探針）或100胞進(jìn)行原位雜交檢測(cè)。判斷標(biāo)準(zhǔn)敏感性和特異性均不低于90%。6.2定量項(xiàng)目性能驗(yàn)證分子診斷定量檢測(cè)項(xiàng)目的性能驗(yàn)證請(qǐng)參見(jiàn)CNAS-GL037《臨床化學(xué)定量檢驗(yàn)6.3特定性能驗(yàn)證PCRNGS分析系統(tǒng)的性能驗(yàn)證。6.3.1核酸提取效率驗(yàn)證要求核酸提取效率包括核酸純度，核酸提取產(chǎn)率和完整性。驗(yàn)證方案聲明的可提取的核酸濃度。a）核酸純度：將核酸提取液用分光光度計(jì)測(cè)定A260/280比值。b2A入一定體積（小于總體積10%）已知濃度的待測(cè)核酸，另一份（B）加入同體積A和B公式計(jì)算核酸提取得率，重復(fù)三次測(cè)定，計(jì)算平均值。核酸提取產(chǎn)率=AB加入的待測(cè)核酸量×100%2019年02月日發(fā)布2019年月15日實(shí)施CNAS-GL039:2019第9頁(yè)共頁(yè)c）核酸完整性：按照試劑盒要求，提取含有不同濃度待測(cè)核酸的樣本，核凝膠電泳，與待測(cè)核酸標(biāo)準(zhǔn)物比較。判斷標(biāo)準(zhǔn)a）核酸純度：待測(cè)物質(zhì)為DNA時(shí)，A260/280比值在1.7-1.9；待測(cè)物質(zhì)為RNA時(shí)，A260/280比值在1.8-2.0。b）核酸提取產(chǎn)率：核酸提取得率應(yīng)不低于廠家聲明或?qū)嶒?yàn)室制定的標(biāo)準(zhǔn)。c無(wú)明顯降解。6.3.2擴(kuò)增效率驗(yàn)證驗(yàn)證要求致時(shí)，定量結(jié)果才準(zhǔn)確。如果懷疑PCR擴(kuò)增系統(tǒng)有問(wèn)題應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)增效率驗(yàn)證。驗(yàn)證方案將接近線性范圍上限濃度的樣本10倍稀釋個(gè)濃度，最低濃度應(yīng)在線性范圍內(nèi)或?qū)?biāo)準(zhǔn)品按照廠家要求處理，然后進(jìn)行擴(kuò)增。將濃度對(duì)數(shù)值作為橫軸，對(duì)應(yīng)的CtKE：E=10-1/K-判斷標(biāo)準(zhǔn)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增效率均≥90%且≤110%。6.3.3上機(jī)測(cè)序的性能驗(yàn)證驗(yàn)證要求保證測(cè)序結(jié)果的可靠性。驗(yàn)證方案建議使用質(zhì)控品或用參考品DNA束后的參數(shù)，根據(jù)性能參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)設(shè)備性能是否符合使用要求。判斷標(biāo)準(zhǔn)儀器的各項(xiàng)性能參數(shù)在廠家聲明的正常范圍內(nèi)則驗(yàn)證通過(guò)。2019年02月日發(fā)布2019年月15日實(shí)施CNAS-GL039:2019第頁(yè)共11頁(yè)6.3.4數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)的性能驗(yàn)證驗(yàn)證要求和軟件系統(tǒng)，涵蓋數(shù)據(jù)分析的所有步驟。驗(yàn)證方案如變異類(lèi)型包含SNV如變異類(lèi)型包含indel，則應(yīng)含有在同一序列上有相近兩個(gè)indel。判斷標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)結(jié)果符合率均≥95％即為驗(yàn)證通過(guò)。2019年02月日發(fā)布2019年月15日實(shí)施CNAS-GL039:2019第頁(yè)共11頁(yè)參考文獻(xiàn)1.CNAS-CL02：2012《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則》2.CNAS-CL02-A009《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則在分子診斷領(lǐng)域的應(yīng)用說(shuō)明》3.WS/T505-2017《定性測(cè)定性能評(píng)價(jià)指南》4.YY/T1182-2010核酸擴(kuò)增檢測(cè)用試劑(盒)5.CLSIEP12-A2:UserProtocolsforEvaluationofQualitativeTestPerformance；ApprovedGuideline-SecondEdition.6.(試行)2015-7-37.