第八章環(huán)境毒理學常用研究方法演示

（優(yōu)選）第八章環(huán)境毒理學常用研究方法目前一頁\總數(shù)七十頁\編于十八點毒理學研究方法體內實驗invivotests體外實驗invitrotests(1)流行病調查/臨床觀察(2)動物實驗目前二頁\總數(shù)七十頁\編于十八點第一節(jié)實驗準備1.1動物的準備①選擇實驗動物②編號與標記③固定與麻醉目前三頁\總數(shù)七十頁\編于十八點（1）選擇實驗動物黏膜刺激高血壓目前四頁\總數(shù)七十頁\編于十八點1）種屬的選擇原則在機體反應上與人體近似易獲得、易飼養(yǎng)、易管理敏感、合適－實驗資料目前五頁\總數(shù)七十頁\編于十八點目前六頁\總數(shù)七十頁\編于十八點大鼠－致癌豚鼠－過敏反應目前七頁\總數(shù)七十頁\編于十八點常用動物介紹①貓氣體、蒸氣對黏膜的刺激②豚鼠或兔皮膚③豚鼠過敏性反應④貓、狗、兔嘔吐⑤兔和貓體溫⑦狗、兔、大鼠血壓⑧大鼠和小鼠致癌⑨小鼠慢性中毒對臟器的損害目前八頁\總數(shù)七十頁\編于十八點2）個體選擇①年齡：幼年>成年，急性實驗－成年②性別：無特殊要求就雌雄各半③生理狀態(tài)：如懷孕、哺乳④健康狀態(tài)：檢查、預檢目前九頁\總數(shù)七十頁\編于十八點（2）實驗動物的標記編號染色、烙印、號牌大動物：記錄外表和毛色目前十頁\總數(shù)七十頁\編于十八點（3）實驗動物的捕捉及固定做好防護戴厚手套用器具固定目前十一頁\總數(shù)七十頁\編于十八點目前十二頁\總數(shù)七十頁\編于十八點目前十三頁\總數(shù)七十頁\編于十八點目前十四頁\總數(shù)七十頁\編于十八點目前十五頁\總數(shù)七十頁\編于十八點（4）實驗動物的隨機分組分2組：任意從隨機數(shù)字表的某一行某一數(shù)字開始抄錄14個數(shù)

再抄錄一個數(shù)字為78，因為歸入A組的小鼠有8只，故以8除，得余數(shù)6。于是把第6個A（即編寫為第12號的小鼠）劃給B組

目前十六頁\總數(shù)七十頁\編于十八點分3組：再取一個隨機數(shù)除以6，看余數(shù)目前十七頁\總數(shù)七十頁\編于十八點（5）實驗動物的麻醉動外科手術避免劇烈掙扎麻醉藥物：乙醚目前十八頁\總數(shù)七十頁\編于十八點（1）全身麻醉a）吸入法：開放法、封閉法－揮發(fā)性b）腹腔和靜脈給藥麻醉法－非揮發(fā)性（2）局部麻醉a）貓：一般應用0.5-1.0%鹽酸普魯卡因注射。粘膜表面麻醉宜用2%鹽酸可卡因b）兔在眼球手術時，可于結膜囊滴入0.02%鹽酸可卡因溶液，數(shù)秒鐘即可出現(xiàn)麻醉c）狗：用0.5-1%鹽酸普魯卡因注射。眼鼻、咽喉表面麻醉可用2%鹽酸可卡因目前十九頁\總數(shù)七十頁\編于十八點目前二十頁\總數(shù)七十頁\編于十八點麻醉注意事項（1）靜脈注射必須緩慢，同時觀察肌肉緊張性、角膜反射和對皮膚夾捏的反應。當這些活動明顯減弱或消失時，立即停止注射。配制的藥液濃度要適中。（2）麻醉時需注意保溫。麻醉期間，動物的體溫調節(jié)機能往往受到抑制，出現(xiàn)體溫下降。保溫的方法有：實驗桌內裝燈，電褥，臺燈照射等。無論用哪種方法加溫都應根據(jù)動物的肛門體溫而定。（3）慢性實驗時，在寒冷冬季，麻醉劑在注射前應加熱至動物體溫水平。目前二十一頁\總數(shù)七十頁\編于十八點1.2毒物的準備（1）了解毒物的物理常數(shù)

密度、溶解度、蒸汽壓、熔點、沸點、油/水分配系數(shù)等（2）劑型：

毒性高、刺激性大－稀釋固態(tài)－溶液、軟膏目前二十二頁\總數(shù)七十頁\編于十八點（3）溶劑：①本身毒性很小或無毒②不與受檢毒物產生增毒或減毒作用③不影響毒物吸收④無特殊的刺激性或氣味目前二十三頁\總數(shù)七十頁\編于十八點1.3生物材料的采集和制備（1）血液的采集需求少刺破組織取毛細血管的血需求多靜脈采血、動脈注意：光線、溫度、器皿消毒、抗凝劑目前二十四頁\總數(shù)七十頁\編于十八點割（剪）尾取血眼眶靜脈叢采血斷頭取血頸動脈取血腹主動脈股動（靜）脈取血目前二十五頁\總數(shù)七十頁\編于十八點目前二十六頁\總數(shù)七十頁\編于十八點目前二十七頁\總數(shù)七十頁\編于十八點（2）尿液的收集連續(xù)收集在代謝籠下配置糞尿分離漏斗一次性尿液收集逼尿法、導尿法、輸尿管插管法剖腹采集尿液、提鼠采集尿液

目前二十八頁\總數(shù)七十頁\編于十八點目前二十九頁\總數(shù)七十頁\編于十八點尿液收集注意事項實驗期間膳食一致，特定時間完成收集防止尿液的污染標本迅速測定或冷凍保存避免器皿污染灌喂水或青菜滿足尿量需求目前三十頁\總數(shù)七十頁\編于十八點（3）糞便的收集代謝籠、糞尿分離器外觀形態(tài)新鮮、完整，分析時取內層糞便器皿干凈目前三十一頁\總數(shù)七十頁\編于十八點（4）呼出氣的收集研究毒物的吸收代謝和對肺功能的影響動物需固定目前三十二頁\總數(shù)七十頁\編于十八點（5）組織勻漿的制備酶：取樣－洗凈－研磨－離心－測定用于毒物的測定目前三十三頁\總數(shù)七十頁\編于十八點1.4預備試驗（1）選擇合適的實驗動物（2）設計染毒劑量及其分組（3）操作技術的檢驗和訓練（4）發(fā)現(xiàn)新線索、新指標目前三十四頁\總數(shù)七十頁\編于十八點第二節(jié)常用染毒技術2.常用染毒途徑吸入染毒、經皮膚染毒－最重要的灌胃氣管注入注射（腹腔、靜脈、肌內、皮下）目前三十五頁\總數(shù)七十頁\編于十八點根據(jù)實驗目的進行選擇，同時考慮：（1）人群接觸環(huán)境毒物的實際情況生產車間－呼吸道（2）毒物的理化性質固態(tài)、液態(tài)、氣態(tài)（3）受檢毒物的來源消耗量的大小目前三十六頁\總數(shù)七十頁\編于十八點2.1吸入染毒法－大氣污染物1）動式吸入染毒法優(yōu)點：①柜內毒物濃度相對穩(wěn)定②受試環(huán)境具有持久的穩(wěn)定性缺點：①毒物消耗量大目前三十七頁\總數(shù)七十頁\編于十八點2）靜式吸入染毒法－急性在具有一定氣體容積的密閉容器中或在密封染毒柜內進行優(yōu)點：設備簡單，操作方便缺點：要經過一段時間才能達到實驗濃度要求目前三十八頁\總數(shù)七十頁\編于十八點3）面罩染毒法優(yōu)點：避免皮膚吸收注意檢查面罩的密封性4）吸入染塵法顆粒污染物<5μm目前三十九頁\總數(shù)七十頁\編于十八點2.2氣管注入法經喉插入法氣管穿刺法暴露氣管穿刺法①適用于顆粒物染毒。②顆粒物可制備成生理鹽水混懸液，也可將顆粒物中的有害成分提取，再用提取物進行染毒。③此法需在動物麻醉下進行，難度較大，適宜急性試驗

目前四十頁\總數(shù)七十頁\編于十八點2.3經口染毒法不揮發(fā)性液體和固體毒物灌胃法－液體或制劑喂飼法－混在食物中經口滴入－淀粉糊劑吞咽－膠囊目前四十一頁\總數(shù)七十頁\編于十八點2.4注射染毒法毒物對局部損害不能太大①腹腔注射②肌內注射

不溶于水但溶于油或其他溶劑③靜脈注射④皮下注射⑤皮內注射目前四十二頁\總數(shù)七十頁\編于十八點目前四十三頁\總數(shù)七十頁\編于十八點2.5經皮染毒法家兔和豚鼠斑貼法兔耳法結膜囊染毒目前四十四頁\總數(shù)七十頁\編于十八點第三節(jié)毒理學實驗的設計方法3.1實驗設計明確實驗目的、了解毒物、預備實驗實驗類型（急性、慢性）、實驗動物染毒方式、濃度分組、對照組（平行、自身）3.2動物分組隨機化目前四十五頁\總數(shù)七十頁\編于十八點第四節(jié)急性毒性實驗4.1急性毒性實驗的內容①急性毒性測定－LD50/LC50②皮膚染毒實驗－經皮膚進入③局部作用實驗－有無刺激腐蝕④中毒癥狀的觀察－作用程度、部位⑤功能及病理組織學檢查－部位、程度目前四十六頁\總數(shù)七十頁\編于十八點4.2哺乳動物的急性毒性實驗一、半致死劑量的測定（途徑？）（1）動物準備(小動物、預觀察)（2）劑量選擇（3）藥液配置及染毒－等容量法（4）癥狀觀察（5）病理學檢查及其他指標觀察（6）結果評價－LD50、毒性級別目前四十七頁\總數(shù)七十頁\編于十八點劑量的選擇①預實驗測定：最大無作用劑量、100％死亡劑量②按等比級數(shù)（<2.2,一般1.2~1.5）間距設計濃度系列，系列濃度中有一個的死亡率為40～60％為最佳目前四十八頁\總數(shù)七十頁\編于十八點二、急性閾劑量的測定關鍵：選定適當?shù)挠^測指標機理—肝腎、有機磷農藥—膽堿酯酶新化學物質—整體狀態(tài)、非特異性指標實驗方法游泳試驗、刺激閾試驗目前四十九頁\總數(shù)七十頁\編于十八點三、局部作用試驗皮膚和黏膜癥狀（豚鼠、家兔）急性皮膚刺激/腐蝕試驗急性眼刺激/腐蝕試驗

結膜囊染毒目前五十頁\總數(shù)七十頁\編于十八點四、急性聯(lián)合毒性的測定過篩試驗確定大概的作用類型1/2LD50

①死亡率>80%，增毒；30％～80％，相加；<30％，拮抗②實測死亡率（O）/預期死亡率（P）目前五十一頁\總數(shù)七十頁\編于十八點混合毒物LD50的測定方法①分別測定各毒物的LD50②按等毒性比例混合測定混合毒物的LD50③評定作用類型K<0.4拮抗；0.4<K<2.5相加；K>2.5協(xié)同目前五十二頁\總數(shù)七十頁\編于十八點4.3水生動物毒性實驗一、魚類毒性實驗動物選擇—區(qū)域代表性實驗條件—水溫、溶氧、pH二、甲殼動物實驗水蚤幼蟲的準備TLm的測定目前五十三頁\總數(shù)七十頁\編于十八點斑馬魚青鳉魚目前五十四頁\總數(shù)七十頁\編于十八點第五節(jié)毒物蓄積的研究方法蓄積毒性作用：物質蓄積：環(huán)境污染物進入>排出功能蓄積：結構和功能變化的積累慢性、亞慢性實驗必須先評價蓄積性目前五十五頁\總數(shù)七十頁\編于十八點5.1物質蓄積的研究方法生物蓄積的極限值與其在單位時間內的吸收量成正比生物半衰期越短，達到極限所需時間就短A=a×T1/2×1.44目前五十六頁\總數(shù)七十頁\編于十八點5.2功能蓄積的研究方法K=

ED50(n)

ED50(1)

①固定劑量連續(xù)染毒法；>5LD50，蓄積作用不明顯②劑量定期遞增染毒法（等比遞增）③20天蓄積實驗法－停藥7天內死亡情況目前五十七頁\總數(shù)七十頁\編于十八點LD50K>5,輕度蓄積目前五十八頁\總數(shù)七十頁\編于十八點5.3蓄積率的測定方法蓄積率＝×100％預給劑量對照組LD50-預給組LD50蓄積量＝對照組LD50－預給組LD50目前五十九頁\總數(shù)七十頁\編于十八點第六節(jié)亞慢性和慢性毒性實驗必須先做蓄積實驗判斷可能性6.1亞慢性毒性實驗(1/30～1/20)①動物要求敏感、兩種（嚙齒類、非嚙齒類）

健康、年幼②劑量（高、中、低）一般取LD50的1/80～1/50，每天定時染毒，劑量相等③觀察指標一般指標、生化指標、病理學檢查目前六十頁\總數(shù)七十頁\編于十八點6.2慢性毒性實驗實驗時間一般要求1～2年或者終生染毒一般要求選用幾種動物，年齡要小設3～4個劑量組和一個對照組LD50的1/1000～1/20之間取3～4個劑量注意事項：指標提前觀察、同步進行、注意異常情況、延長飼養(yǎng)時間繼續(xù)觀察目前六十一頁\總數(shù)七十頁\編于十八點第七節(jié)致癌性實驗7.1長期動物實驗①實驗動物的選擇：抗病力強、容易飼養(yǎng)、腫瘤自發(fā)率低、壽命長、對受試物敏感。兩種或以上動物②動物數(shù)目：小型動物50只；大型減少③劑量分組與對照（陰性、陽性對照）：

高劑量（加速致癌）、低劑量（接近人類）目前六十二頁\總數(shù)七十頁\編于十八點④染毒途徑：口、皮膚、注射⑤實驗時間：動物生命期的1/3～1/2⑥指標觀測：外表、行為、X射線、病理學檢查⑦結果評判：

潛伏期：第一例病理學檢查：惡性、良性、癌前期變陽性結果的判斷：腫瘤數(shù)、潛伏期短目前六十三頁\總數(shù)七十頁\編于十八點7.2短期篩檢方法Ames實驗：外源化學物致突變作用DNA修復測定：3H-Tdr哺乳動物細胞的體外惡性轉化目前六十四頁\總數(shù)七十頁\編于十八點Ames試驗組氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株（His-）