上海市臨檢中心 PCR培訓班 臨床基因擴增檢驗質量要求

臨床基因擴增檢驗質量要求上海市臨床檢驗中心肖艷群制定依據(jù)《醫(yī)療機構臨床實驗室管理辦法》（衛(wèi)醫(yī)發(fā)[2006]73號）《醫(yī)療機構臨床基因擴增檢驗實驗室管理辦法》（衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)[2010]194號）醫(yī)學實驗室質量和能力認可準則

ISO15189(CNAS-CL02)醫(yī)學實驗室質量和能力認可準則在基因擴增檢驗領域的應用說明（CNAS-CL36）醫(yī)學實驗室質量和能力認可準則在病理學檢查領域的應用說明（CNAS-CL37）基本內容質量管理體系建立人員實驗室設置、設施和環(huán)境設備、材料與信息系統(tǒng)分析前分析中分析后質量管理體系建立

質量手冊、程序文件、操作規(guī)程、記錄

現(xiàn)行有效

適合自身實際情況

寫你所做的、做你所寫的、記你所做的文件至少應包括組織和人員管理：各類人員的崗位職責、崗位培訓、繼續(xù)教育、定期考核、評估等環(huán)境、設施及安全管理文件或程序儀器、設備采購、驗收、管理、領用及使用的文件或程序檢驗試劑及耗材的采購、驗收、管理、領用及使用樣品的采集、運送、接收、處理及保存檢驗方法的選擇、確認或驗證檢驗項目及儀器設備標準操作程序的建立和管理檢驗結果質量保證檢驗報告管理的規(guī)定：結果的發(fā)放方式、報告的格式和內容、保護患者隱私的規(guī)定記錄的管理：記錄的修改。保存及期限對差錯事故及不符合工作的糾正及預防措施對服務對象投訴處理人員要求

實驗室至少應有2名取得PCR上崗證，并為本單位在職技術人員

實驗室負責人應具有中級或以上專業(yè)技術任職資格

開展遺傳性疾病基因芯片診斷技術或基于組織等分子病理檢測技術并出具診斷報告的實驗室，還應具備至少2名取得《醫(yī)師執(zhí)業(yè)證書》、主治醫(yī)師或以上專業(yè)技術、從事本專業(yè)的本單位在職醫(yī)師

實驗室有培訓制度、計劃，保證其技術人員得到及時培訓，并對培訓效果進行評估

實驗室應定期評審員工的工作能力，保存評審記錄

實驗室應分冊建立技術人員技術檔案，檔案至少應包括以下內容:學歷、職稱、ＰＣＲ上崗證書復印件；培訓、能力評審等資料，并定期更新實驗室設置

原則上應分為四個區(qū)：試劑準備區(qū)、標本制備區(qū)、擴增區(qū)、產(chǎn)物分析區(qū)?

如使用全自動擴增分析儀，后兩區(qū)可合并?

如使用核酸提取、擴增和產(chǎn)物分析一體化的全自動分析系統(tǒng)，后三區(qū)可合并

各區(qū)有獨立的緩沖區(qū)

各區(qū)都有水池

各區(qū)有獨立的通風系統(tǒng)（建議有窗戶的房間為PCR實驗室），

標本制備區(qū)有沖眼器和生物安全柜設施和環(huán)境實驗室有足夠的空間保證：標本處置符合分析前、后樣本分區(qū)放置、儀器放置符合維修和操作要求、打印檢驗報告時交叉污染的控制標本接收區(qū)建議放在四個區(qū)域以外的房間開展基于組織的分子病理項目宜有獨立的切片制備和前處理（脫蠟、水化）區(qū)域設施和環(huán)境進入和使用實驗室各區(qū)域應有明確的限制和措施，防止患者和其他非相關人員的隨意進出各工作區(qū)域應有明確的標記，應按照單一方向進入各工作區(qū)域，不同區(qū)域內的設備、物品不得混用實驗室應規(guī)定環(huán)境溫、濕度的要求，實施監(jiān)控，并有記錄應有指定的經(jīng)過培訓的內務管理人員（如保潔人員），有相應清潔用具，有實驗室清潔和消毒相關的記錄產(chǎn)物分析區(qū)

擴增區(qū)

標本制備區(qū)

試劑準備區(qū)緩沖間基本原則：1、四個區(qū)域必須相互獨立2、各區(qū)不能直通，應有緩沖間3、各區(qū)有獨立通風系統(tǒng)設備、材料與信息系統(tǒng)

使用的儀器、試劑、耗材、輔助品必須符合國家相關規(guī)定。儀器：必須三證齊全試劑：必須CFDA批準

相同檢驗項目在不同儀器或系統(tǒng)上進行檢測時，須對檢驗結果進行比對(

2次/年，每次至少20份標本，計算回歸方程，系統(tǒng)誤差應<7.5%）

應保存主要設備的檔案，檔案內容應包括：設備標識、型號、序號或其它唯一性識別、到貨日期和投入運行日期、目前放置地點、接收時的狀態(tài)、儀器使用說明書或其存放處、證實設備可以使用的設備驗證報告、校準和/或檢定報告、維護、損壞、故障或維修的記錄

應制定各類儀器維護保養(yǎng)，校準/檢定計劃，并有執(zhí)行記錄。儀器校準需校準儀器：溫度計、溫濕度計、移液器、恒溫金屬浴、生物安全柜、高速冷凍離心機、擴增儀、雜交儀、測序儀；開展分子病理項目需校準切片機（包括冰凍切片機）、撈片水浴槽校準單位資質合格的校準/檢定報告校準周期：參照國家計量部門或生產(chǎn)廠商的要求進行，廠家沒有規(guī)定的則每年至少進行一次內部校準的輔助設備，實驗室應根據(jù)國家計量部門或生產(chǎn)廠商的規(guī)定制定內部校準操作規(guī)程和要求，并有內部校準的詳細記錄校準/檢定設備，應貼校準/檢定標識，并標明下次校準/檢定日擴增儀維護：

75%乙醇定期清潔熱蓋和反應槽或孔用無水乙醇清潔光路部分校準：校準單位：廠家校準周期：定期校準、儀器搬動校準參數(shù)：光路部分、背景熒光、溫控部分（溫度準確度、均一性、溫度升降速率）恒溫金屬浴維護：75%乙醇擦拭加熱孔校準：校準單位：廠家、計量院、內部校準溫度準確度（±1℃

）（應涵蓋試驗過程中所涉及的溫度）孔間溫度的均一性（±1℃

）（內部校準應規(guī)定測定孔的選擇、測量時間、各孔溫度偏差允許范圍）移液器維護：

75%乙醇擦拭校準：校準周期、外校（廠家、計量所）、校準量程（應涵蓋試驗過程中所涉及的量程）計量性能要求（容量允許誤差、測量重復性）內部校準-參照《定量、可調移液器試行檢定規(guī)程》(JJG646-2006)注意：環(huán)境的要求計量性能要求（標稱容量、標定點、容量允許誤差、測量重復性）校準點涵蓋試驗過程中所涉及的量程生物安全柜清潔:75%乙醇擦拭,不宜用次氯酸鈉溶液清潔檢定：有資質的第三方檢測機構檢定參數(shù)：高效過濾器完整性、流入氣流流速、下降氣流流速、氣流模式高速冷凍離心機維護保養(yǎng)：75%乙醇擦拭校準：轉速、溫度設備出現(xiàn)故障時處理措施應立即停止使用，并加上明顯標識修復的設備必須經(jīng)校準、檢定（驗證）或檢測滿足要求后方能再次投入使用

可校準的項目實施校準

質控品檢測結果在允許范圍內

與其他儀器的檢測結果比較（5個樣本，覆蓋測量范圍，至少4個樣本測量結果偏移<±7.5%）

使用留樣再測結果進行判別(5個樣本，覆蓋測量范圍，至少4個樣本測量結果偏移<±7.5%）實驗室應檢查由于上述缺陷對以前所進行的檢測工作的影響，并記錄相關分析、處理意見耗材、試劑要求耗材

帶濾芯吸頭、離心管爆管和抑制物質檢試劑盒的質檢

包括外觀質檢和性能質檢選擇或更換試劑品牌：試劑性能驗證更換試劑批號：試劑批間差，應評價核酸提取效率和擴增效率（定量項目至少使用高低兩個臨床樣本，結果在T±0.5范圍內可接受）信息系統(tǒng)建立信息系統(tǒng)管理制度，制訂計算機（辦公用除外）和計算機網(wǎng)絡使用權限、登陸密碼、維護的規(guī)定，有計算機安全保密和病毒防范的要求，并定期備份計算機數(shù)據(jù)，保證信息安全和完整。標本接收、報告發(fā)放分析前質量控制檢驗申請，患者準備，原始樣品采集、運送到實驗室并在實驗室內傳遞標本標本采集時間對擴增檢測結果的影響標本的類型和采集量采樣及運輸容器采樣質量的評價標本采集中的防污染實驗室有各類患者準備、標本采集、運送、接收（或拒收）、保存和安全處置的具體要求和操作規(guī)程標本應正確采集并符合檢測要求標本運送應符合相關時間、溫度和生物安全的要求，并進行有效監(jiān)控標本接收時有接收時間和狀態(tài)記錄標本拒收原因要明確，并有記錄實驗室應對標本拒收原因進行定期分析，有切實可行的整改措施用于分子病理檢測的石蠟包埋組織標本應按要求及時進行切片、脫蠟等處理，新鮮組織標本應及時進行取材作冰凍切片或切開、固定等處理，穿刺細胞應及時進行制備細胞蠟塊、切片等處理。標本檢測全過程包括核酸提取、擴增、產(chǎn)物分析、保存等應能溯源.分子病理檢測項目在檢測過程中應以病理號作為原始標本、取材標本（包埋盒）、蠟塊或切片的唯一性標識標本應按相關規(guī)定保存，并進行監(jiān)控和記錄標本采集時間1、血清（漿）：無特殊要求2、如用泌尿生殖道分泌物做CT、NG項目：應在抗生素應用前或停藥兩周后采集標本，如不能停用抗生素，應于下次抗生素應用前采集。3、如用痰做TB：應在抗結核藥物應用前或停藥兩周后采集標本，如不能停用抗結核藥物，應于下次抗結核藥物應用前采集。因為PCR方法所檢測的靶物質為核酸，不受標本生物活性的限制，對于已經(jīng)死亡的病原體仍可檢測出來，即感染后在藥物治療有效的情況下，患處仍會有少量已死亡的病原體存在。標本采集量標本的類型和采集量應根據(jù)所測病原體而定。一般來說，如果樣本的量對病原體培養(yǎng)夠用的話，則其量亦足以用于核酸提取及其后的擴增檢測。采樣容器采樣所用的抗凝劑及相關試劑材料不應對核酸擴增及檢測過程造成干擾。如全血、骨髓和血漿標本，用EDTA抗凝，不使用肝素，因其是

Taq酶的強抑制劑，且在核酸提取過程中很難完全去除。使用玻璃器皿，必須為密閉的、必須經(jīng)高壓滅菌，以使可能存在的RNase永久性失活。標本驗收、拒收血液標本：溶血、嚴重脂血等應拒收泌尿生殖道分泌物：鏡下觀察到上皮細胞存在。痰液：鏡下觀察上皮細胞很少，一般<10個，白細胞一般>25個。標本拒收原因分析，采取有效措施予以糾正標本運送實驗室應根據(jù)待測靶核酸的特性，對各種臨床標本的運送條件（溫度、時間）作出相應規(guī)定。靶核酸為DNA的標本，如在無菌條件下，則可以在室溫下運送，建議采集后8h之內送至實驗室；靶核酸為RNA的標本，如在無菌條件下，可在室溫下運送，如為較長時間，則應在加冰條件下運送，建議采集后4h之內送至實驗室；所有標本采集后送至實驗室之前，所有臨床標本在采集后送至實驗室前，均應放2－8℃臨時保存。淋病奈瑟菌有自溶的特性，標本采集后應立即送檢。標本保存靶核酸(尤其是RNA)易受核酸酶的作用而迅速降解，因此標本的保存對于核酸擴增測定的有效性極為重要（避免反復凍融）靶核酸為DNA的標本2-8℃保存1-3天，靶核酸為RNA的標本應－20℃下保存－20℃下保存1個月－70℃以下可長期保存如為提取核酸后用于DNA擴增分析的樣本，可于10TE緩沖液{mmol/L

Tris,1mmol/L

EDTA(pH7.5～8.0)}2-8℃下保存。用于RNA擴增分析的樣本，則應于上述

TE緩沖液中-70℃保存。標本接收標本接收建議在三個測定區(qū)之外接收的標本應收集在原始容器中，不能接受從其他檢測如生化、免疫檢驗等分出來的標本，因其有較大的發(fā)生標本間污染的可能性標本處理血清（漿）：應1小時內分離血清，抗凝后4小時內分離血漿，然后轉移至1.5ml滅菌離心管中保存。若血清分離不充分，可1500rpm離心5min

。如甘油三酯含量超過6mmol/L或肉眼可見血清/血漿呈白色渾濁狀的標本，應4℃13

000rpm離心15min,吸取下層清亮血清或血漿轉移至1.5ml滅菌離心管中保存泌尿生殖道分泌物一次性采樣管（含保養(yǎng)液）配套棉拭子（不含保養(yǎng)液）痰液結核分枝桿菌DNA檢測標本：用4%NaOH搖勻，室溫下放置30分鐘左右液化，轉移至1.5ml滅菌離心管，離心，去上清，留沉淀用于核酸提取。需注意的是液化時不能加熱，液化時間不能過長。非結核分枝桿菌DNA檢測標本：痰標本在室溫懸浮于滅菌生理鹽水中，充分震蕩混勻，促使大塊黏狀物下沉，取上清離心，去上清，留沉淀用于核酸提取。切記不能用NaOH液化痰標本。分析中質量控制對新項目的性能進行方法學驗證，并有相應的實驗記錄。儀器、試劑、方法更新時應進行方法學驗證，并有記錄。

定量檢測項目方法學驗證的內容至少應包括：精密度、正確度、線性范圍（可報告范圍）、檢出限；

定性檢測項目方法學驗證的內容至少應包括：檢出限、精密度、符合率。室內質量控制目的

監(jiān)測和控制實驗室常規(guī)工作的精密度，即實驗室測定的批內和批間重復性IQC結果決定了實驗室即時測定結果的可靠性和有效性凡出具臨床檢測報告的項目均應開展室內質控質控品來源及使用來源:第三方、試劑盒自帶、自制使用:1)凍干質控品復溶時，要確保所用溶劑的質量2)凍干質控品復溶時，所加溶劑的量要準確3)凍干質控品復溶時應輕輕搖勻，切忌劇烈振搖4）避免反復凍融5）室內質控應監(jiān)控核酸提取、擴增、產(chǎn)物分析等標本檢測全過程質控品設置、數(shù)量定性檢測已知弱陽性質控樣本（基質與待測標本相同）：至少帶1份，監(jiān)測核酸提取和擴增檢測的有效性已知陰性質控樣本（基質與待測標本相同）：至少帶1份，判斷核酸提取過程中是否發(fā)生污染(實驗室的以前擴增產(chǎn)物的污染、標本間的交叉污染、強陽性標本氣溶膠經(jīng)加樣器導致污染、強陽性標本經(jīng)操作者手導致污染

翻蓋離心管在較高溫度溫育時蓋子崩開、擴增反應試劑的污染定量檢測已知高、中、低質控品（基質與待測標本相同）已知陰性質控樣本（基質與待測標本相同）質控品位置室內質控品在擴增儀中的排列順序：不宜固定位置,盡可能監(jiān)測每一個孔擴增有效性板上雜交和膜上斑點印跡雜交的質控：在板上雜交和斑點雜交時，陽性和陰性質控應該在同一板或膜上與病人標本平行進行分析，這可排除不同反應中因使用不同雜交條件所致的對結果的錯誤解釋。質控品均值建立暫定均值的建立：20d內得到20個數(shù)值，或至少在5d內，每天作不少于4次重復檢測獲得20個數(shù)值。對數(shù)據(jù)進行離群值檢驗（剔除超過3s外的數(shù)據(jù)），計算出均值，作為暫定均值。若使用定值質控品，均值必須在實驗室內使用自己現(xiàn)行的測定方法進行確定，質控品說明書上的原有標定值只能作參考。常規(guī)均值的建立：以最初20個數(shù)據(jù)和三至五個月在控數(shù)據(jù)匯集的所有數(shù)據(jù)計算的累積平均數(shù)作為質控品有效期內的常規(guī)均值，并以此作為以后室內質控圖的均值。常用質控規(guī)則的符號及定義符

號定義12S一個質控測定值超出±2s控制限。13S22SR4S一個質控測定值超出±3s控制限。兩個連續(xù)的質控測定值同時超出+2s或－2s控制限。同一批測定中，兩個不同濃度質控物的測定值之間的差值超出4s控制限。41S四個連續(xù)的質控測定值同時超出+1s或－1s控制限。十個連續(xù)的質控測定值同時處于均值的同一側。10X統(tǒng)計質控方法Levey-Jennings質控圖方法Levey-Jennings質控圖結合Westgard多規(guī)則質控方法“即刻法”質控方法Levey-Jennings質控圖方法根據(jù)常規(guī)條件下的變異（RCV）計算中的平均值和SD確定質控線，一般以X±2S為告警限，X±3S為失控限，將所得質控結果標在一張質控圖上，簡單明了。但如果以X±2S為失控限，假失控概率太高，通常不能接受；以X±3S為失控限假失控概率低，但誤差檢出能力不強。Westgard多規(guī)則控制方法由1

，1

，2

，R

，4

，10

等規(guī)則組成，其中既有對1S2S3S2S4SXx隨機誤差檢出敏感的，也有對系統(tǒng)誤差敏感的。結合在一起，假失控和假告警概率低，誤差檢出能力增強，大大提高了失控的檢出率。在實踐中1

、R

規(guī)則常檢出隨機誤差，而2

、4

和10x質控2s3s4s1s規(guī)則檢出系統(tǒng)誤差。1)

12S

為警告規(guī)則，不是失控規(guī)則。若本批檢驗沒有出現(xiàn)控制結果超出控制線，表示本批結果沒有問題，在控，可以發(fā)出報告。若本批檢驗有1個控制結果超出（不包括正好在限值線上的結果）2S控制線，表示本批結果可能有問題，符合12S規(guī)則。是一個警告，但不是失控。12S規(guī)則示意圖+3S+2S+1S均值12S-1S-2S-3S1

2

3

4

5

6

7

8

9

10失控的表現(xiàn)如下：2）1

即這個控制值不僅超出2S控制線（符合1

規(guī)3S2S則），而且還超出了3S限值（符合13S規(guī)則）。這是在檢驗中很少發(fā)生的（概率約為0.3%），是一個檢出隨機誤差的失控規(guī)則。13S失控規(guī)則示意圖+3S+2S+1S均值-1S-2S-3S13S失控規(guī)則1

2

3

4

5

6

7

8

9

103）

22S

有兩種表現(xiàn)：同批兩個控制品結果同方向超出2S限值。

或同一控制品連續(xù)兩批控制結果同方向超出2S限值。屬系統(tǒng)誤差失控。22S失控規(guī)則示意圖+3S+2S+1S均值-1S-2S-3S22S失控規(guī)則22S失控規(guī)則1

2

3

4

5

6

7

8

9

104）

R4S

在同一批中兩個控制結果差超出4S范圍，其中有一個超出了+2S限值，另一個超出了2S限值?；蚱渲幸粋€超出了＋1.5S，另一個超出了－2.5S限值屬隨機誤差過大，為失控。R4S失控規(guī)則示意圖+3S+2S+1S均值-1S-2S-3SR4S失控規(guī)則1

2

3

4

5

6

7

8

9

105）

41S

有兩種表現(xiàn)：

包括出現(xiàn)警告在內的這個超出2S的控制結果，這個控制品前3次結果均和這個控制結果在同方向超出+1S或1S范圍。

包括出現(xiàn)警告在內的這個超出2S的控制結果，這個控制品前1次結果，均同方向超出+1S或1S范圍；另一個控制品的這兩次結果也是同方向超出+1S或1S范圍。屬系統(tǒng)誤差失控。41S失控規(guī)則示意圖+3S+2S+1S均值-1S-2S-3S41S失控規(guī)則41S失控規(guī)則1

2

3

4

5

6

7

8

9

106）

10

連同出現(xiàn)1

警告的這個結果，另外還有兩2SX個控制品的結果，在前幾批及本批結果中，有連續(xù)10次在

X

的一側。屬系統(tǒng)誤差失控。10失控規(guī)則示意圖X+3S+2S+1S均值-1S-2S-3S10X失控規(guī)則1

2

3

4

5

6

7

8

9

10“即刻法”質控方法只要有3個以上的數(shù)據(jù)即可決定是否有異常值的存在。將連續(xù)的質控測定值按從小到大排列，即x

、x

、x

、x

、3124x

、x

、……x

（x

為最小值，x

為最大值）；56n1n計算均值和標準差(s);按下述公式計算SI

和SI

值；上限

下限SI

=（x

－

均值）/s上限最大值SI下限=（均值－

x最小值

）/s將SI

和SI

值與SI值表中的數(shù)值比較。上限

下限SI值表nn3sn2snn3sn2s31.151.491.751.942.102.222.322.412.481.151.461.671.821.942.032.112.182.231213141516171819202.552.612.662.712.752.792.822.852.882.292.3452.372.412.46782.472.502.532.5691011質控結果的判斷SI

和SI

值均<表中n

對應的值時，說明測定質控測2s上限下限定值的變化在2s之內，是可以接受的。如SI

和SI

值中之一處于n

和n

對應的值之間時，2s上限下限3s說明該質控測定值的變化在2s～3s之間，處于“告警”狀態(tài)。當SI

和SI

值之一>

n

對應的值時，說明該質控測定3s上限下限值的變化已超出3s，屬“失控”。即刻法優(yōu)缺點優(yōu)點：對于檢測項目開展次數(shù)少的實驗室可進行質控缺點：繁瑣初始階段的質控數(shù)據(jù)，前3個質控值的CV對隨后的結果影響大。臨床基因擴增檢驗室內質量控制操作前20個數(shù)據(jù)使用即刻法，可對第3－20個數(shù)據(jù)進行質控判斷第21個數(shù)據(jù)開始使用常規(guī)質控方法進行質控判斷失控處理及時查找原因，采取糾正措施填寫失控原因分析報告相關負責人決定報告是否可發(fā)放失控原因分析—陽性質控樣本常見的失控原因核酸提取中的隨機誤差。如核酸提取中的丟失、有機溶劑的去除不徹底、標本中擴增抑制物的殘留等。儀器的問題。如擴增儀孔間溫度的不均一性、孔內溫度與所示溫度的不一致性等。試劑的問題。如Taq酶和/或逆轉錄酶的失活、探針的純度及標記效率和核酸提取試劑的效率等。失控原因分析—陰性質控樣本的失控原因擴增產(chǎn)物的“污染”臨床標本的核酸提取過程中發(fā)生的標本間的交叉

“污染”.避免基因擴增檢驗假陽性結果的措施嚴格的實驗室分區(qū)使用帶“濾芯”的吸頭設立“陰性”質控（與標本同時處理）使用防“污染”（含UNG）的PCR試劑臨床“假陽性”問題：病原微生物如結核桿菌經(jīng)藥物治療后已死亡，但PCR仍可為陽性，故治療結束后至少兩周內不宜做PCR檢測。避免基因擴增檢驗假陰性結果的措施避免由于來自于標本的血紅蛋白、肝素、某些激素或來自標本處理中的去垢劑、有機溶劑的抑制作用的措施：純化核酸；標本重復雙份測定；稀釋標本定期對擴增儀的溫度控制和加熱模塊中熱傳導的一致性進行檢查和校準注意事項在試劑準備區(qū)配置反應混合液，先將dNTP、引物、酶和緩沖液混合后，再分裝；配制反應體系時，應注意移液器的使用方法，所有的液體都要緩慢加至管底，不要加至管壁，所有液體的混勻要用振蕩器進行，不能用移液器吹打，反應體系配制完畢后低速離心數(shù)秒，避免產(chǎn)生氣泡分裝的試劑注意冷藏，防止酶試劑失活及有機大分子降解優(yōu)先選擇含UNG的試劑盒試劑經(jīng)充分溶解后混勻，離心后再開蓋，保持試劑均勻性擴增管、樣品處理管及吸頭等實驗用品，均需高壓滅菌標本處理應在標本制備區(qū)生物安全柜內進行，實驗前應打開風機5-10min，待柜內空氣凈化并氣流穩(wěn)定后再進行實驗操作為防止標本間交叉污染，在打開離心管前宜短暫離心注意事項吸棄上清提取方法，離心時應注意離心管的方向，吸棄上清時不要碰到沉淀部分，以免造成提取效率降低。標本處理嚴格按照試劑說明書進行操作，應做到處理時間充分，保證標本中的DNA或RNA完全釋放；將提取的核酸加到反應體系中后，應將純化好的剩余核酸樣本凍存，以免在擴增檢測時出現(xiàn)意外需要重新檢測。在結果確定后再將這些樣本按生物污染廢棄物進行處理。擴增條件一致的不同檢測項目同時擴增時不得使用同一套標準品。擴增后的擴增管不能在擴增及產(chǎn)物分析區(qū)打開處理，應用一次性手套包好遠離PCR實驗室的洗滌間消毒處理；工作結束后，必須立即對各工作區(qū)進行清潔結果判斷在判斷結果時，應先對擴增的熒光信號作出定性判斷，然后再進行定量分析，避免一些非特異熒光信號對結果分析的干擾?；€值（閾值）設定：遵從廠商規(guī)定實驗結果有效性判斷標準標準曲線平滑均勻，斜率、截距和相關系數(shù)等參數(shù)的數(shù)值允許變化范圍均應在試劑制造商推薦的范圍內。陰、陽室內質控檢測結果均處于在控狀態(tài)。以上幾項標準均達到要求后，當日實驗有效，可以發(fā)放報告。否則，本次實驗無效。實驗灰區(qū)標本的處理定性測定中處于實驗灰區(qū)的標本應重復檢測一次，灰區(qū)范圍的確定及結果報告應遵從各試劑制造商推薦的要求。

復星CT：38≤Ct值<40為檢測灰區(qū)，建議重復檢測2次。如果檢測結果至少1次為Ct<40判斷為陽性，否則判為陰性。

達安CT:

ABI7000：27≤Ct值<30為檢測灰區(qū)，重復檢測1次。如重復試驗Ct值<30判為陽性，否則判為陰性。

Roche

LightCycler：37≤Ct<40為檢測灰區(qū)，重復檢測1次。如重復試驗Ct值<40判為陽性，否則判為陰性組織標本的處理與質量控制均應該由有經(jīng)驗的病理技術人員和醫(yī)師負責。如需要用顯微切割法刮取組織以保證有足量的腫瘤細胞，應由病理醫(yī)師審閱，標注出腫瘤細胞所在區(qū)域必要時，被檢基因組核酸（DNA和/或RNA）濃度應符合制造商規(guī)定的要求擴增條件相同的不同檢測項目擴增時應使用各自的標準曲線室間質評目的:監(jiān)測檢測結果的準確性凡出具臨床檢測報告的項目均應