核酶的作用方式與研究技術(shù)進(jìn)展

關(guān)于核酶的作用方式與研究技術(shù)進(jìn)展第1頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月主要內(nèi)容核酶的定義及概述核酶產(chǎn)生的背景核酶的種類核酶的催化機(jī)制核酶的研究方法核酶的應(yīng)用前景和挑戰(zhàn)參考文獻(xiàn)第2頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月核酶的定義及概述核酶(ribozyme)最初被定義為一類具有催化活性的RNA，即化學(xué)本質(zhì)是核糖核酸(RNA)，卻具有酶的催化功能。核酶的作用底物可以是不同的分子，有些作用底物就是同一RNA分子中的某些部位。核酶的功能很多，有的能夠切割RNA，有的能夠切割DNA，有些還具有RNA連接酶、磷酸酶等活性?？傊?，核酶的化學(xué)本質(zhì)與由蛋白質(zhì)構(gòu)成的酶完全是不同的。但是，核酶與酶具有很相似的催化特性，并且與蛋白質(zhì)酶相比，核酶的催化效率較低，是一種較為原始的催化酶。第3頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月隨著生物學(xué)的發(fā)展，核酶不僅僅只是包括RNA，如今人們還人工合成了一些DNA也具有催化活性。所以現(xiàn)在的核酶應(yīng)該包括催化性DNA和催化性RNA兩大類，即：具有催化功能的RNA稱為酶性RNA，又稱核酶(ribozyme，Rz)；具有催化功能的DNA稱為酶性DNA，又稱脫氧核酶(deoxyribozyme，DRz)，兩者統(tǒng)稱核酶(nucleozyme)。第4頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月核酶產(chǎn)生的背景核酶的發(fā)現(xiàn)，不僅顛覆了酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)這一概念，還引出了“RNA世界”的假說。該假說認(rèn)為RNA在生命進(jìn)化的早期階段具有非常重要的作用。20世紀(jì)80年代初，由美國(guó)科羅拉多大學(xué)托馬斯·切赫（ThomasCech）等在研究四膜蟲rRNA前體中發(fā)現(xiàn)了與蛋白質(zhì)無關(guān)的拼接過程，即在鳥苷和Mg2+存在下發(fā)生的自我催化作用，可將rRNA前體中存在的鏈長(zhǎng)414個(gè)核苷酸的內(nèi)含子切下。這一段切下來的L19RNA具有很強(qiáng)的酶活性，它既能使核苷酸聚合成多核苷酸，又能將多核苷酸切成不同長(zhǎng)度的片斷，因此將這一L19RNA片斷稱為酶性RNA，又稱核酶(ribozyme)，它集信息和催化功能于一身，由此提出了核酶的概念；第5頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月時(shí)隔不久，耶魯大學(xué)的Altman在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了RNaseP，該加工酶RNaseP(由蛋白質(zhì)和RNA組成的復(fù)合物，催化切除tRNA前體的5‘端冗長(zhǎng)序列，故也叫tRNA5’-成熟酶)中的RNA(絕對(duì)不含蛋白質(zhì))，在特定條件下，具有與RNaseP全酶相同的催化活性，即單獨(dú)RNaseP-RNA能使tRNA的5‘端成熟；Cech和Altman于1989年共同獲得了諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)；1995年~1996年澳大利亞Symons實(shí)驗(yàn)室在研究擬病毒等的復(fù)制機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)，通過滾環(huán)復(fù)制生成復(fù)制單體是自動(dòng)進(jìn)行的，因?yàn)樗鼈兙哂心艽呋晕壹羟校╯elf-cleavage）的“錘頭結(jié)構(gòu)”；2000年研究證明核糖體也是核酶，具有肽基轉(zhuǎn)移酶的功能。第6頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月核酶的種類具有催化功能的RNA稱為酶性RNA，又稱核酶(ribozyme，Rz)；具有催化功能的DNA稱為酶性DNA，又稱脫氧核酶(deoxyribozyme，DRz)。第7頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月1.核酶(ribozyme，Rz)Rz廣泛存在于由低等到高等的多種生物中，參與細(xì)胞內(nèi)RNA及其前體的加工和成熟過程。目前人們已發(fā)現(xiàn)了七大類自然存在的核酶，即第一類內(nèi)含子（group1intron）、第二類內(nèi)含子（group2intron)、RNaseP亞基（RNAsubunitofRNaseP）、錘頭型核酶（hammerheadribozyme）、發(fā)夾型核酶（hairpinribozyme）、肝炎?病毒（hepatitisdeltavirus,HDV）核酶、和VS核酶（Neurosporavarkudsatelliteribozyme）。第8頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月根據(jù)分子大小，可將它們分成大分子核酶（包括第一類內(nèi)含子、第二類內(nèi)含子和RNaseP的RNA亞基）和小分子核酶（錘頭型核酶、發(fā)夾型核酶、肝炎?病毒和VS核酶）。自然界中的Rz多在分子內(nèi)起作用(除RNaseP和核糖體外)，即Rz的活性區(qū)域與作用底物序列在同一條鏈上，其底物主要是帶有磷酸二酯鍵的核酸（非核酸底物的Rz自然界是否存在仍無定論）。第9頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月1.1大分子核酶大分子核酶又分為第1類內(nèi)含子、第2類內(nèi)含子和核糖核酸酶P（RNaseP）的RNA亞基等3種，它們都是由幾百個(gè)核苷酸組成的結(jié)構(gòu)復(fù)雜的大分子。大分子核酶可以看成是金屬酶，其催化作用與金屬離子尤其是二價(jià)離子密不可分，這些金屬離子或者作為廣義酸堿，或者作為路易斯酸堿催化內(nèi)含子的剪接。第10頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月第一類內(nèi)含子

存在于各類生物的細(xì)胞器基因和核基因中，甚至在噬菌體中也有發(fā)現(xiàn)。其代表分子有：四膜蟲mRNA前體，藻類線粒體mRNA和tRNA前體，玉米及豆類葉綠體rRNA前體，T4噬菌體胸腺嘧啶合成酶轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。其中纖毛原生動(dòng)物四膜蟲（

trahymena）的大rRNA前體的剪接機(jī)制很早就已經(jīng)相當(dāng)清楚，從而成為第一類內(nèi)含子剪接機(jī)制的模型。第11頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月固氮弧菌屬中第一類內(nèi)含子的共同組裝過程第12頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月第二類內(nèi)含子

第二類內(nèi)含子的代表分子是酵母線粒體細(xì)胞色素氧化酶mRNA前體，真核snRNA前體。這兩類內(nèi)含子的區(qū)別在于第一類內(nèi)含子有一個(gè)由10-12個(gè)堿基的保守序列構(gòu)成的“中心核心結(jié)構(gòu)”（centralcorestructure），而第二類沒有。第13頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月第14頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月RNaseP

RNaseP是一種由RNA和蛋白質(zhì)構(gòu)成的復(fù)合體，其中的RNA是真正的活性中心，蛋白質(zhì)部分只是起支持結(jié)構(gòu)的功能。RNaseP是一種核酸內(nèi)切酶，它參與加工tRNA的初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，所有的tRNA5’末端都由該酶催化產(chǎn)生。第15頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月1.2小分子核酶小分子核酶比較常見的有4種，錘頭型、發(fā)夾型、HDV、VS核酶。目前，錘頭型和發(fā)夾型核酶是研究最多的。小分子核酶有一些共同的特征，首先與前面提及的大分子核酶相比較小，其次它們都天然的與其發(fā)生作用的RNA的復(fù)制過程有關(guān)，最后在各種情況下經(jīng)由它們產(chǎn)生的催化作用都將產(chǎn)生5-羥基末端和2，3-環(huán)狀磷酸基末端。另外其催化機(jī)理與其分子結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，金屬離子或特定堿基都可作為催化反應(yīng)的關(guān)鍵成分。第16頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月錘頭狀核酶

活性中心由11個(gè)保守的核苷酸和數(shù)目不等的非保守核苷酸序列組成，即：5’GAAA(N)nNUH(N)n，CUGA(N)nGA3’，它能結(jié)合含有NUH序列的底物RNA，其中N代表A、C、G，但更偏好G；H代表C、U、A，但更偏好C。在其活性中心兩端含有與底物RNA結(jié)合位點(diǎn)NUH兩側(cè)互補(bǔ)的序列(FigA)。第17頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月(A)Hammerheadribozyme第18頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月發(fā)夾狀核酶

發(fā)夾狀核酶(hairpinribozyme)是一種具有自剪切催化功能的小分子核糖核酸，是人們首次在煙草環(huán)斑病毒衛(wèi)星RNA(TobaccoringspotvirussatelliteRNA，sTRSV)的負(fù)鏈上發(fā)現(xiàn)的，因其活性中心的二級(jí)結(jié)構(gòu)形似發(fā)夾而得名。與其它類型的核酶相比，發(fā)夾狀核酶具有對(duì)金屬離子和酸堿度變化依賴小等特點(diǎn)，因此有很高的應(yīng)用價(jià)值。發(fā)夾狀核酶有多個(gè)螺旋區(qū)域，同樣與底物形成2個(gè)螺旋區(qū)(FigB)．第19頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月(B)Hairpinribozyme第20頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月2.脫氧核酶(deoxyribozyme，DRz)脫氧核酶DRz是利用體外分子進(jìn)化技術(shù)獲得的一種具有高效催化活性和結(jié)構(gòu)識(shí)別能力的單鏈DNA片段。DRz的活性部位能在原子水平上區(qū)分底物，并催化類似反應(yīng)。所有的DRz都是單鏈分子，如同單鏈RNA分子一樣，能進(jìn)行折疊、催化和展現(xiàn)酶活性。通過實(shí)驗(yàn)創(chuàng)造的DRZ連續(xù)被發(fā)現(xiàn)并且催化性能不斷提高。第21頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月自1994年首次發(fā)現(xiàn)脫氧核酶以來，迄今已發(fā)現(xiàn)的DRz有幾十種。根據(jù)其功能可分為7大類：1．具有RNA切割活性；2．具有DNA連接酶活性；3．具有卟啉金屬化酶和過氧化酶活性；4．具有DNA水解活性；5．具有DNA激酶活性；6．具有N2糖基化酶活性；7．具有DNA戴帽活性。但有類似催化活性的DRz在自然界中還沒找到。第22頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月在所有的DRz中，最特別的是具有RNA切割活性的DRZ，它能催化RNA特定部位的切割反應(yīng)，從mRNA水平對(duì)基因滅活，從而調(diào)控蛋白質(zhì)的表達(dá)，可能成為對(duì)抗病毒感染、腫瘤等疾病的新型基因治療藥物和基因功能研究、核酸突變分析等的新型核酸工具酶。目前發(fā)現(xiàn)多種此類DRz，最主要的2種是Santoro等從1014個(gè)隨機(jī)序列中通過體外PCR篩選法獲得的第10輪循環(huán)的第23個(gè)和第8輪循環(huán)的第17個(gè)克隆，分別命名為“10-23DRz”和“8-17DRz”，其中對(duì)10-23DRz家族的研究最深入。第23頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月10-23型脫氧核酶的結(jié)構(gòu)8-17型脫氧核酶的結(jié)構(gòu)第24頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月核酶的催化機(jī)制大型核酶的催化機(jī)制小型核酶的催化機(jī)制第25頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月大型核酶的催化機(jī)制第一類內(nèi)含子與第二類內(nèi)含子通過一種兩步反應(yīng)來切割初始轉(zhuǎn)錄物，進(jìn)而將外顯子連接起來，產(chǎn)生成熟的RNA。RNaseP是產(chǎn)生tRNA5’端的核酶，所有的tRNA5’端都由它產(chǎn)生。它們的催化反應(yīng)發(fā)生時(shí)都伴隨有磷酸基團(tuán)的變構(gòu)。第26頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月第一類內(nèi)含子的催化機(jī)制第一類內(nèi)含子的催化過程如下：第一步，鳥嘌呤單核苷酸的3’-OH進(jìn)攻切割位點(diǎn)的5’磷酸，產(chǎn)生游離的5’外顯子。這一步只能由鳥嘌呤核苷酸來催化，但可以是單核苷酸，也可以是二核苷酸或三核苷酸，這表明此反應(yīng)不需能量的介入；第二步，游離的5’外顯子的3’-OH進(jìn)攻3’切割位點(diǎn)的磷酸，兩個(gè)外顯子連接起來同時(shí)游離出帶有外來鳥嘌呤的內(nèi)含子。這兩步都是可逆的。內(nèi)部引導(dǎo)序列（IGS）可以與底物部分配對(duì)，進(jìn)而來定位切割位點(diǎn)。切割下來的內(nèi)含子又進(jìn)一步自身環(huán)化，去除一小段核苷酸，產(chǎn)生內(nèi)含子核心L-19。第27頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月第一類內(nèi)含子的自剪接反應(yīng)第28頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月第二類內(nèi)含子的催化機(jī)制第二類內(nèi)含子的催化過程如下：第一步，內(nèi)含子里面（與第一類內(nèi)含子不同）一個(gè)保守的腺嘌呤殘基的2’-OH進(jìn)攻5’磷酸，產(chǎn)生5’游離外顯子和由3’外顯子與內(nèi)含子構(gòu)成的中間體；第二步，5’游離外顯子的3’游離羥基進(jìn)攻3’切割位點(diǎn)的磷酸，兩個(gè)外顯子連接起來，并切割下內(nèi)含子。第29頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月RNaseP的催化機(jī)制RNaseP催化所有tRNA的5’末端的形成，但是由于tRNA的5’末端沒有保守序列，人們認(rèn)為RNaseP是通過識(shí)別底物的三級(jí)結(jié)構(gòu)來完成的。其催化反應(yīng)需要二價(jià)陽離子（如Mg2+或Mn2+）和一價(jià)陽離子（如k+或NH4+）的共同參與。其中一價(jià)離子在反應(yīng)中主要用來穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，而二價(jià)離子不僅對(duì)于穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，而且對(duì)于切割是必需的。在切割反應(yīng)中，金屬離子活化的氫氧根被用作親核試劑。第30頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月小型核酶的催化機(jī)制第31頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月錘頭型核酶的催化機(jī)理錘頭型核酶對(duì)切割位點(diǎn)的識(shí)別遵守NHH規(guī)則（N代表任意核苷酸，H代表A，U或C）。它的催化過程需要二價(jià)金屬離子（如鎂離子）的參與，人們提出兩種催化機(jī)理：?jiǎn)谓饘匐x子催化和雙金屬離子催化。第32頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月圖5錘頭型核酶兩種可能的催化機(jī)理（a）單金屬離子催化；（b）雙金屬離子催化

。單金屬離子催化機(jī)理如圖a，在這個(gè)模型中，金屬氫氧化物作為廣義堿從2’OH接受質(zhì)子?；罨?’氧作為親核試劑進(jìn)攻切割位點(diǎn)的磷酸。雙金屬離子機(jī)理如圖b。A位點(diǎn)的金屬離子作為路易斯酸（Lewisacid）接受2’氧的電子，使2’OH去質(zhì)子更容易。B位點(diǎn)的金屬離子也作為路易斯酸接受5’氧的電子，使O-P鍵極化且鍵合力減弱，從而使氧原子更容易游離出來。第33頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月HDV核酶的催化機(jī)理現(xiàn)在被普遍接受的催化機(jī)理如圖所示。在基態(tài)時(shí)金屬離子結(jié)合于切割位點(diǎn)處未成橋的氧原子上，但是在自切割過程中金屬離子脫離了與氧原子的直接聯(lián)系，轉(zhuǎn)而通過一種遠(yuǎn)距離的作用力與之作用。另外，底物的5’端序列對(duì)切割反應(yīng)有一定影響。HDV核酶可能的催化機(jī)理第34頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月發(fā)夾狀核酶的催化機(jī)理順式切割發(fā)夾型核酶的底物部分與核酶的其余部分是分離的，底物切割位點(diǎn)必須含有RYN*GUC這樣一個(gè)序列，R代表嘌呤核苷酸，Y代表嘧啶核苷酸，N可以是任何核苷酸。催化發(fā)生時(shí)，發(fā)夾型核酶通過反式轉(zhuǎn)酯反應(yīng)于圖（b）的箭頭處切割底物，產(chǎn)生5’-OH和2’，3’-環(huán)磷酸末端。第35頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月核酶的研究方法為了尋找新的和更高效的Rz和DRz，參照RNA分子進(jìn)化技術(shù)提出了Rz和DRz的離體篩選方法。目前，一般認(rèn)為Rz和DRz的篩選途徑有2種，一種是利用天然的RNA或DNA分子在體外篩選出具酶活性的RNA或DNA分子，另一種是通過人工合成并在體外篩選出具酶活性的小片段的RNA或DNA分子。但是第一種途徑，在篩選的過程中具有一定的不準(zhǔn)確性，通常不被采用，而第二種途徑的篩選過程無以上缺點(diǎn)，是一種被普遍采用的篩選途徑。自上世紀(jì)90年代初初步建立核酶體外篩選法（通常稱作SELEX法）以來，至今已利用這一方法制造出無數(shù)自然界尚未發(fā)現(xiàn)的核酶，以及脫氧核酶和RNA/DNA嵌合核酶。第36頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月SELEX技術(shù)SELEX技術(shù)即指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichment，SELEX)。利用該技術(shù)可以從隨機(jī)單鏈核酸序列庫(kù)中篩選出特異性與靶物質(zhì)高度親和的核酸適體(Aptamer)。第37頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月核酶的應(yīng)用前景和挑戰(zhàn)核酶是一類具有催化活性的小RNA分子，可以特異性地識(shí)別并結(jié)合目標(biāo)基因mRNA，使該mRNA斷裂失活，從而阻斷或降低目標(biāo)基因的表達(dá)，起到基因沉默的作用。此外，核酶不會(huì)對(duì)細(xì)胞基因組產(chǎn)生任何副作用，因此核酶作為一種既安全又有效的分子生物學(xué)工具受到越來越多研究者的關(guān)注。第38頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月核酶的應(yīng)用核酶在植物抗病毒領(lǐng)域的研究核酶在動(dòng)物疾病治療中的研究核酶在人類疾病治療中的研究第39頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月核酶在植物抗病毒領(lǐng)域的研究第40頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月抗煙草花葉病毒煙草花葉病毒（TMV）是分布廣泛、侵染性很強(qiáng)的一類植物病毒，能感染30個(gè)科中的199種植物，在我國(guó)嚴(yán)重危害煙草、蔬菜和花卉等植物。近年來，隨著人們對(duì)核酶研究的不斷深入，利用核酶進(jìn)行抗病毒研究已成為新的熱點(diǎn)。許多研究者根據(jù)煙草花葉病毒基因組的基本結(jié)構(gòu)，成功設(shè)計(jì)了針對(duì)TMV不同識(shí)別位點(diǎn)的核酶，取得令人興奮的成果。楊建華等（1998）將設(shè)計(jì)的特異切割煙草花葉病毒RNA的錘頭型核酶Rz-2轉(zhuǎn)化煙草原生質(zhì)體，通過檢測(cè)TMVc對(duì)煙草原生質(zhì)體的侵染性發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因原生質(zhì)體中TMV侵染性明顯低于未轉(zhuǎn)基因的對(duì)照組。第41頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月抗水稻條紋葉枯病毒水稻條紋葉枯病是水稻的主要病毒病害之一。我國(guó)從1964年第1次報(bào)道該病發(fā)生，至今多次暴發(fā)流行，對(duì)水稻生產(chǎn)構(gòu)成嚴(yán)重威脅。引起該病的水稻條紋葉枯病毒（Ricestripevirus，RSV），為一類特殊的單鏈、多組分RNA病毒。劉力等（1996）根據(jù)RSV序列，在分析其分子結(jié)構(gòu)及病理特性的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)合成了特異切割水稻條紋葉枯病毒RNA保守區(qū)及病害特異性蛋白（Diseasespecificprotein，DSP）基因的核酶，體外切割實(shí)驗(yàn)表明，所設(shè)計(jì)的核酶具有特異切割RSV病毒的活性。第42頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月抗馬鈴薯卷葉病毒馬鈴薯卷葉病毒（Potatoleafrollvirus，PLRV）是一種嚴(yán)格由蚜蟲以持久方式傳播的病毒，屬黃化病毒組（Luteovirus），可引起馬鈴薯植株黃化、矮縮、卷葉、僵化等癥狀。PLRV是單鏈正鏈RNA，在寄主細(xì)胞內(nèi)PLRV先轉(zhuǎn)錄成負(fù)鏈RNA，再以負(fù)鏈RNA為模板合成病毒正鏈RNA。1990年，LambJW等設(shè)計(jì)了2個(gè)針對(duì)PLRV正鏈RNA的核酶，能體外切割PLRV（英國(guó)蘇格蘭分離株）的CP基因和復(fù)制酶基因。第43頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月核酶在動(dòng)物疾病治療中的研究第44頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月核酶對(duì)動(dòng)物病毒病的治療ZOU等(2003)針對(duì)鵝副黏病毒F基因設(shè)計(jì)了錘頭狀核酶RzF598，并將該核酶基因連入真核表達(dá)載體pcDNA3上，然后用該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細(xì)胞，以pcDNA3空質(zhì)粒和無效突變體dRzF598重組質(zhì)粒作對(duì)照；結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染成功并表達(dá)了核酶RzF598的細(xì)胞對(duì)病毒的抵抗能力大大提高，細(xì)胞成活率高達(dá)80％以上，而對(duì)照組細(xì)胞的成活率僅5％左右。第45頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月核酶對(duì)動(dòng)物寄生蟲病的治療陳麗鳳等(2007)為研究犬賈第蟲滋養(yǎng)體核仁功能性蛋白KRRl對(duì)賈第蟲pre-RNA合成的影響，用犬賈第蟲病毒(Giardiacanisvirus，GCV)作為轉(zhuǎn)染載體，將兩端攜帶反義KRRl基因的錘頭狀核酶插入到載體中，構(gòu)建出兩種重組質(zhì)粒KRzS和KRzL；然后用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法檢測(cè)核酶對(duì)KRRl基因mRNA的切割活性；結(jié)果顯示KRzS、KRzL轉(zhuǎn)錄體對(duì)KRRl基因體外轉(zhuǎn)錄RNA切割效率分別為74.0％和81.1％，而對(duì)照組僅為12.0％，說明賈第蟲病毒介導(dǎo)的錘頭狀核酶能有效切割KRRl基因的體外轉(zhuǎn)錄體。第46頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月核酶在人類疾病治療中的研究第47頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月核酶對(duì)艾滋病的治療獲得性免疫缺陷綜合癥(acquiredimmunedeficiencysyndrome，AIDS)又稱艾滋病，是由人免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus，HIV)引起的，HIV主要攻擊T淋巴細(xì)胞，破壞機(jī)體的免疫系統(tǒng)，使抗病能力降低甚至喪失，最終導(dǎo)致死亡。HIV主要有2種類型：HIV-1和HIV-2，其中HIV-1是引起艾滋病的主要病原。因此，目前艾滋病的防治研究主要是針對(duì)HIV-1進(jìn)行的。迄今為止尚無一種十分有效的方法治療艾滋病，而核酶算是治療艾滋病的一種理想的基因治療藥物。第48頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月核酶對(duì)HIV-1的作用機(jī)制核酶可在HIV-1的識(shí)別、轉(zhuǎn)錄、翻譯及包裝等4個(gè)階段對(duì)HIV-1進(jìn)行切割：(1)切割HIV-1與宿主細(xì)胞識(shí)別結(jié)合階段所需輔助受體mRNA(CCR5mRNA和CCR5pre-mRNA)；(2)對(duì)病毒基因組RNA進(jìn)入靶細(xì)胞逆轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄時(shí)進(jìn)行切割；(3)病毒mRNA翻譯成病毒蛋白之前及翻譯階段對(duì)病毒mRNA進(jìn)行切割；(4)病毒基因組RNA進(jìn)入衣殼前，即包裝過程中進(jìn)行切割第49頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月第50頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月Wong-staal等(1998)利用一發(fā)卡型核酶抑制HIV-1基因表達(dá)，并率先進(jìn)入一斯臨床試驗(yàn)；用帶有發(fā)夾狀核酶的載體體外轉(zhuǎn)染患者的T細(xì)胞，然后再將這些T細(xì)胞重新輸入到患者體內(nèi)，結(jié)果顯示患者體內(nèi)HIV-1的滴度降低。在近期的二期臨床試驗(yàn)中，Mitsuyasu等(2009)用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將抗HIV核酶導(dǎo)入到造血干細(xì)胞中，然后將造血干細(xì)胞注入到74名感染HIV的患者體內(nèi)，結(jié)果有38名患者攜帶了該種療法所使用的完整拷貝。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CCR5(chemokine(c-cmotif)receptor5)是HIV-1R5毒株的重要細(xì)胞復(fù)合受體之一，該受體在HIV-1感染初期起著重要的作用，但是它的缺失對(duì)宿主而言是無關(guān)緊要的，因此CCR5可作為核酶切割的理想靶點(diǎn)。第51頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月核酶對(duì)乙型肝炎的治療乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus)屬嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)，是一種逆轉(zhuǎn)錄病毒；其生活史可簡(jiǎn)單概括為：HBV進(jìn)入肝細(xì)胞→在宿主酶作用下以負(fù)鏈DNA為模板合成正鏈DNA→形成共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)→在宿主RNA聚合酶Ⅱ作用下合成mRNA(亦稱前基因組RNA，pgRNA)→在HBV逆轉(zhuǎn)錄酶作用下合成負(fù)鏈DNA→在HBVDNA聚合酶作用下合成正鏈DNA→形成子代閉合環(huán)狀DNA。由于HBV的復(fù)制必須經(jīng)過RNA的過程，所以可設(shè)計(jì)特異性核酶用于切割RNA，從而阻斷HBV的復(fù)制過程。第52頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月Fritz等(1992)合成了針對(duì)HBVpgRNA的3個(gè)不同的核酶，來直接作用于經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄獲得的HBV的pgRNA，結(jié)果顯示這3個(gè)核酶都能準(zhǔn)確地切割底物RNA，表明HBVRNA易被核酶切割。Wang等(2010)在含有多聚人血清白蛋白(pHSA)及不含pHSA的情況下，將攜帶HDV核酶的helper-free重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)入人肝癌細(xì)胞中，結(jié)果顯示在pHSA存在的情況下，此種載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)能力高于不含pHSA時(shí)的轉(zhuǎn)導(dǎo)能力。而且，在含有pHSA的情況下HBsAg和HBeAg的水平明顯降低。該研究說明，攜帶有HDV核酶的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在以HepG2215為轉(zhuǎn)染目標(biāo)時(shí)具有特異性的HBV切割活性。第53頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月核酶的抗腫瘤作用多藥耐藥性(multidrugresistnce，MDR)是指腫瘤細(xì)胞對(duì)一種化療藥物表現(xiàn)出耐藥性，同時(shí)對(duì)其他許多結(jié)構(gòu)不同、作用靶點(diǎn)亦不相同的化療藥物也表現(xiàn)出交叉耐藥的現(xiàn)象，是通過化療藥物治療腫瘤急需突破的一大難題。第54頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月Hiroyuki(1993)設(shè)計(jì)了一個(gè)能特異性切割MBRlmRNA序列第179位密碼子的錘頭狀核酶，并在體外對(duì)MDRlmRNA進(jìn)行切割，結(jié)果顯示該錘頭狀核酶是一種潛在的有用工具，它可切割MDRlmRNA且使MDR恢復(fù)顯性。Gao等(2007)在體外成功地使重組人核酶的pEGFP-RZ-muc僅在乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)，而在非乳腺癌細(xì)胞中不表達(dá)；化學(xué)敏感性評(píng)估結(jié)果顯示在經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，對(duì)阿霉素的抗藥性降低了15倍，對(duì)長(zhǎng)春花堿的抗藥性降低了32倍，表明在體外培養(yǎng)的人乳腺癌細(xì)胞中pEGFP-RZmuc逆轉(zhuǎn)MDR是有效的且具有選擇性。第55頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月核酶研究存在的問題1.催化活性低

由于切割位點(diǎn)的單一，致使核酶切割效率較低。要使核酶發(fā)揮最佳的催化活性，必須解決時(shí)間和空間問題，既要使核酶在合適的時(shí)間表達(dá)，還要使核酶及其切割底物在細(xì)胞的某一特定空間相互作用。2.穩(wěn)定性差

核酶在體內(nèi)最終是以RNA分子的形式起作用，因此極易遭到細(xì)胞內(nèi)RNase的破壞。目前主要是通過化學(xué)修飾方法在核酶的骨架上添加基團(tuán)（如甲氧基、烯丙基等）來提高其穩(wěn)定性，而不影響其催化活性。第56頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月3.表達(dá)量不高

核酶的切割活性依賴高濃度的表達(dá)量，當(dāng)核酶表達(dá)量低時(shí)，不能達(dá)到有效的抗病效果。并且核酶的催化作用還依賴于病毒的滴度(鄒建，2003)。在病毒滴度低(4.5log10TCID50)的時(shí)候其切割活性明顯，病毒滴度較高(5.5log10TCID50)時(shí)，其切割活性顯著降低，這可能和反義RNA濃度有一定關(guān)系。第57頁，課件共5