上海市臨檢中心 PCR培訓(xùn)班 臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)質(zhì)量要求

臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)質(zhì)量要求上海市臨床檢驗(yàn)中心肖艷群制定依據(jù)《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床實(shí)驗(yàn)室管理辦法》（衛(wèi)醫(yī)發(fā)[2006]73號(hào)）《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理辦法》（衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)[2010]194號(hào)）醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則

ISO15189(CNAS-CL02)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則在基因擴(kuò)增檢驗(yàn)領(lǐng)域的應(yīng)用說明（CNAS-CL36）醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則在病理學(xué)檢查領(lǐng)域的應(yīng)用說明（CNAS-CL37）基本內(nèi)容質(zhì)量管理體系建立人員實(shí)驗(yàn)室設(shè)置、設(shè)施和環(huán)境設(shè)備、材料與信息系統(tǒng)分析前分析中分析后質(zhì)量管理體系建立

質(zhì)量手冊(cè)、程序文件、操作規(guī)程、記錄

現(xiàn)行有效

適合自身實(shí)際情況

寫你所做的、做你所寫的、記你所做的文件至少應(yīng)包括組織和人員管理：各類人員的崗位職責(zé)、崗位培訓(xùn)、繼續(xù)教育、定期考核、評(píng)估等環(huán)境、設(shè)施及安全管理文件或程序儀器、設(shè)備采購(gòu)、驗(yàn)收、管理、領(lǐng)用及使用的文件或程序檢驗(yàn)試劑及耗材的采購(gòu)、驗(yàn)收、管理、領(lǐng)用及使用樣品的采集、運(yùn)送、接收、處理及保存檢驗(yàn)方法的選擇、確認(rèn)或驗(yàn)證檢驗(yàn)項(xiàng)目及儀器設(shè)備標(biāo)準(zhǔn)操作程序的建立和管理檢驗(yàn)結(jié)果質(zhì)量保證檢驗(yàn)報(bào)告管理的規(guī)定：結(jié)果的發(fā)放方式、報(bào)告的格式和內(nèi)容、保護(hù)患者隱私的規(guī)定記錄的管理：記錄的修改。保存及期限對(duì)差錯(cuò)事故及不符合工作的糾正及預(yù)防措施對(duì)服務(wù)對(duì)象投訴處理人員要求

實(shí)驗(yàn)室至少應(yīng)有2名取得PCR上崗證，并為本單位在職技術(shù)人員

實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人應(yīng)具有中級(jí)或以上專業(yè)技術(shù)任職資格

開展遺傳性疾病基因芯片診斷技術(shù)或基于組織等分子病理檢測(cè)技術(shù)并出具診斷報(bào)告的實(shí)驗(yàn)室，還應(yīng)具備至少2名取得《醫(yī)師執(zhí)業(yè)證書》、主治醫(yī)師或以上專業(yè)技術(shù)、從事本專業(yè)的本單位在職醫(yī)師

實(shí)驗(yàn)室有培訓(xùn)制度、計(jì)劃，保證其技術(shù)人員得到及時(shí)培訓(xùn)，并對(duì)培訓(xùn)效果進(jìn)行評(píng)估

實(shí)驗(yàn)室應(yīng)定期評(píng)審員工的工作能力，保存評(píng)審記錄

實(shí)驗(yàn)室應(yīng)分冊(cè)建立技術(shù)人員技術(shù)檔案，檔案至少應(yīng)包括以下內(nèi)容:學(xué)歷、職稱、ＰＣＲ上崗證書復(fù)印件；培訓(xùn)、能力評(píng)審等資料，并定期更新實(shí)驗(yàn)室設(shè)置

原則上應(yīng)分為四個(gè)區(qū)：試劑準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、產(chǎn)物分析區(qū)?

如使用全自動(dòng)擴(kuò)增分析儀，后兩區(qū)可合并?

如使用核酸提取、擴(kuò)增和產(chǎn)物分析一體化的全自動(dòng)分析系統(tǒng)，后三區(qū)可合并

各區(qū)有獨(dú)立的緩沖區(qū)

各區(qū)都有水池

各區(qū)有獨(dú)立的通風(fēng)系統(tǒng)（建議有窗戶的房間為PCR實(shí)驗(yàn)室），

標(biāo)本制備區(qū)有沖眼器和生物安全柜設(shè)施和環(huán)境實(shí)驗(yàn)室有足夠的空間保證：標(biāo)本處置符合分析前、后樣本分區(qū)放置、儀器放置符合維修和操作要求、打印檢驗(yàn)報(bào)告時(shí)交叉污染的控制標(biāo)本接收區(qū)建議放在四個(gè)區(qū)域以外的房間開展基于組織的分子病理項(xiàng)目宜有獨(dú)立的切片制備和前處理（脫蠟、水化）區(qū)域設(shè)施和環(huán)境進(jìn)入和使用實(shí)驗(yàn)室各區(qū)域應(yīng)有明確的限制和措施，防止患者和其他非相關(guān)人員的隨意進(jìn)出各工作區(qū)域應(yīng)有明確的標(biāo)記，應(yīng)按照單一方向進(jìn)入各工作區(qū)域，不同區(qū)域內(nèi)的設(shè)備、物品不得混用實(shí)驗(yàn)室應(yīng)規(guī)定環(huán)境溫、濕度的要求，實(shí)施監(jiān)控，并有記錄應(yīng)有指定的經(jīng)過培訓(xùn)的內(nèi)務(wù)管理人員（如保潔人員），有相應(yīng)清潔用具，有實(shí)驗(yàn)室清潔和消毒相關(guān)的記錄產(chǎn)物分析區(qū)

擴(kuò)增區(qū)

標(biāo)本制備區(qū)

試劑準(zhǔn)備區(qū)緩沖間基本原則：1、四個(gè)區(qū)域必須相互獨(dú)立2、各區(qū)不能直通，應(yīng)有緩沖間3、各區(qū)有獨(dú)立通風(fēng)系統(tǒng)設(shè)備、材料與信息系統(tǒng)

使用的儀器、試劑、耗材、輔助品必須符合國(guó)家相關(guān)規(guī)定。儀器：必須三證齊全試劑：必須CFDA批準(zhǔn)

相同檢驗(yàn)項(xiàng)目在不同儀器或系統(tǒng)上進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，須對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)(

2次/年，每次至少20份標(biāo)本，計(jì)算回歸方程，系統(tǒng)誤差應(yīng)<7.5%）

應(yīng)保存主要設(shè)備的檔案，檔案內(nèi)容應(yīng)包括：設(shè)備標(biāo)識(shí)、型號(hào)、序號(hào)或其它唯一性識(shí)別、到貨日期和投入運(yùn)行日期、目前放置地點(diǎn)、接收時(shí)的狀態(tài)、儀器使用說明書或其存放處、證實(shí)設(shè)備可以使用的設(shè)備驗(yàn)證報(bào)告、校準(zhǔn)和/或檢定報(bào)告、維護(hù)、損壞、故障或維修的記錄

應(yīng)制定各類儀器維護(hù)保養(yǎng)，校準(zhǔn)/檢定計(jì)劃，并有執(zhí)行記錄。儀器校準(zhǔn)需校準(zhǔn)儀器：溫度計(jì)、溫濕度計(jì)、移液器、恒溫金屬浴、生物安全柜、高速冷凍離心機(jī)、擴(kuò)增儀、雜交儀、測(cè)序儀；開展分子病理項(xiàng)目需校準(zhǔn)切片機(jī)（包括冰凍切片機(jī)）、撈片水浴槽校準(zhǔn)單位資質(zhì)合格的校準(zhǔn)/檢定報(bào)告校準(zhǔn)周期：參照國(guó)家計(jì)量部門或生產(chǎn)廠商的要求進(jìn)行，廠家沒有規(guī)定的則每年至少進(jìn)行一次內(nèi)部校準(zhǔn)的輔助設(shè)備，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)國(guó)家計(jì)量部門或生產(chǎn)廠商的規(guī)定制定內(nèi)部校準(zhǔn)操作規(guī)程和要求，并有內(nèi)部校準(zhǔn)的詳細(xì)記錄校準(zhǔn)/檢定設(shè)備，應(yīng)貼校準(zhǔn)/檢定標(biāo)識(shí)，并標(biāo)明下次校準(zhǔn)/檢定日擴(kuò)增儀維護(hù)：

75%乙醇定期清潔熱蓋和反應(yīng)槽或孔用無(wú)水乙醇清潔光路部分校準(zhǔn)：校準(zhǔn)單位：廠家校準(zhǔn)周期：定期校準(zhǔn)、儀器搬動(dòng)校準(zhǔn)參數(shù)：光路部分、背景熒光、溫控部分（溫度準(zhǔn)確度、均一性、溫度升降速率）恒溫金屬浴維護(hù)：75%乙醇擦拭加熱孔校準(zhǔn)：校準(zhǔn)單位：廠家、計(jì)量院、內(nèi)部校準(zhǔn)溫度準(zhǔn)確度（±1℃

）（應(yīng)涵蓋試驗(yàn)過程中所涉及的溫度）孔間溫度的均一性（±1℃

）（內(nèi)部校準(zhǔn)應(yīng)規(guī)定測(cè)定孔的選擇、測(cè)量時(shí)間、各孔溫度偏差允許范圍）移液器維護(hù)：

75%乙醇擦拭校準(zhǔn)：校準(zhǔn)周期、外校（廠家、計(jì)量所）、校準(zhǔn)量程（應(yīng)涵蓋試驗(yàn)過程中所涉及的量程）計(jì)量性能要求（容量允許誤差、測(cè)量重復(fù)性）內(nèi)部校準(zhǔn)-參照《定量、可調(diào)移液器試行檢定規(guī)程》(JJG646-2006)注意：環(huán)境的要求計(jì)量性能要求（標(biāo)稱容量、標(biāo)定點(diǎn)、容量允許誤差、測(cè)量重復(fù)性）校準(zhǔn)點(diǎn)涵蓋試驗(yàn)過程中所涉及的量程生物安全柜清潔:75%乙醇擦拭,不宜用次氯酸鈉溶液清潔檢定：有資質(zhì)的第三方檢測(cè)機(jī)構(gòu)檢定參數(shù)：高效過濾器完整性、流入氣流流速、下降氣流流速、氣流模式高速冷凍離心機(jī)維護(hù)保養(yǎng)：75%乙醇擦拭校準(zhǔn)：轉(zhuǎn)速、溫度設(shè)備出現(xiàn)故障時(shí)處理措施應(yīng)立即停止使用，并加上明顯標(biāo)識(shí)修復(fù)的設(shè)備必須經(jīng)校準(zhǔn)、檢定（驗(yàn)證）或檢測(cè)滿足要求后方能再次投入使用

可校準(zhǔn)的項(xiàng)目實(shí)施校準(zhǔn)

質(zhì)控品檢測(cè)結(jié)果在允許范圍內(nèi)

與其他儀器的檢測(cè)結(jié)果比較（5個(gè)樣本，覆蓋測(cè)量范圍，至少4個(gè)樣本測(cè)量結(jié)果偏移<±7.5%）

使用留樣再測(cè)結(jié)果進(jìn)行判別(5個(gè)樣本，覆蓋測(cè)量范圍，至少4個(gè)樣本測(cè)量結(jié)果偏移<±7.5%）實(shí)驗(yàn)室應(yīng)檢查由于上述缺陷對(duì)以前所進(jìn)行的檢測(cè)工作的影響，并記錄相關(guān)分析、處理意見耗材、試劑要求耗材

帶濾芯吸頭、離心管爆管和抑制物質(zhì)檢試劑盒的質(zhì)檢

包括外觀質(zhì)檢和性能質(zhì)檢選擇或更換試劑品牌：試劑性能驗(yàn)證更換試劑批號(hào)：試劑批間差，應(yīng)評(píng)價(jià)核酸提取效率和擴(kuò)增效率（定量項(xiàng)目至少使用高低兩個(gè)臨床樣本，結(jié)果在T±0.5范圍內(nèi)可接受）信息系統(tǒng)建立信息系統(tǒng)管理制度，制訂計(jì)算機(jī)（辦公用除外）和計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)使用權(quán)限、登陸密碼、維護(hù)的規(guī)定，有計(jì)算機(jī)安全保密和病毒防范的要求，并定期備份計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)，保證信息安全和完整。標(biāo)本接收、報(bào)告發(fā)放分析前質(zhì)量控制檢驗(yàn)申請(qǐng)，患者準(zhǔn)備，原始樣品采集、運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室并在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)傳遞標(biāo)本標(biāo)本采集時(shí)間對(duì)擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果的影響標(biāo)本的類型和采集量采樣及運(yùn)輸容器采樣質(zhì)量的評(píng)價(jià)標(biāo)本采集中的防污染實(shí)驗(yàn)室有各類患者準(zhǔn)備、標(biāo)本采集、運(yùn)送、接收（或拒收）、保存和安全處置的具體要求和操作規(guī)程標(biāo)本應(yīng)正確采集并符合檢測(cè)要求標(biāo)本運(yùn)送應(yīng)符合相關(guān)時(shí)間、溫度和生物安全的要求，并進(jìn)行有效監(jiān)控標(biāo)本接收時(shí)有接收時(shí)間和狀態(tài)記錄標(biāo)本拒收原因要明確，并有記錄實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對(duì)標(biāo)本拒收原因進(jìn)行定期分析，有切實(shí)可行的整改措施用于分子病理檢測(cè)的石蠟包埋組織標(biāo)本應(yīng)按要求及時(shí)進(jìn)行切片、脫蠟等處理，新鮮組織標(biāo)本應(yīng)及時(shí)進(jìn)行取材作冰凍切片或切開、固定等處理，穿刺細(xì)胞應(yīng)及時(shí)進(jìn)行制備細(xì)胞蠟塊、切片等處理。標(biāo)本檢測(cè)全過程包括核酸提取、擴(kuò)增、產(chǎn)物分析、保存等應(yīng)能溯源.分子病理檢測(cè)項(xiàng)目在檢測(cè)過程中應(yīng)以病理號(hào)作為原始標(biāo)本、取材標(biāo)本（包埋盒）、蠟塊或切片的唯一性標(biāo)識(shí)標(biāo)本應(yīng)按相關(guān)規(guī)定保存，并進(jìn)行監(jiān)控和記錄標(biāo)本采集時(shí)間1、血清（漿）：無(wú)特殊要求2、如用泌尿生殖道分泌物做CT、NG項(xiàng)目：應(yīng)在抗生素應(yīng)用前或停藥兩周后采集標(biāo)本，如不能停用抗生素，應(yīng)于下次抗生素應(yīng)用前采集。3、如用痰做TB：應(yīng)在抗結(jié)核藥物應(yīng)用前或停藥兩周后采集標(biāo)本，如不能停用抗結(jié)核藥物，應(yīng)于下次抗結(jié)核藥物應(yīng)用前采集。因?yàn)镻CR方法所檢測(cè)的靶物質(zhì)為核酸，不受標(biāo)本生物活性的限制，對(duì)于已經(jīng)死亡的病原體仍可檢測(cè)出來(lái)，即感染后在藥物治療有效的情況下，患處仍會(huì)有少量已死亡的病原體存在。標(biāo)本采集量標(biāo)本的類型和采集量應(yīng)根據(jù)所測(cè)病原體而定。一般來(lái)說，如果樣本的量對(duì)病原體培養(yǎng)夠用的話，則其量亦足以用于核酸提取及其后的擴(kuò)增檢測(cè)。采樣容器采樣所用的抗凝劑及相關(guān)試劑材料不應(yīng)對(duì)核酸擴(kuò)增及檢測(cè)過程造成干擾。如全血、骨髓和血漿標(biāo)本，用EDTA抗凝，不使用肝素，因其是

Taq酶的強(qiáng)抑制劑，且在核酸提取過程中很難完全去除。使用玻璃器皿，必須為密閉的、必須經(jīng)高壓滅菌，以使可能存在的RNase永久性失活。標(biāo)本驗(yàn)收、拒收血液標(biāo)本：溶血、嚴(yán)重脂血等應(yīng)拒收泌尿生殖道分泌物：鏡下觀察到上皮細(xì)胞存在。痰液：鏡下觀察上皮細(xì)胞很少，一般<10個(gè)，白細(xì)胞一般>25個(gè)。標(biāo)本拒收原因分析，采取有效措施予以糾正標(biāo)本運(yùn)送實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)待測(cè)靶核酸的特性，對(duì)各種臨床標(biāo)本的運(yùn)送條件（溫度、時(shí)間）作出相應(yīng)規(guī)定。靶核酸為DNA的標(biāo)本，如在無(wú)菌條件下，則可以在室溫下運(yùn)送，建議采集后8h之內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室；靶核酸為RNA的標(biāo)本，如在無(wú)菌條件下，可在室溫下運(yùn)送，如為較長(zhǎng)時(shí)間，則應(yīng)在加冰條件下運(yùn)送，建議采集后4h之內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室；所有標(biāo)本采集后送至實(shí)驗(yàn)室之前，所有臨床標(biāo)本在采集后送至實(shí)驗(yàn)室前，均應(yīng)放2－8℃臨時(shí)保存。淋病奈瑟菌有自溶的特性，標(biāo)本采集后應(yīng)立即送檢。標(biāo)本保存靶核酸(尤其是RNA)易受核酸酶的作用而迅速降解，因此標(biāo)本的保存對(duì)于核酸擴(kuò)增測(cè)定的有效性極為重要（避免反復(fù)凍融）靶核酸為DNA的標(biāo)本2-8℃保存1-3天，靶核酸為RNA的標(biāo)本應(yīng)－20℃下保存－20℃下保存1個(gè)月－70℃以下可長(zhǎng)期保存如為提取核酸后用于DNA擴(kuò)增分析的樣本，可于10TE緩沖液{mmol/L

Tris,1mmol/L

EDTA(pH7.5～8.0)}2-8℃下保存。用于RNA擴(kuò)增分析的樣本，則應(yīng)于上述

TE緩沖液中-70℃保存。標(biāo)本接收標(biāo)本接收建議在三個(gè)測(cè)定區(qū)之外接收的標(biāo)本應(yīng)收集在原始容器中，不能接受從其他檢測(cè)如生化、免疫檢驗(yàn)等分出來(lái)的標(biāo)本，因其有較大的發(fā)生標(biāo)本間污染的可能性標(biāo)本處理血清（漿）：應(yīng)1小時(shí)內(nèi)分離血清，抗凝后4小時(shí)內(nèi)分離血漿，然后轉(zhuǎn)移至1.5ml滅菌離心管中保存。若血清分離不充分，可1500rpm離心5min

。如甘油三酯含量超過6mmol/L或肉眼可見血清/血漿呈白色渾濁狀的標(biāo)本，應(yīng)4℃13

000rpm離心15min,吸取下層清亮血清或血漿轉(zhuǎn)移至1.5ml滅菌離心管中保存泌尿生殖道分泌物一次性采樣管（含保養(yǎng)液）配套棉拭子（不含保養(yǎng)液）痰液結(jié)核分枝桿菌DNA檢測(cè)標(biāo)本：用4%NaOH搖勻，室溫下放置30分鐘左右液化，轉(zhuǎn)移至1.5ml滅菌離心管，離心，去上清，留沉淀用于核酸提取。需注意的是液化時(shí)不能加熱，液化時(shí)間不能過長(zhǎng)。非結(jié)核分枝桿菌DNA檢測(cè)標(biāo)本：痰標(biāo)本在室溫懸浮于滅菌生理鹽水中，充分震蕩混勻，促使大塊黏狀物下沉，取上清離心，去上清，留沉淀用于核酸提取。切記不能用NaOH液化痰標(biāo)本。分析中質(zhì)量控制對(duì)新項(xiàng)目的性能進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，并有相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)記錄。儀器、試劑、方法更新時(shí)應(yīng)進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，并有記錄。

定量檢測(cè)項(xiàng)目方法學(xué)驗(yàn)證的內(nèi)容至少應(yīng)包括：精密度、正確度、線性范圍（可報(bào)告范圍）、檢出限；

定性檢測(cè)項(xiàng)目方法學(xué)驗(yàn)證的內(nèi)容至少應(yīng)包括：檢出限、精密度、符合率。室內(nèi)質(zhì)量控制目的

監(jiān)測(cè)和控制實(shí)驗(yàn)室常規(guī)工作的精密度，即實(shí)驗(yàn)室測(cè)定的批內(nèi)和批間重復(fù)性IQC結(jié)果決定了實(shí)驗(yàn)室即時(shí)測(cè)定結(jié)果的可靠性和有效性凡出具臨床檢測(cè)報(bào)告的項(xiàng)目均應(yīng)開展室內(nèi)質(zhì)控質(zhì)控品來(lái)源及使用來(lái)源:第三方、試劑盒自帶、自制使用:1)凍干質(zhì)控品復(fù)溶時(shí)，要確保所用溶劑的質(zhì)量2)凍干質(zhì)控品復(fù)溶時(shí)，所加溶劑的量要準(zhǔn)確3)凍干質(zhì)控品復(fù)溶時(shí)應(yīng)輕輕搖勻，切忌劇烈振搖4）避免反復(fù)凍融5）室內(nèi)質(zhì)控應(yīng)監(jiān)控核酸提取、擴(kuò)增、產(chǎn)物分析等標(biāo)本檢測(cè)全過程質(zhì)控品設(shè)置、數(shù)量定性檢測(cè)已知弱陽(yáng)性質(zhì)控樣本（基質(zhì)與待測(cè)標(biāo)本相同）：至少帶1份，監(jiān)測(cè)核酸提取和擴(kuò)增檢測(cè)的有效性已知陰性質(zhì)控樣本（基質(zhì)與待測(cè)標(biāo)本相同）：至少帶1份，判斷核酸提取過程中是否發(fā)生污染(實(shí)驗(yàn)室的以前擴(kuò)增產(chǎn)物的污染、標(biāo)本間的交叉污染、強(qiáng)陽(yáng)性標(biāo)本氣溶膠經(jīng)加樣器導(dǎo)致污染、強(qiáng)陽(yáng)性標(biāo)本經(jīng)操作者手導(dǎo)致污染

翻蓋離心管在較高溫度溫育時(shí)蓋子崩開、擴(kuò)增反應(yīng)試劑的污染定量檢測(cè)已知高、中、低質(zhì)控品（基質(zhì)與待測(cè)標(biāo)本相同）已知陰性質(zhì)控樣本（基質(zhì)與待測(cè)標(biāo)本相同）質(zhì)控品位置室內(nèi)質(zhì)控品在擴(kuò)增儀中的排列順序：不宜固定位置,盡可能監(jiān)測(cè)每一個(gè)孔擴(kuò)增有效性板上雜交和膜上斑點(diǎn)印跡雜交的質(zhì)控：在板上雜交和斑點(diǎn)雜交時(shí)，陽(yáng)性和陰性質(zhì)控應(yīng)該在同一板或膜上與病人標(biāo)本平行進(jìn)行分析，這可排除不同反應(yīng)中因使用不同雜交條件所致的對(duì)結(jié)果的錯(cuò)誤解釋。質(zhì)控品均值建立暫定均值的建立：20d內(nèi)得到20個(gè)數(shù)值，或至少在5d內(nèi)，每天作不少于4次重復(fù)檢測(cè)獲得20個(gè)數(shù)值。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行離群值檢驗(yàn)（剔除超過3s外的數(shù)據(jù)），計(jì)算出均值，作為暫定均值。若使用定值質(zhì)控品，均值必須在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)使用自己現(xiàn)行的測(cè)定方法進(jìn)行確定，質(zhì)控品說明書上的原有標(biāo)定值只能作參考。常規(guī)均值的建立：以最初20個(gè)數(shù)據(jù)和三至五個(gè)月在控?cái)?shù)據(jù)匯集的所有數(shù)據(jù)計(jì)算的累積平均數(shù)作為質(zhì)控品有效期內(nèi)的常規(guī)均值，并以此作為以后室內(nèi)質(zhì)控圖的均值。常用質(zhì)控規(guī)則的符號(hào)及定義符

號(hào)定義12S一個(gè)質(zhì)控測(cè)定值超出±2s控制限。13S22SR4S一個(gè)質(zhì)控測(cè)定值超出±3s控制限。兩個(gè)連續(xù)的質(zhì)控測(cè)定值同時(shí)超出+2s或－2s控制限。同一批測(cè)定中，兩個(gè)不同濃度質(zhì)控物的測(cè)定值之間的差值超出4s控制限。41S四個(gè)連續(xù)的質(zhì)控測(cè)定值同時(shí)超出+1s或－1s控制限。十個(gè)連續(xù)的質(zhì)控測(cè)定值同時(shí)處于均值的同一側(cè)。10X統(tǒng)計(jì)質(zhì)控方法Levey-Jennings質(zhì)控圖方法Levey-Jennings質(zhì)控圖結(jié)合Westgard多規(guī)則質(zhì)控方法“即刻法”質(zhì)控方法Levey-Jennings質(zhì)控圖方法根據(jù)常規(guī)條件下的變異（RCV）計(jì)算中的平均值和SD確定質(zhì)控線，一般以X±2S為告警限，X±3S為失控限，將所得質(zhì)控結(jié)果標(biāo)在一張質(zhì)控圖上，簡(jiǎn)單明了。但如果以X±2S為失控限，假失控概率太高，通常不能接受；以X±3S為失控限假失控概率低，但誤差檢出能力不強(qiáng)。Westgard多規(guī)則控制方法由1

，1

，2

，R

，4

，10

等規(guī)則組成，其中既有對(duì)1S2S3S2S4SXx隨機(jī)誤差檢出敏感的，也有對(duì)系統(tǒng)誤差敏感的。結(jié)合在一起，假失控和假告警概率低，誤差檢出能力增強(qiáng)，大大提高了失控的檢出率。在實(shí)踐中1

、R

規(guī)則常檢出隨機(jī)誤差，而2

、4

和10x質(zhì)控2s3s4s1s規(guī)則檢出系統(tǒng)誤差。1)

12S

為警告規(guī)則，不是失控規(guī)則。若本批檢驗(yàn)沒有出現(xiàn)控制結(jié)果超出控制線，表示本批結(jié)果沒有問題，在控，可以發(fā)出報(bào)告。若本批檢驗(yàn)有1個(gè)控制結(jié)果超出（不包括正好在限值線上的結(jié)果）2S控制線，表示本批結(jié)果可能有問題，符合12S規(guī)則。是一個(gè)警告，但不是失控。12S規(guī)則示意圖+3S+2S+1S均值12S-1S-2S-3S1

2

3

4

5

6

7

8

9

10失控的表現(xiàn)如下：2）1

即這個(gè)控制值不僅超出2S控制線（符合1

規(guī)3S2S則），而且還超出了3S限值（符合13S規(guī)則）。這是在檢驗(yàn)中很少發(fā)生的（概率約為0.3%），是一個(gè)檢出隨機(jī)誤差的失控規(guī)則。13S失控規(guī)則示意圖+3S+2S+1S均值-1S-2S-3S13S失控規(guī)則1

2

3

4

5

6

7

8

9

103）

22S

有兩種表現(xiàn)：同批兩個(gè)控制品結(jié)果同方向超出2S限值。

或同一控制品連續(xù)兩批控制結(jié)果同方向超出2S限值。屬系統(tǒng)誤差失控。22S失控規(guī)則示意圖+3S+2S+1S均值-1S-2S-3S22S失控規(guī)則22S失控規(guī)則1

2

3

4

5

6

7

8

9

104）

R4S

在同一批中兩個(gè)控制結(jié)果差超出4S范圍，其中有一個(gè)超出了+2S限值，另一個(gè)超出了2S限值?；蚱渲幸粋€(gè)超出了＋1.5S，另一個(gè)超出了－2.5S限值屬隨機(jī)誤差過大，為失控。R4S失控規(guī)則示意圖+3S+2S+1S均值-1S-2S-3SR4S失控規(guī)則1

2

3

4

5

6

7

8

9

105）

41S

有兩種表現(xiàn)：

包括出現(xiàn)警告在內(nèi)的這個(gè)超出2S的控制結(jié)果，這個(gè)控制品前3次結(jié)果均和這個(gè)控制結(jié)果在同方向超出+1S或1S范圍。

包括出現(xiàn)警告在內(nèi)的這個(gè)超出2S的控制結(jié)果，這個(gè)控制品前1次結(jié)果，均同方向超出+1S或1S范圍；另一個(gè)控制品的這兩次結(jié)果也是同方向超出+1S或1S范圍。屬系統(tǒng)誤差失控。41S失控規(guī)則示意圖+3S+2S+1S均值-1S-2S-3S41S失控規(guī)則41S失控規(guī)則1

2

3

4

5

6

7

8

9

106）

10

連同出現(xiàn)1

警告的這個(gè)結(jié)果，另外還有兩2SX個(gè)控制品的結(jié)果，在前幾批及本批結(jié)果中，有連續(xù)10次在

X

的一側(cè)。屬系統(tǒng)誤差失控。10失控規(guī)則示意圖X+3S+2S+1S均值-1S-2S-3S10X失控規(guī)則1

2

3

4

5

6

7

8

9

10“即刻法”質(zhì)控方法只要有3個(gè)以上的數(shù)據(jù)即可決定是否有異常值的存在。將連續(xù)的質(zhì)控測(cè)定值按從小到大排列，即x

、x

、x

、x

、3124x

、x

、……x

（x

為最小值，x

為最大值）；56n1n計(jì)算均值和標(biāo)準(zhǔn)差(s);按下述公式計(jì)算SI

和SI

值；上限

下限SI

=（x

－

均值）/s上限最大值SI下限=（均值－

x最小值

）/s將SI

和SI

值與SI值表中的數(shù)值比較。上限

下限SI值表nn3sn2snn3sn2s31.151.491.751.942.102.222.322.412.481.151.461.671.821.942.032.112.182.231213141516171819202.552.612.662.712.752.792.822.852.882.292.3452.372.412.46782.472.502.532.5691011質(zhì)控結(jié)果的判斷SI

和SI

值均<表中n

對(duì)應(yīng)的值時(shí)，說明測(cè)定質(zhì)控測(cè)2s上限下限定值的變化在2s之內(nèi)，是可以接受的。如SI

和SI

值中之一處于n

和n

對(duì)應(yīng)的值之間時(shí)，2s上限下限3s說明該質(zhì)控測(cè)定值的變化在2s～3s之間，處于“告警”狀態(tài)。當(dāng)SI

和SI

值之一>

n

對(duì)應(yīng)的值時(shí)，說明該質(zhì)控測(cè)定3s上限下限值的變化已超出3s，屬“失控”。即刻法優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：對(duì)于檢測(cè)項(xiàng)目開展次數(shù)少的實(shí)驗(yàn)室可進(jìn)行質(zhì)控缺點(diǎn)：繁瑣初始階段的質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)，前3個(gè)質(zhì)控值的CV對(duì)隨后的結(jié)果影響大。臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)室內(nèi)質(zhì)量控制操作前20個(gè)數(shù)據(jù)使用即刻法，可對(duì)第3－20個(gè)數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控判斷第21個(gè)數(shù)據(jù)開始使用常規(guī)質(zhì)控方法進(jìn)行質(zhì)控判斷失控處理及時(shí)查找原因，采取糾正措施填寫失控原因分析報(bào)告相關(guān)負(fù)責(zé)人決定報(bào)告是否可發(fā)放失控原因分析—陽(yáng)性質(zhì)控樣本常見的失控原因核酸提取中的隨機(jī)誤差。如核酸提取中的丟失、有機(jī)溶劑的去除不徹底、標(biāo)本中擴(kuò)增抑制物的殘留等。儀器的問題。如擴(kuò)增儀孔間溫度的不均一性、孔內(nèi)溫度與所示溫度的不一致性等。試劑的問題。如Taq酶和/或逆轉(zhuǎn)錄酶的失活、探針的純度及標(biāo)記效率和核酸提取試劑的效率等。失控原因分析—陰性質(zhì)控樣本的失控原因擴(kuò)增產(chǎn)物的“污染”臨床標(biāo)本的核酸提取過程中發(fā)生的標(biāo)本間的交叉

“污染”.避免基因擴(kuò)增檢驗(yàn)假陽(yáng)性結(jié)果的措施嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室分區(qū)使用帶“濾芯”的吸頭設(shè)立“陰性”質(zhì)控（與標(biāo)本同時(shí)處理）使用防“污染”（含UNG）的PCR試劑臨床“假陽(yáng)性”問題：病原微生物如結(jié)核桿菌經(jīng)藥物治療后已死亡，但PCR仍可為陽(yáng)性，故治療結(jié)束后至少兩周內(nèi)不宜做PCR檢測(cè)。避免基因擴(kuò)增檢驗(yàn)假陰性結(jié)果的措施避免由于來(lái)自于標(biāo)本的血紅蛋白、肝素、某些激素或來(lái)自標(biāo)本處理中的去垢劑、有機(jī)溶劑的抑制作用的措施：純化核酸；標(biāo)本重復(fù)雙份測(cè)定；稀釋標(biāo)本定期對(duì)擴(kuò)增儀的溫度控制和加熱模塊中熱傳導(dǎo)的一致性進(jìn)行檢查和校準(zhǔn)注意事項(xiàng)在試劑準(zhǔn)備區(qū)配置反應(yīng)混合液，先將dNTP、引物、酶和緩沖液混合后，再分裝；配制反應(yīng)體系時(shí)，應(yīng)注意移液器的使用方法，所有的液體都要緩慢加至管底，不要加至管壁，所有液體的混勻要用振蕩器進(jìn)行，不能用移液器吹打，反應(yīng)體系配制完畢后低速離心數(shù)秒，避免產(chǎn)生氣泡分裝的試劑注意冷藏，防止酶試劑失活及有機(jī)大分子降解優(yōu)先選擇含UNG的試劑盒試劑經(jīng)充分溶解后混勻，離心后再開蓋，保持試劑均勻性擴(kuò)增管、樣品處理管及吸頭等實(shí)驗(yàn)用品，均需高壓滅菌標(biāo)本處理應(yīng)在標(biāo)本制備區(qū)生物安全柜內(nèi)進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)前應(yīng)打開風(fēng)機(jī)5-10min，待柜內(nèi)空氣凈化并氣流穩(wěn)定后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作為防止標(biāo)本間交叉污染，在打開離心管前宜短暫離心注意事項(xiàng)吸棄上清提取方法，離心時(shí)應(yīng)注意離心管的方向，吸棄上清時(shí)不要碰到沉淀部分，以免造成提取效率降低。標(biāo)本處理嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行操作，應(yīng)做到處理時(shí)間充分，保證標(biāo)本中的DNA或RNA完全釋放；將提取的核酸加到反應(yīng)體系中后，應(yīng)將純化好的剩余核酸樣本凍存，以免在擴(kuò)增檢測(cè)時(shí)出現(xiàn)意外需要重新檢測(cè)。在結(jié)果確定后再將這些樣本按生物污染廢棄物進(jìn)行處理。擴(kuò)增條件一致的不同檢測(cè)項(xiàng)目同時(shí)擴(kuò)增時(shí)不得使用同一套標(biāo)準(zhǔn)品。擴(kuò)增后的擴(kuò)增管不能在擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū)打開處理，應(yīng)用一次性手套包好遠(yuǎn)離PCR實(shí)驗(yàn)室的洗滌間消毒處理；工作結(jié)束后，必須立即對(duì)各工作區(qū)進(jìn)行清潔結(jié)果判斷在判斷結(jié)果時(shí)，應(yīng)先對(duì)擴(kuò)增的熒光信號(hào)作出定性判斷，然后再進(jìn)行定量分析，避免一些非特異熒光信號(hào)對(duì)結(jié)果分析的干擾?；€值（閾值）設(shè)定：遵從廠商規(guī)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性判斷標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)曲線平滑均勻，斜率、截距和相關(guān)系數(shù)等參數(shù)的數(shù)值允許變化范圍均應(yīng)在試劑制造商推薦的范圍內(nèi)。陰、陽(yáng)室內(nèi)質(zhì)控檢測(cè)結(jié)果均處于在控狀態(tài)。以上幾項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)均達(dá)到要求后，當(dāng)日實(shí)驗(yàn)有效，可以發(fā)放報(bào)告。否則，本次實(shí)驗(yàn)無(wú)效。實(shí)驗(yàn)灰區(qū)標(biāo)本的處理定性測(cè)定中處于實(shí)驗(yàn)灰區(qū)的標(biāo)本應(yīng)重復(fù)檢測(cè)一次，灰區(qū)范圍的確定及結(jié)果報(bào)告應(yīng)遵從各試劑制造商推薦的要求。

復(fù)星CT：38≤Ct值<40為檢測(cè)灰區(qū)，建議重復(fù)檢測(cè)2次。如果檢測(cè)結(jié)果至少1次為Ct<40判斷為陽(yáng)性，否則判為陰性。

達(dá)安CT:

ABI7000：27≤Ct值<30為檢測(cè)灰區(qū)，重復(fù)檢測(cè)1次。如重復(fù)試驗(yàn)Ct值<30判為陽(yáng)性，否則判為陰性。

Roche

LightCycler：37≤Ct<40為檢測(cè)灰區(qū)，重復(fù)檢測(cè)1次。如重復(fù)試驗(yàn)Ct值<40判為陽(yáng)性，否則判為陰性組織標(biāo)本的處理與質(zhì)量控制均應(yīng)該由有經(jīng)驗(yàn)的病理技術(shù)人員和醫(yī)師負(fù)責(zé)。如需要用顯微切割法刮取組織以保證有足量的腫瘤細(xì)胞，應(yīng)由病理醫(yī)師審閱，標(biāo)注出腫瘤細(xì)胞所在區(qū)域必要時(shí)，被檢基因組核酸（DNA和/或RNA）濃度應(yīng)符合制造商規(guī)定的要求擴(kuò)增條件相同的不同檢測(cè)項(xiàng)目擴(kuò)增時(shí)應(yīng)使用各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線室間質(zhì)評(píng)目的:監(jiān)測(cè)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性凡出具臨床檢測(cè)報(bào)告的項(xiàng)目均應(yīng)